Im lebenden Organismus Chronische Zwei-Photonen-Bildgebung von Mikroglia im Hippocampus der Maus

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur chronischen in vivo Beobachtung der ruhenden Mikroglia im Hippocampus CA1 der Maus mittels präzise kontrollierter Chirurgie und Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Zusammenfassung

Mikroglia, die einzigen Immunzellen, die im Gehirn ansässig sind, beteiligen sich aktiv an der Aufrechterhaltung neuronaler Schaltkreise, indem sie Synapsen und neuronale Erregbarkeit modifizieren. Neuere Studien haben die unterschiedliche Genexpression und funktionelle Heterogenität von Mikroglia in verschiedenen Hirnregionen aufgezeigt. Die einzigartigen Funktionen des neuronalen Netzwerks des Hippocampus beim Lernen und Gedächtnis könnten mit der aktiven Rolle von Mikroglia beim Synapsenumbau in Verbindung gebracht werden. Entzündungsreaktionen, die durch chirurgische Eingriffe induziert werden, waren jedoch bei der zweiphotonenmikroskopischen Analyse von Hippocampus-Mikroglia problematisch. In dieser Arbeit wird eine Methode vorgestellt, die die chronische Beobachtung von Mikroglia in allen Schichten des Hippocampus CA1 durch ein bildgebendes Fenster ermöglicht. Diese Methode ermöglicht die Analyse morphologischer Veränderungen in Mikrogliafortsätzen über einen Zeitraum von mehr als 1 Monat. Die langfristige und hochauflösende Bildgebung der ruhenden Mikroglia erfordert minimalinvasive chirurgische Eingriffe, eine geeignete Auswahl der Objektivlinse und optimierte bildgebende Verfahren. Die vorübergehende Entzündungsreaktion der Hippocampus-Mikroglia kann eine Bildgebung unmittelbar nach der Operation verhindern, aber die Mikroglia stellen ihre ruhende Morphologie innerhalb weniger Wochen wieder her. Darüber hinaus ermöglicht uns die gleichzeitige Abbildung von Neuronen mit Mikroglia, die Interaktionen mehrerer Zelltypen im Hippocampus zu analysieren. Diese Technik könnte wichtige Informationen über die Funktion der Mikroglia im Hippocampus liefern.

Einleitung

Mikroglia sind die einzigen Immunzellen und Gewebemakrophagen, die im Gehirn leben. Zusätzlich zu ihren Funktionen als Immunzellen, wie z. B. der schnellen Reaktion auf Entzündungen, haben sie eine Vielzahl von physiologischen Rollen bei der Aufrechterhaltung und dem Umbau neuronaler Schaltkreise gespielt, wie z. B. synaptisches Pruning, Regulierung der synaptischen Plastizität und Kontrolle der neuronalen Aktivität 1,2,3,4,5 . Physiologische Interaktionen zwischen Mikroglia und Neuronen sind sowohl für die Entwicklung neuronaler Schaltkreise als auch für die Neurobiologie von Krankheiten von zunehmendem Interesse. Die Analyse der Physiologie von Mikroglia in vivo erfordert Methoden, um Mikroglia ohne Gewebeschädigung und Entzündungsreaktionen zu beobachten. Mikroglia reagieren jedoch empfindlich auf Entzündungen und verändern ihre Form und Funktion als Reaktion auf Gewebeschäden dramatisch ^6,7.

Die Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung ist ein ideales Werkzeug, um die physiologische Dynamik von Mikroglia⁸ zu erfassen. Erste Anwendungen der in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung zeigten die dynamische Bewegung von Mikrogliafortsätzen zur Umweltüberwachung im adulten Mauskortex ^9,10. Die folgenden Zwei-Photonen-Bildgebungsstudien erweiterten das in vivo Monitoring von Mikroglia zur Analyse funktioneller und struktureller Interaktionen mit Neuronen 5,11,12,13,14. Die Abbildungstiefe der konventionellen Zwei-Photonen-Mikroskopie ist jedoch auf weniger als 1 mm von der Gehirnoberfläche begrenzt^15,16. Diese Einschränkung erklärt die Seltenheit früherer Studien, die über das Verhalten von Mikroglia in tiefen Hirnregionen, wie dem Hippocampus, berichteten.

Neuere RNA-Sequenzierungsstudien haben eine beträchtliche regionale Heterogenität der Mikroglia gezeigt, was die Möglichkeit unterschiedlicher funktioneller Rollen erhöht 17,18,19,20,21. Daher ist es notwendig, die Interaktionen der Mikroglia mit Neuronen in verschiedenen Hirnregionen aufzuzeichnen, aber technische Schwierigkeiten haben solche Studien behindert. Insbesondere wurde berichtet, dass die aktive Beteiligung der Mikroglia am Synapsenumbau entscheidend für die Entwicklung des neuronalen Netzwerks des Hippocampus und seiner gedächtnisbezogenen Funktionen ist^22,23. Effektive Methoden zur Beobachtung unangefochtener Hippocampus-Mikroglia in vivo waren jedoch nicht verfügbar.

Dieses Protokoll erläutert die Verfahren zur chronischen in vivo Beobachtung ruhender Mikroglia im CA1 des dorsalen Hippocampus mit Hilfe genau kontrollierter Operationstechniken. Die Zwei-Photonen-Bildgebung des CA1-Areals in CX3CR1-GFP-Mäusen (CX3CR1+/GFP), die ^GFP in Mikroglia²⁴ exprimieren, ermöglichte die Beobachtung der verzweigten Mikroglia in allen Schichten des CA1 mit ausreichender Auflösung. Das Protokoll enthält mehrere Tipps für eine erfolgreiche Implantation des Beobachtungsfensters und geeignete Bildgebungsbedingungen. Darüber hinaus wird die simultane Visualisierung von Pyramidenneuronen und Mikroglia im CA1 als Anwendungsbeispiel vorgestellt. Die Vorteile, Grenzen und Potenziale dieser Technik werden ebenfalls diskutiert.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des Animal Ethics Committee und des Genetic Recombinant Experiment Safety Committee der Universität Tokio genehmigt und durchgeführt. In den Experimenten wurden sowohl männliche als auch weibliche CX3CR1-GFP-Mäuse im Alter von 2-4 Monaten verwendet. Für die Sicherheit der Experimentatoren und die Aufrechterhaltung steriler Bedingungen wurden alle Verfahren mit weißen Kitteln, Masken und sterilen Handschuhen durchgeführt. Alle Instrumente wurden vor der Verwendung sterilisiert.

1. Präparation von Instrumenten und Tieren

1. Montieren Sie ein Metallrohr mit Glasboden (Abbildung 1A).
   1. Tragen Sie einen kleinen Tropfen UV-härtenden optischen Klebstoffs auf ein Ende eines speziell angefertigten Edelstahlrohrs auf (Außendurchmesser 3,0 mm, Innendurchmesser 2,8 mm, Höhe 1,7 mm). Verteilen Sie den Kleber gleichmäßig auf der kreisförmigen Kante der Tube.
      Anmerkungen: Es sollte eine ausreichende Menge Klebstoff verwendet werden, um den gesamten Rand der Tube zu bedecken.
   2. Legen Sie ein rundes Glasdeckglas (3,0 mm Durchmesser, 0,15 ± 0,02 mm Dicke) auf das mit Klebstoff bedeckte Ende des Metallrohrs und drücken Sie das Deckglas leicht gegen das Rohr, so dass der Spalt zwischen Rohr und Glas mit dem Kleber gefüllt wird. Passen Sie als Nächstes die Position des Glases so an, dass es in die Außenkante des Metallrohrs passt.
   3. Bestrahlen Sie das Glas ausreichend lange mit UV-Licht, um den Klebstoff auszuhärten.
      Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass das Glas und das Rohr vollständig befestigt sind. Wenn die Adhäsion nicht ausreicht, kann sich das Glas nach der Operation lösen, was zu einer erfolglosen Bildgebung oder zum Austritt von Liquor cerebrospinalis (CSF) führt.
   4. Desinfizieren Sie das zusammengebaute Metallrohr mit Glasboden mit 70 % Ethanol und waschen Sie es mit steriler Kochsalzlösung, um Schmutz zu entfernen.
2. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit einem Sterilisator mit trockener Hitze.
3. Bereiten Sie Mäuse auf die Operation der Fensterimplantation vor.
   HINWEIS: Mäuse sollten im entsprechenden Alter sein. Es ist vorzuziehen, dass sie genetisch so verändert sind, dass sie fluoreszierende Proteine im CA1 und im Gyrus dentatus (DG) exprimieren. Diese Punkte werden im Abschnitt "Diskussion" näher erläutert.

2. Anästhesie und Kopffixierung

1. Betäubung einer Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin-Xylazin (100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin). Meloxicam (2 mg/kg) als subkutane Injektion zur präoperativen Analgesie verabreichen. Bestätigen Sie das Verschwinden der Reaktion auf schmerzhafte Reize, wie z. B. das Kneifen des Schwanzes, um eine ausreichende Anästhesietiefe zu gewährleisten. Fügen Sie jedes Mal, wenn die Anästhesie während der Operation nachlässt, eine halbe Dosis Ketamin-Xylazin hinzu, typischerweise 1 Stunde nach der ersten Verabreichung und danach alle 30 Minuten. Verwenden Sie ein Heizkissen unter dem Körper, um die Wärme zu unterstützen, und tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.
   HINWEIS: Die Wahl der Anästhesie für die Operation ist von entscheidender Bedeutung. Dieser Punkt wird im Abschnitt "Diskussion" ausführlich behandelt.
2. Tragen Sie eine Enthaarungscreme auf, um Haare von der Kopfhaut zu entfernen. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mehrmals in kreisenden Bewegungen mit einem Povidon-Jod-Peeling, gefolgt von Alkohol. Legen Sie die Maus auf die chirurgische Plattform, die mit einem sterilen, wasserdichten Pad vorbereitet ist, und legen Sie sterile Abdeckungen an, um die Operationsstelle zu sichern. Schneiden und entfernen Sie dann die Kopfhaut kreisförmig mit einem Skalpell, so dass das Parietal- und das Hinterhauptbein auf der operativen Seite vollständig freiliegen.
3. Entfernen Sie das subkutane Bindegewebe, indem Sie es mit einem Wattestäbchen abreiben, während Sie sterile Kochsalzlösung auftragen, um die Blutung zu beseitigen. Kratzen Sie die Schädeloberfläche vorsichtig mit einem Miniaturmesser mit runder Spitze ab, um die Knochenhaut zu entfernen, was dazu beiträgt, die Haftung zwischen Zement und Knochen zu verstärken (siehe Schritt 2.6).
4. Tragen Sie das Zahnätzmaterial auf die gesamte Oberfläche auf, warten Sie einige Sekunden und spülen Sie es mit ausreichend steriler Kochsalzlösung ab.
5. Markieren Sie mit wasserfester Tinte den Bereich des Knochens, der entfernt werden soll (ein kreisförmiger Bereich mit einem Durchmesser von 3,0 mm, zentriert etwa 2,5 mm posterior und 2,5 mm seitlich des Bregmas). Trocknen Sie die Schädeloberfläche nach dem Markieren gründlich ab.
   HINWEIS: Die Position der Kraniotomie hängt von der Größe des Hippocampus ab und sollte für verschiedene Altersgruppen optimiert werden. Nützliche Indikatoren für die Position der Kraniotomie werden im Folgenden vorgestellt (siehe Schritt 3.4.5, ANMERKUNG).
6. Befestigen Sie die rechteckige Aluminiumplatte mit einer Dicke von 1,0 mm und einem Loch von 5,0 mm Durchmesser in der Mitte mit Zahnharzzement gemäß den Anweisungen des Herstellers am Schädel.
   1. Richten Sie das Loch in der Mitte der Platte vorsichtig mit dem mit einem Stift markierten kreisförmigen Bereich aus (siehe Schritt 2.5), so dass die Aluminiumplatte parallel zur markierten Oberfläche des Schädels verläuft (Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, dass der Zement alle Lücken zwischen der Platte und dem Knochen dicht abdichtet. Warten Sie ca. 5 Minuten, bis der Zement ausreichend ausgehärtet ist.
7. Setzen Sie die Maus über die angebrachte Platte auf die Kopfhaltevorrichtung mit Winkelverstellung.

3. Implantation des Beobachtungsfensters

HINWEIS: Die folgenden chirurgischen Eingriffe sollten unter einem Stereomikroskop durchgeführt werden.

1. Machen Sie mit einem Hautstanzer mit einem Durchmesser von 3,0 mm eine kreisförmige Rille in den Schädel. Richten Sie die kreisförmige Nut und den in Schritt 2.5 markierten Bereich mit einem Stift aus. Drehen Sie den Dermalstempel mit leichtem Druck, so dass die Rillentiefe allmählich zunimmt. Überprüfen Sie häufig, ob die Nuttiefe über den gesamten Umfang konstant ist.
2. Wenn der Hautstanz die innerste Schicht des Schädels erreicht, heben Sie die zentrale Knocheninsel vorsichtig mit einer 30-G-Nadel an, bevor Sie die darunter liegende Dura berühren.
   Anmerkungen: Leichtes Austreten von Flüssigkeit aus dem Boden der Nut weist darauf hin, dass sich die Rille in der Nähe der Dura befindet.
3. Entfernen Sie die Dura mit einem Dura-Picker.
   HINWEIS: Die vollständige Entfernung der Dura innerhalb des Schädelfensters ist notwendig und erfordert eine sorgfältige Resektion der Restdura an der Peripherie mit einer feinen Pinzette.
4. Saugen Sie das Gewebe vorsichtig ab, um den Alveus des Hippocampus freizulegen, indem Sie 23 g oder 25 g stumpfe Nadeln verwenden, die mit dem Absauger verbunden sind.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist der wichtigste für eine erfolgreiche Bildgebung. Die wichtigsten technischen Punkte für die Gewebeaspiration werden im Abschnitt "Diskussion" ausführlich beschrieben.
   1. Saugen Sie die Pia und die Pialgefäße ab.
   2. Saugen Sie das kortikale Gewebe von der Oberfläche ab. Halten Sie die Tiefe der freiliegenden Gewebeoberfläche über das gesamte Schädelfenster homogen. Vertiefen Sie die Aspiration allmählich, bis Fasern der äußeren Kapsel freigelegt sind.
   3. Positionieren Sie die Saugspitze vorsichtig an der äußeren Kapsel in der Nähe des lateralen Ventrikels (LV), der sich am rostrolateralen Ende des Schädelfensters befindet. Entfernen Sie die Oberflächenschicht der äußeren Kapsel, die in kaudomedialer bis rostrolateraler Richtung verläuft, und dann die innere Schicht, die in mediolateraler Richtung verläuft.
      Anmerkungen: Die externe Kapsel in der Nähe des LV kann leicht von der darunter liegenden Struktur entfernt werden.
   4. Bestätigen Sie die Entfernung der gesamten äußeren Kapsel, indem Sie die vollständige Freilegung der Alveusoberfläche und der dorsalen Hippocampuskommissur (DHC) überprüfen.
      HINWEIS: Der DHC deckt den kaudomedialen Teil des CA1 ab. Der Alveus und der DHC können durch ihre Faserorientierung von der äußeren Kapsel unterschieden werden. Die Fasern innerhalb der Alveus und der DHC verlaufen nämlich in rostromedialer bis kaudolateraler Richtung und können von den Fasern in der äußeren Kapsel unterschieden werden. Der Alveus und der DHC sind fest mit dem CA1 verbunden und sollten nicht beschädigt werden. Alle Fragmente der äußeren Kapsel sollten entfernt werden, da verbleibende Fragmente den direkten Kontakt des Glasdeckglases mit der Alveus verhindern.
   5. Vergewissern Sie sich, dass die Blutung vollständig aufgehört hat, und füllen Sie das Loch bis zur Höhe der Schädeloberfläche mit steriler Kochsalzlösung.
      HINWEIS: Das Sichtfeld hilft hier zu beurteilen, ob sich das Loch in der richtigen Position für das spezifische Alter der Maus befindet. Idealerweise sollten der Alveus und der darunterliegende CA1 den größten Teil des zentralen Bereichs einnehmen. Ein Teil des DHC ist im Bereich des Caudomedialis sichtbar. Die Öffnung der LV ist am rostrolateralen Rand erkennbar (Abbildung 3A).
5. Führen Sie das Metallrohr mit Glasboden (siehe Schritt 1.1) senkrecht in das Loch ein, während Sie das überschüssige Wasser, das von den Seiten des Rohrs überläuft, ansaugen, bis der Glasboden leicht gegen die Alveus drückt und das darunter liegende CA1 teilweise abflacht.
   Anmerkungen: Dieser Druck muss entsprechend eingestellt werden. Wenn es zu stark ist, wird der CA1 beschädigt. Ist sie zu schwach, beeinträchtigt die sphärische Aberration aufgrund der Krümmung des CA1 die Bildauflösung in tiefen Strukturen.
6. Befestigen Sie die Wand des eingesetzten Schlauchs mit Zahnharzzement am umgebenden Schädel (Abbildung 1C). Stellen Sie sicher, dass der gesamte Umfang dicht verschlossen ist und dass keine Luft oder Liquor austritt. Warten Sie ca. 5 Minuten, bis der Zement ausgehärtet ist.
   Anmerkungen: Wenn der Zement bei niedriger Viskosität aufgetragen wird, kann er durch den Spalt zwischen dem Schlauch und dem Schädel in das Hirnparenchym eindringen und das Gehirn schädigen. Daher sollte der Zement nach dem Einleiten der Polymerisation aufgetragen werden, was die Viskosität erhöht und die Leckage durch den Spalt verringert.
7. Waschen Sie die gesamte Platte, den Schädel und die Innenseite des Röhrchens mit steriler Kochsalzlösung, um Schmutz zu entfernen.

4. Zwei-Photonen-Mikroskopie unmittelbar nach der Operation zur Qualitätskontrolle der Operation

1. Setzen Sie die Maus in die Kopfhaltevorrichtung unter die Objektivlinse des Zwei-Photonen-Mikroskops und auf den motorisierten XY-Scantisch. Verwenden Sie ein Heizkissen zur thermischen Unterstützung. Überwachen und passen Sie die Anästhesietiefe wie in Schritt 2.1 beschrieben an, da diese Qualitätsprüfung bis zu 30 Minuten dauern kann.
   HINWEIS: Das Wasserimmersionsobjektiv mit einem Arbeitsabstand (WD) von mehr als 3 mm und einer hohen numerischen Apertur (NA) wird empfohlen. Ein Korrekturring der Objektivlinse kann die Auflösung verbessern, indem er die Brechungsindex-Fehlanpassung zwischen dem Glas und den Biomaterialien ausgleicht.
2. Füllen Sie den Raum zwischen Glas und Objektiv mit Wasser und achten Sie besonders darauf, Luftblasen zu vermeiden. Erweitern Sie bei Bedarf die Fläche der Metallplatte mit einer Kunststofffolie, die mehr Wasser fasst, um die gesamte Frontlinse des Objektivs abzudecken.
3. Schalten Sie einen gepulsten Femtosekundenlaser mit einer Wellenlänge von 920 nm zur Anregung der im Gehirn exprimierten Fluoreszenzsonden ein und starten Sie die Bilderfassungssoftware.
4. Stellen Sie den Fokus mithilfe des motorisierten Tisches und des motorisierten Fokussystems auf den CA1 ein. Positionieren Sie die Zielstruktur unter Führung der vom Hirnparenchym emittierten Fluoreszenz und des vom Rand des Metallrohrs reflektierten Lichts unter kontinuierlicher Beleuchtung durch den gepulsten Laser.
5. Messen Sie die Tiefe des Hirnparenchyms, das den Glasboden berührt, indem Sie den Fokus mit dem motorisierten Fokussystem einstellen. Vergleichen Sie die Tiefen an verschiedenen horizontalen Stellen, um die Ausrichtung des Glasbodens und der Abbildungsebene zu beurteilen.
   1. Passen Sie den Winkel des Mauskopfes an, indem Sie die Kopfhaltevorrichtung neigen, bis der Glasboden parallel zur Bildebene eingestellt ist.
6. Passen Sie den Korrekturring des Objektivs an, um die höchste Auflösung in der Tiefe der Zielstruktur im CA1 zu erreichen.
7. Vergewissern Sie sich, dass die fluoreszierenden Zellen in der molekularen Schicht (ML) der DG-Oberklinge in einer Tiefe von 500 μm vom Glasboden im gesamten Sichtfeld abgebildet werden können.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um die Qualität der Operation zu beurteilen. Ist das CA1 beschädigt, verhindert ein fokales Hirnödem die Fluoreszenzdetektion in einer Tiefe von mehr als 200 μm von der Oberfläche. Nur wenn das CA1 nicht beschädigt ist und die Krümmung der CA1-Schichten durch das darüber liegende Deckglas richtig abgeflacht ist, können die DG-Signale sofort nach der Operation erkannt werden (Abbildung 2A-D). Der Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" bietet eine einfache Möglichkeit, die Grenze zwischen dem CA1 und dem DG zu bestimmen.

5. Nachsorge

1. Saugen Sie das Wasser im Inneren des Rohrs ab und decken Sie es mit einer Kunststoffdichtung ab, um das Eindringen von Schmutz zu verhindern.
2. Halten Sie die Maus warm und warten Sie, bis Sie sich von der Narkose erholt haben.
3. Meloxicam (2 mg/kg) wird alle 24 h subkutan verabreicht, solange die Maus schmerzbezogenes Verhalten zeigt.
4. Die postoperative Maus wird für mehrere Wochen in Einzelhaltung aufgezogen.

6. In vivo chronische Zwei-Photonen-Bildgebung von Mikroglia mit CX3CR1-GFP-Mäusen

1. Waschen Sie nach der Einleitung der Anästhesie das Innere des Metallrohrs mit steriler Kochsalzlösung, um Schmutz zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die weiße Alveus des Hippocampus durch das Glas sichtbar ist (Abbildung 3A) und es keine Komplikationen wie postoperative Blutungen gibt.
2. Setzen Sie die Maus unter das Zwei-Photonen-Mikroskop und befolgen Sie die Schritte 4.1 bis 4.6.
3. Überprüfen Sie die Qualität und Intensität von Bildern, die durch Zwei-Photonen-Anregung des Hippocampus aufgenommen wurden (Abbildung 3B). Stellen Sie sicher, dass die Bilder, die nach der Reduktion des postoperativen Ödems aufgenommen werden, mit denen am Tag der Operation vergleichbar oder besser sind (Abbildung 2A, siehe Schritt 4.5).
   HINWEIS: Eine Verschlechterung des Bildes weist auf das Vorhandensein von Gewebeschäden im Gehirn hin.
4. Stellen Sie sicher, dass die Mikroglia ihre verzweigte Morphologie bereits wiedererlangt haben (Abbildung 3C).
   HINWEIS: Die Bildgebungsdaten der Mikroglia deuten darauf hin, dass es mindestens 3-4 Wochen dauert, bis die Mikroglia in ihren Basalzustand zurückkehren.
5. Führen Sie In-vivo-Bildgebung in beliebigen Schichten des CA1 für den speziellen Zweck des Experiments durch.

Ergebnisse

Mit dieser Technik können die verzweigten und ruhenden Mikroglia in allen Schichten des dorsalen CA1, einschließlich Stratum oriens (SO), Stratum pyramidale (SP), Stratum radiatum (SR) und Stratum lacunosum-moleculare (SLM), chronisch beobachtet werden, insbesondere 3-4 Wochen nach der Operation, wenn die Entzündung abklingt. Wenn die Operation angemessen durchgeführt wird, kann die Bildgebung bis zu mehreren Monaten nach der Operation durchgeführt werden. Dieser Abschnitt enthält drei Themen, die für die Beurteilung der intravitalen Bildgebung nützlich sind. Zunächst werden Musterbilder unmittelbar nach der Operation und in der chronischen Phase als Referenz für geeignete chirurgische und bildgebende Verfahren zur Verfügung gestellt. Zweitens werden die unterschiedliche Morphologie der Mikroglia, ihre Fluoreszenzintensität und die Verteilung der Blutgefäße in bestimmten Hippocampusschichten beschrieben, um den Lesern zu helfen, die Abbildungstiefe vom Alveus bis zum DG abzuschätzen. Drittens wird ein Anwendungsbeispiel gegeben, das die simultane Bildgebung von Neuronen und Mikroglia veranschaulicht.

Die repräsentativen Bilder der Mikroglia in CX3CR1-GFP-Mäusen unmittelbar nach der Operation sind in Abbildung 2 dargestellt. Wenn das CA1 nicht offensichtlich beschädigt ist und die Krümmung der CA1-Schichten durch das darüber liegende Deckglas richtig abgeflacht ist, übersteigt die Zwei-Photonen-Bildgebungstiefe der Mikroglia die gesamten CA1-Schichten und erreicht 500 μm von der Operationsoberfläche, wo die ML oder die Körnerzellschicht (GCL) des DG vorhanden ist (Abbildung 2A; siehe Schritt 4.7 und Abbildung 4E). Mikroglia sind vor allem in der Schicht nahe der Operationsfläche etwas weniger verzweigt als im intakten Hippocampus. Dennoch zeigen sie keine auffällige Aktivierung, was auf ein angemessenes chirurgisches Vorgehen hindeutet (Abbildung 2B). Auf der anderen Seite begrenzen Ödeme im CA1, die durch Gewebeschäden induziert werden, die Bildgebungstiefe auf 200 μm (Abbildung 2C). Gewebeschäden induzieren auch eine abnorme Mikrogliaaktivierung, wie z. B. eine Anhäufung von Vorwölbungsprozessen in Richtung der freien Gewebeoberfläche (Abbildung 2D; vgl. das obere Bild in Abbildung 2B). Dies sind Anzeichen für eine unsachgemäße Operation.

Die repräsentativen Bilder der Mikroglia in der chronischen Phase mehr als 3 Wochen nach der Operation sind in Abbildung 3 dargestellt. Mikroglia können über die CA1 hinaus bis in die tieferen Schichten der DG mit höherer Fluoreszenzintensität und -auflösung und mit homogenerer Verteilung wieder abgebildet werden (siehe Schritt 6.3, Abbildung 3B). Die Bildqualität ist besser als unmittelbar nach der Operation (Abbildung 2A). Dieser Unterschied kann durch reduzierte Ödeme und Entzündungen erklärt werden. Die Mikroglia in allen Schichten haben bereits ihre verzweigte Morphologie wiederhergestellt (Abbildung 3C), die sich von ihrem postoperativen Erscheinungsbild unterscheidet (Abbildung 2B). Zeitrafferaufnahmen von Mikroglia im CA1 zeigen die unbeweglichen Zellkörper und hochbeweglichen Prozesse für die Überwachung (Video 1-2). Ihr bewegliches Verhalten ähnelt dem vorangegangenen Bericht über die Prozessdynamik der Mikroglia im Kortex⁹.

Es ist einfach, die abgebildeten Hippocampus-Schichten basierend auf der Verteilung und der Tiefe neuronaler Zellkörper zu spezifizieren, indem Mäuse verwendet werden, die fluoreszierende Sonden in den Hippocampus-Neuronen exprimieren^25,26,27. Ohne die Hilfe der Positionsinformationen über die Zellkörper der Nervenzellen liefern allein die Signale der fluoreszierenden Mikroglia einige Hinweise auf die Identifizierung von Hippocampusschichten (Abbildung 3B). Mikroglia in der Alveus haben verlängerte Zellkörper und Fortsätze, die sich tendenziell entlang der axonalen Bahnen erstrecken (Abbildung 4A). Mikroglia in anderen Schichten unterscheiden sich durch ihre runden Zellkörper und Fortsätze, die ohne Vorzugsrichtungen strahlen. Mikroglia in SP gehören zu den dicht gepackten pyramidalen Neuronen und lassen sich durch die geringere Dichte der Mikrogliafortsätze unterscheiden. Die Schichten oberhalb und unterhalb von SP werden als SO bzw. SR bezeichnet (Abbildung 4B). Es ist unmöglich, zwischen SR und SLM allein anhand der Eigenschaften der Mikroglia zu unterscheiden. Die Grenze zwischen dem CA1 und dem DG wird durch dicke Blutgefäße erkannt, die entlang der Grenze verlaufen (Abbildung 4C). Diese Gefäße können besser erkannt werden, indem Gefäße mit Farbstoffen wie Sulforhodamin 101 (SR101; 5 mM, 4 μL/g Körpergewicht) markiert werden, die intraperitoneal injiziert werden (Abbildung 4D). Das Fluoreszenzsignal der Mikroglia fällt in der DG im Vergleich zum darüber liegenden CA1 stark ab, was wahrscheinlich auf den unterschiedlichen Brechungsindex dieser Strukturen zurückzuführen ist. Diese Lücke in der Fluoreszenzintensität kann auch dazu beitragen, die Grenze zwischen DG und CA1 zu bestimmen. Als Anwendungsbeispiel wird die simultane Bildgebung von GFP-positiven Mikroglia und tdTomato-markierten Pyramidenneuronen gezeigt (Abbildung 4E). In diesem Experiment erhielten CX3CR1-GFP-Mäuse eine Injektion des Adeno-assoziierten Virus (AAV) für die Expression von tdTomato in den hippokampalen Pyramidenneuronen. Die neuronale Markierung wird helfen, die genauen Schichtstrukturen des CA1 zu verstehen.

Abbildung 1: Schematische Zeichnungen für die Implantation des Beobachtungsfensters . (A) Querschnitt durch das zusammengesetzte Metallrohr mit Glasboden. Ein kreisförmiges Glasdeckglas haftet an einem Ende des zylindrischen Edelstahlrohrs. (B) Querschnittsansicht der am Schädel befestigten Aluminiumplatte. Die Platte sollte parallel zur markierten Oberfläche des Schädels sein, um die Objektivlinse nicht zu stören, die zum Fokussieren in der Nähe der Platte positioniert ist. (C) Querschnittsansicht des implantierten Tubus. Der Glasboden sollte eng mit dem Alveus des Hippocampus verbunden sein, um die Oberfläche des CA1 sanft anzudrücken und abzuflachen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: In-vivo-Bildgebung von Mikroglia in CX3CR1-GFP-Mäusen unmittelbar nach der Operation. (A) Repräsentative 3D-Rekonstruktion aus der in vivo CA1-Bildgebung einer CX3CR1-GFP-Maus am postoperativen Tag (POD) 0 (Breite: 511 μm, Höhe: 511 μm, Tiefe: 550 μm). Die fluoreszierenden Mikroglia im ML der DG in einer Tiefe von 500 μm vom Glasboden können durch das gesamte CA1 abgebildet werden. (B) Typische GFP-gefüllte Mikroglia, die in (A) erhalten wurden, sind als maximale Intensitätsprojektionen (MIPs) von Bildstapeln mit einer Dicke von 20 μm in Tiefen von 100, 300 und 520 μm vom Glasboden dargestellt. Die Morphologie der Mikroglia ist vom oberflächlichen CA1 bis zum ML der DG nachweisbar, allerdings mit einer offensichtlichen Verschlechterung des Bildes in der DG. Mikroglia, vor allem in der Schicht nahe der Operationsfläche, sind weniger verzweigt, zeigen aber keine offensichtliche Aktivierung. Maßstabsbalken, 50 μm. (C) Repräsentative 3D-Bildrekonstruktion des operativ geschädigten CA1. Die Daten wurden von einer CX3CR1-GFP-Maus am POD 0 (Breite: 399 μm, Höhe: 399 μm, Tiefe: 450 μm) aufgenommen. Die Fluoreszenz der Mikroglia ist nur bis zu einer Tiefe von 200 μm nachweisbar, im Gegensatz zum unbeschädigten CA1 (A) mit fluoreszierenden Mikroglia, die in einer Tiefe von 500 μm detektiert werden. (D) Das typische Bild der abnorm aktivierten Mikroglia in (C). Der MIP von GFP-Bildstapeln mit einer Dicke von 20 μm in einer Tiefe von 60 μm zeigt mikrogliale Wölbungsprozesse, die sich in Richtung der chirurgisch exponierten Gewebeoberfläche erstrecken. Die gesamte Morphologie der Mikroglia unterscheidet sich von der in (B) gezeigten Abbildung. Maßstabsleiste, 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: In-vivo-Bildgebung von Mikroglia in CX3CR1-GFP-Mäusen in der chronischen Phase. (A) Das repräsentative Erscheinungsbild des implantierten Fensters auf dem rechten dorsalen CA1 in der chronischen Phase. Durch den Glasboden sind die weißen Fasern der Alveus deutlich zu erkennen, ohne dass es zu Nachblutungen kommt. Die DHC und die LV sind teilweise im kaudomelialen Bereich bzw. am rostrolateralen Rand sichtbar. Maßstabsleiste, 1 mm. (B) Repräsentative 3D-Rekonstruktion aus der in vivo chronischen CA1-Bildgebung einer CX3CR1-GFP-Maus auf POD 24 (Breite: 511 μm, Höhe: 511 μm, Tiefe: 670 μm). Im Vergleich zu den Bildern unmittelbar nach der Operation (Abbildung 2A) zeigen die Mikroglia eine homogenere Verteilung und sind in den tieferen Schichten der DG aufgrund der Reduktion von Ödemen und Entzündungen deutlicher zu beobachten. (C) Typische Bilder von Mikroglia aus (B) mit vollständig restaurierter verzweigter Morphologie werden als MIPs von GFP-Bildstapeln mit einer Dicke von 20 μm in Tiefen von 100, 280 und 500 μm von der Operationsoberfläche gezeigt. Maßstabsleisten, 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Hinweise zur Identifizierung der einzelnen Schichten des Hippocampus während der In-vivo-Bildgebung und ein Anwendungsbeispiel dieser Methode. (A) Das typische Bild von Mikroglia im Alveus von CX3CR1-GFP-Mäusen in der chronischen Phase. Mikrogliazellkörper und Fortsätze, die sich entlang der axonalen Bahnen erstrecken, sind im MIP von GFP-Bildstapeln mit einer Dicke von 10 μm in einer Tiefe von 15 μm dargestellt. Maßstabsleiste, 50 μm. (B) Repräsentative Bilder von Mikroglia in SO, SP und SR in der chronischen Phase, dargestellt als MIP von GFP-Bildstapeln mit 5 μm Dicke. Die lokale Dichte der Mikrogliafortsätze ist in SP geringer als in umgebenden SO oder SR, was auf die dicht gepackten pyramidalen Neuronen in SP zurückzuführen ist. Maßstabsbalken, 100 μm. (C) Die dicken Blutgefäße, die entlang der Grenze zwischen dem CA1 und dem DG verlaufen, können nur durch die Mikrogliafluoreszenz erkannt werden. Gezeigt wird die mittlere Intensitätsprojektion von gekachelten GFP-Bildstapeln mit 90 μm Dicke in der chronischen Phase in einer Tiefe von etwa 500 μm. Die Leere des GFP-Signals entspricht den dicken Gefäßen. Maßstabsleiste, 500 μm. (D) (oben) Das Bild des gleichen Gesichtsfeldes wie C nach intraperitonealer Injektion von SR101. Maßstabsleiste, 500 μm. (unten) 3D-Rekonstruktion der Kachelbilder nach SR101-Injektion (Breite: 2,60 mm, Höhe: 1,73 mm, Tiefe: 0,69 mm). Die dicken Gefäße, die entlang der Grenze zwischen dem CA1 und dem DG verlaufen, sind durch die intravaskuläre SR101-Fluoreszenz leicht zu erkennen. (E) (Links) 3D-Rekonstruktion des CA1 und des DG (Breite: 255 μm, Höhe: 255 μm, Tiefe: 730 μm) und (rechts) der MIP von GFP und tdTomato-Fluoreszenz in SP aus Bildstapeln mit 20 μm Dicke. 1 Woche vor der Operation wurden 1,5 μl einer Mischung aus AAV1-CAG-FLEX-tdTomato (5,0 x 10 12 vg/ml) und AAV1-hSyn-Cre (1,0 x^{10 9} vg/ml) in den Hippocampus einer CX3CR1-GFP-Maus injiziert, um die Neuronen spärlich zu markieren. Die Bildgebung wurde am POD 0 durchgeführt. SP und GCL sind leicht an der Position der neuronalen Zellkörper zu erkennen. Maßstabsleiste, 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Video 1: Zeitrafferaufnahme von SO-Mikroglia in der chronischen Phase. Der MIP des GFP-Bildes stapelt sich mit einer Dicke von 20 μm in der Zeitrafferaufnahme von SO-Mikroglia, animiert, so dass 28 Minuten in 1 Sekunde abgespielt werden. Maßstabsleiste, 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: Zeitrafferaufnahme von SR-Mikroglia in der chronischen Phase. Der MIP des GFP-Bildes stapelt sich mit 20 μm Dicke in der Zeitrafferaufnahme von SR-Mikroglia, animiert, so dass 28 min in 1 sec abgespielt werden. Maßstabsleiste, 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Diskussion

Diese Methode beinhaltet aufwendige chirurgische Eingriffe, kann aber bei richtiger Präparation über einen längeren Zeitraum hochauflösende Bilder über die gesamte CA1 liefern. Experimente mit mehreren Mäusen bestätigten, dass die Bildqualität in der chronischen postoperativen Phase besser ist als die der akuten postoperativen Bildgebung. Die bessere Bildqualität blieb über 2 Monate erhalten. Die häufigste Ursache für das Versagen ist eine unbeabsichtigte Schädigung des CA1 während der Operation, die in der postoperativen Qualitätskontrolle (siehe Schritt 4) identifiziert wird. Dies kann auf eine direkte Verletzung durch Aspiration, Austrocknung des Gehirns, übermäßigen Druck durch das Glas oder Toxizität durch den Zahnzement im letzten Schritt zurückzuführen sein. Eine weitere Ursache für das Versagen sind Nachblutungen, die innerhalb von 1 Woche nach der Operation durch das Glasbodenfenster bestätigt werden können (siehe Schritt 6.1). Lesen Sie das Protokoll sorgfältig durch und treffen Sie alle Vorsichtsmaßnahmen, um solche Probleme zu vermeiden.

Selbst mit dem derzeitigen Aufbau eines Zwei-Photonen-Mikroskops mit GaAsP-Detektoren im Labor führt der Versuch, das dorsale CA1 durch den Kortex abzubilden, zu einem signifikanten Auflösungsverlust aufgrund der nicht zu vernachlässigenden Streuung des Lichts. Um eine ausreichende Auflösung zu erhalten, um die Bewegung von Mikrogliafortsätzen oder die Bildung von dendritischen Dornen von Neuronen im CA1 zu beobachten, ist es daher unumgänglich, einen Teil des darüber liegenden Kortex zu entfernen, wie bei der vorliegenden Methode. Die einzige alternative Möglichkeit, das Ausmaß der kortikalen Entfernung bei gleichzeitiger Beibehaltung einer hohen Bildauflösung zu reduzieren, ist die Einbettung einer Relaislinse, z. B. einer Gradienten-Brechungsindex-Linse (GRIN). Bei diesem Ansatz wurde eine GRIN-Linse in einem Führungsrohr platziert, das direkt über dem CA1 implantiert wurde, um eine chronische CA1-Bildgebung zu ermöglichen^28,29. Der Außendurchmesser des Führungsrohrs betrug 1,8 mm und ist damit kleiner als die 3,0 mm des Geräts in dieser Arbeit, während eine hohe Auflösung (NA; 0,82) erzeugt wird, die mit dem System hier vergleichbar ist (effektive NA; 0,88). Der Ansatz mit einem GRIN-Objektiv hat jedoch ein enges Sichtfeld für hochauflösende Beobachtungen und eine kurze Abbildungstiefe, die durch den WD des GRIN-Objektivs begrenzt ist. Daher ist die Abbildung aller Hippocampusschichten in einem weiten Sichtfeld mit hoher Auflösung ein besonderer Vorteil der Methode in dieser Arbeit.

Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass die teilweise Entfernung der Hirnrinde und die Entzündung einige nachteilige Auswirkungen auf den Hippocampus haben können. Da der entfernte Kortex jedoch keinen direkten Einfluss auf den Hippocampus hat, der entorhinale Kortex nicht geschädigt wird und der Hippocampus selbst nicht direkt verletzt wird, ist die Gesamteinschätzung, dass die funktionelle Beeinträchtigung des Hippocampus nicht signifikant ist. Mehrere frühere Studien haben bestätigt, dass die Funktionen des Hippocampus, einschließlich Lernen und Gedächtnis, nach der Implantation des Hippocampusfensters erhalten bleiben 25,26,27,30,31,32,33,34. Daher wird erwartet, dass der hier beschriebene bildgebende Ansatz die Funktionen des Hippocampus nach einer ausreichenden postoperativen Phase originalgetreu wiedergibt.

Zukünftige Richtungen von Forschungsobjekten, die auf diesem bildgebenden Verfahren basieren, könnten synaptisches Pruning umfassen, das durch gleichzeitige Bildgebung von Mikroglia und Neuronen⁵ nachgewiesen wird, lernbezogene Interaktion von Mikroglia mit Synapsen³⁵, Mikrogliamotilität, die durch die neuronale Aktivität des Hippocampus reguliert wird³⁶, und Mikrogliareaktionen auf periphere Entzündungen oder Gewebeschäden⁷. Diese Methode wird auch dazu beitragen, den Verlauf neurodegenerativer Erkrankungen aufzuklären. Bei der Alzheimer-Krankheit (AD) zum Beispiel akkumulieren Amyloid-β- und Tau-Proteine parallel zum neuronalen Zelltod und Hippocampus-Atrophie, was zu kognitiven Dysfunktionen führt. Es wurde berichtet, dass Mikroglia an diesem Prozess beteiligt sind^37,38. Die chronische In-vivo-Bildgebung von Mikroglia und Neuronen mit den AD-Mausmodellen wird es uns ermöglichen, die Korrelation zwischen Mikrogliafunktionen und neuronaler Pathologie im Hippocampus der AD-Mausmodelle zu überwachen.

Diese Arbeit konzentriert sich auf die Bildgebung von Mikroglia, aber das gleiche Bildgebungsverfahren ist auch auf die anderen neuronalen und gliaalen Zelltypen im CA1 anwendbar. Darüber hinaus ist das Protokoll auf die Bildgebung von anästhesierten Mäusen beschränkt, kann aber auch auf die Überwachung von Hippocampus-Mikroglia in wachen Mäusen ausgeweitet werden. Die durch Atmung, Herzschlag und Körperbewegungen induzierten Bewegungsartefakte, insbesondere in den tiefen Hippocampusschichten abseits des Glasfensters, könnten in Experimenten mit wachen Mäusen auftreten. Daher kann ein geeignetes Bewegungskorrektursystem erforderlich sein, um die Morphologie und Dynamik der Mikroglia zu erfassen.

Erörterung des Protokolls
Es ist ratsam, Mäuse mit entsprechendem Alter und genetischen Modifikationen für die Expression von Fluoreszenzsonden mit zeitlicher und räumlicher Spezifität auszuwählen (siehe Schritt 1.3). Mäuse im Alter von 1 Monat können für Experimente verwendet werden, aber Mäuse, die älter als 2 Monate sind, sind aufgrund ihrer größeren Körpergröße und Widerstandsfähigkeit gegen chirurgischen Stress einfacher zu handhaben. Hinzu kommt, dass die äußere Kapsel und der Alveus des Hippocampus bei jüngeren Mäusen schwieriger zu trennen sind. Daher erfordert das Entfernen der äußeren Kapsel bei jungen Mäusen chirurgische Fähigkeiten (siehe Schritte 3.4.3-4). Die Beurteilung der Operation und die anschließende Bildgebung werden einfacher sein, wenn Mäuse fluoreszierende Proteine reproduzierbar und gleichmäßig im CA1 und im DG exprimieren (siehe Schritt 4.7). Daher ist es ratsam, in den ersten Versuchen der Operation transgene Mäuse mit spärlich markierten Neuronen wie Thy1-YFP- oder Thy1-GFP-Mäuse³⁹ oder Mäuse mit markierten Mikroglia wie CX3CR1-GFP-Mäuse²⁴ zu verwenden.

Für eine erfolgreiche Operation ist die Wahl der Anästhesie wichtig (siehe Schritt 2.1). Verschiedene Arten der Anästhesie können unterschiedliche Grade von intraoperativen Hirnödemen verursachen, die sich auf die Schwierigkeit der Operation, die relative Position des implantierten Metallrohrs und das Ausmaß der Hirnkompression durch das Glasfenster auswirken. Diese Faktoren können auch das Überleben von Neuronen des Hippocampus nach der Operation beeinflussen.

Bei der Aspiration zur Freilegung des Hippocampus (siehe Schritt 3.4) sollten die folgenden Punkte beachtet werden, um die Schädigung des Gehirns zu minimieren und eine erfolgreiche Bildgebung zu gewährleisten. Versorgen Sie die Gewebeoberfläche ständig mit steriler Kochsalzlösung, indem Sie einen Auslass an der Seite des Schädelfensters positionieren. Verhindern Sie, dass die Gewebeoberfläche während der Aspiration mit Luft in Berührung kommt. Das Grundprinzip der Gewebeaspiration besteht darin, die Gewebeoberfläche durch einen Flüssigkeitsstrom in die Saugspitze abzutragen. Ein direkter Kontakt der Saugspitze mit dem Gewebe sollte vermieden werden. Stellen Sie den auf das Saugrohr ausgeübten Unterdruck auf ein Minimum ein. Saugen Sie das Gewebe Schritt für Schritt ab und vergewissern Sie sich, dass die Blutung in jedem Schritt kontrolliert wird. Wenn die Blutung länger anhält, warten Sie, bis die Blutung spontan aufhört. Halten Sie die Aspiration aus kurzer Entfernung von der Blutungsstelle mit einem konstanten Fluss steriler Kochsalzlösung. Saugen Sie das Gewebe ab, um einen zylindrischen Raum zu schaffen, dessen Größe zum Metallrohr mit Glasboden passt (siehe Schritt 1.1). Wählen Sie 23-G-Nadeln, um dicke Pialgefäße oder große Gewebefragmente abzusaugen, und 25-G-Nadeln, um kleine Gewebereste abzusaugen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
23 G stumpfe Nadeln	NIPRO	02-166	Saugspitzen zum Absaugen.
25 G stumpfe Nadeln	NIPRO	02-167	Saugspitzen zum Absaugen.
3 mm Dermalstanzen (DermaPunch)	Maruho	213001610	Werkzeuge für die Kraniotomie.
30 G Nadeln	Dentronics	Einwegnadel Nr. 30	Werkzeuge für die Kraniotomie.
Ein gepulster Femtosekundenlaser	Spectra-Physics	MaiTai Deep See	Ein Ti:Saphir-Laser bei einer Wellenlänge von 920 nm
Ein Zwei-Photonen-Mikroskop	Nikon	A1R MP+	Mikroskop für die CA1-Bildgebung.
AAV1-CAG-FLEX-tdTomato	Penn Vector Core		AAV für die neuronale Markierung.
AAV1-hSyn-Cre	Penn Vector Core		AAV für die neuronale Markierung.
Ein Objektiv für die Zwei-Photonen-Bildgebung	Olympus	XLPLN25XSVMP	25-fach-Objektiv mit großem Arbeitsabstand, hoher numerischer Apertur und einem Korrekturring
Aspiratoren	Shin-ei Industries	KS-500	Werkzeuge für die Aspiration.
Aluminiumplatten	Narishige	CP-1	Platten aus Aluminium zur Kopffixierung.
Chemische Enthaarungscreme	YANAGIYA		Creme zur Haarentfernung rund um die Operationsstelle.
Runde Glasdeckgläser	Matsunami Glass	3φ Nr. 1	Deckgläser, die mit Edelstahlrohren verklebt sind.
CX3CR1-GFP-Mäuse	Das Jackson Laboratory	008451	Transgene Mäuse für die Mikroglia-Bildgebung.
Zylindrische Edelstahlrohre	MORISHITA	Maßgeschneiderte	Metallrohre zum Implantieren. Außendurchmesser 3,0 mm, Innendurchmesser 2,8 mm, Höhe 1,7 mm.
Zahnätzmaterial	Sun Medical	204610461	Wird zum Ätzen der Schädelknochen verwendet.
Zahnharzzement (Super-Bond C& B)	Sun Medical	204610555	Zahnzement.
Dura-Picker (Mikrospitzen)	Fine Science Tools	10063-15	Werkzeuge zum Entfernen von Dura.
Feine Pinzette (Dumont #5)	Fine Science Tools	11252-20	Chirurgische Werkzeuge.
Pinzette	Bio Research Center	PRI13-3374	Wird zur Desinfektion der Operationsstelle verwendet.
Kopfhaltevorrichtung	Narishige	MAG-2	Die Kopfhaltevorrichtung von Mäusen mit Winkelverstellern
Heizkissen	Bio Research Center	BWT-100A und HB-10	Tools zur thermischen Unterstützung der Maus während der Operation.
Heizkissen	ALA Scientific	HEATINGPAD-1 und Hot-1	Tools zur thermischen Unterstützung der Maus an der Kopfhaltevorrichtung.
Ketamin (Ketalar)	Daiichi Sankyo Company	S9-001665	Anästhesie während der Operation.
Meloxicam	Tokyo Chemical Industry	M1959	Analgesie während der Operation.
Augensalbe	Sato Pharmaceutical		Wird verwendet, um Augentrockenheit während der Operation zu verhindern.
Povidon-Jod-Peeling-Lösung	Meiji Seika Pharma	2612701Q1137	Wird zur Desinfektion der Operationsstelle verwendet.
Miniaturmesser mit runder Spitze	Surgistar	4769	Chirurgische Instrumente.
Skalpell	MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS	450-098-67	Chirurgisches Einwegwerkzeug.
Stereomikroskope	Leica Microsystems	S8 APO	Mikroskope für die Chirurgie.
Sterile Kochsalzlösung	Otsuka Pharmaceutical Factory	3311401A2026	Waschlösung während der Operation.
Steriles wasserdichtes Pad	AS ONE	8-5945-01	Chirurgische Plattform.
Sulforhodamin 101	Sigma-Aldrich	S7635	Ein Farbstoff für die in vivo Gefäßbildgebung.
OP-Abdecktuch	Medline Industries	MP-0606F6T	Perforiertes Abdecktuch für die Chirurgie.
UV-Licht	Toshiba	GL15	Wird zum Aushärten der Klebstoffe verwendet.
UV-härtende optische Klebstoffe	Thorlabs	NOA81	Klebstoffe für die Verklebung von Deckgläsern auf Edelstahlrohren.
Xylazin (Celactal 2%)	Bayer-Anästhesie während der Operation.