Eine einfache Tischfiltrationsmethode zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert, wie die kleinen extrazellulären Vesikel (hUC-MSC-sEVs) von humanen Nabelschnurstammzellen (hUC-MSC-sEVs) mit einer einfachen Laborumgebung isoliert werden können. Die Größenverteilung, Proteinkonzentration, sEVs-Marker und Morphologie isolierter hUC-MSC-sEVs werden durch Nanopartikel-Tracking-Analyse, BCA-Protein-Assay, Western Blot bzw. Transmissionselektronenmikroskop charakterisiert.

Zusammenfassung

Das auf Ultrazentrifugation basierende Verfahren gilt als die gängigste Methode zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs). Die Ausbeute dieser Isolationsmethode ist jedoch relativ gering, und diese Methoden sind ineffizient bei der Trennung von sEV-Subtypen. Diese Studie demonstriert eine einfache Benchtop-Filtrationsmethode zur Isolierung von aus humanen Nabelschnur gewonnenen kleinen extrazellulären MSC-Vesikeln (hUC-MSC-sEVs), die erfolgreich durch Ultrafiltration aus dem konditionierten Medium von hUC-MSCs getrennt wurden. Die Größenverteilung, die Proteinkonzentration, die exosomalen Marker (CD9, CD81, TSG101) und die Morphologie der isolierten hUC-MSC-sEVs wurden mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse, BCA-Protein-Assay, Western Blot bzw. Transmissionselektronenmikroskop charakterisiert. Die Größe der isolierten hUC-MSC-sEVs betrug 30-200 nm, mit einer Partikelkonzentration von 7,75 × 10 10 Partikeln/ml und einer Proteinkonzentration von⁸⁰ μg/ml. Es wurden positive Banden für die exosomalen Marker CD9, CD81 und TSG101 beobachtet. Diese Studie zeigte, dass hUC-MSC-sEVs erfolgreich aus hUC-MSCs konditioniertem Medium isoliert wurden, und die Charakterisierung zeigte, dass das isolierte Produkt die in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018) genannten Kriterien erfüllte.

Einleitung

Laut MISEV 2018 handelt es sich bei sEVs um nicht-replizierende Lipiddoppelschichtpartikel ohne funktionellen Zellkern mit einer Größe von 30-200^nm1. MSC-abgeleitete sEVs enthalten wichtige Signalmoleküle, die eine wichtige Rolle bei der Geweberegeneration spielen, wie z. B. microRNA, Zytokine oder Proteine. Sie haben sich zunehmend zu einem Forschungs-"Hotspot" in der regenerativen Medizin und der zellfreien Therapie entwickelt. Viele Studien haben gezeigt, dass MSC-abgeleitete sEVs bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen genauso wirksam sind wie MSCs, wie z. B. Immunmodulation 2,3,4,5, Verbesserung der Osteogenes....

Protokoll

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Mesenchymale Stammzellen und Kultur der menschlichen Nabelschnur

1. Kultivieren Sie die hUC-MSCs bei einer Aussaatdichte von 5 × 10³/^cm2 in DMEM, ergänzt mit 8 % humanem Thrombozytenlysat und 1 % Pen-Streptokokken. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5% CO₂. Tauschen Sie das Zellkulturmedium alle 3 Tage aus, um ein ordnungsgemäßes Zellwachstum zu gewährleisten.
2. Erweitern Sie die Zellen auf Passage 5 in T175-Kolben zur....

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt, dass hUC-MSC-sEVs einen Partikelgrößenmodus bei 53 nm aufweisen, während andere signifikante Peaks der Partikelgröße bei 96 und 115 nm lagen. Die mit NTA gemessene Konzentration von hUC-MSC-sEVs betrug 7,75 × 10¹⁰ Partikel/ml. Die mit dem BCA-Assay gemessene Proteinkonzentration der hUC-MSC-sEVs betrug ca. 80 μg/ml.

In der Western-Blotting-Analyse zeigten hUC-MSC-sEVs positive Banden für die exosomalen Marker CD9, CD81 und TSG101, war.......

Diskussion

EVs sind eine der wichtigen Untergruppen des Sekretoms in MSCs, die eine entscheidende Rolle bei normalen und pathologischen Prozessen spielen. Allerdings haben sEVs mit einem Größenbereich zwischen 30 und 200 nm in den letzten zehn Jahren als potenzielles Werkzeug für die zellfreie Therapie zugenommen. Es wurden verschiedene Techniken entwickelt, um sEVs aus MSCs zu isolieren. Differentielle Ultrazentrifugation, Ultrafiltration, polymerbasierte Fällung, Immunaffinitätserfassung und mikrofluidikbasierte Fällung weisen je.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
40% Acrylamid	Nacalai Tesque	06121-95	Western Blot
95% Ethanol	Nacalai Tesque	14710-25	Desinfektionsmittel
Absolute Methanol	Chemiz	45081	Zur Aktivierung der PVDF-Membran (Western Blot)
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Zelldissoziationsenzym
Ammoniumpersulfat	Chemiz	14475	katalysiert die Gelpolymerisation (Gelelektrophorese
anti-CD 81 (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	Antikörper für sEVs-Marker
anti-TSG 101 (C-2)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7964	Antikörper für sEVs-Marker
Rinderserumalbumin	Nacalai Tesque	00653-31	PVDF-Membran blockierend
bromophenolblau	Nacalai Tesque	05808-61	elektrophoretischer Farbmarker
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)	Millipore	UFC710008	sEVs-Isolierung
ChemiLumi One L	Nacalai Tesque	7880	Chemilumineszenz-Detektionsreagenz
CryoStor Gefriermedien	Sigma-Aldrich	C3124-100ML	Zellkryokonservierung
Dulbecco' s modifizierter Eagle" s medium	Nacalai Tesque	08458-45	Zellkulturmedien
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker	SMOBIO	PM2610	Protein Molekulargewichtsmarker
Extra dickes Löschpapier	ATTO		Puffer Reservior (Western Blot)
Glycerol	Merck	G5516	Chemikalien für Western Blot
Glycine	1st Base	BIO-2085-500g	Chemikalien für Puffer (Western Blot)
Meerrettichperoxidase-konjugiertes Maus-IgG-Kappa-bindendes Protein (m-IgGκ BP-HRP)	Santa Cruz Biotechnology	sc-516102	Sekundärantikörper (Western Blot)
Human Wharton' s aus Gelee gewonnene mesenchymale Stammzellen (MSCs)	Zentrum für Gewebezüchtung und regenerative Medizin, Medizinische Fakultät, The National University Malaysia
Maus-Antikörper anti-CD 9 (C-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118	Antikörper für sEVs-Marker
Nanosight NS300, ausgestattet mit einer CMOS-Kamera, einer 20-fach-Objektivlinse, einem blauen Lasermodul (488&dünnsp; nm) und NTA-Software v3.2	Malvern Panalytical, UK
Paraformaldehyd	Nacalai Tesque	02890-45	Probenfixierung während TEM
Penicillin– Streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Antibiotikum für Medien
Phenylmethylsulfonylfluorid	Nacalai Tesque	27327-81	Hemmt Proteasen in den sEVs-Proben nach Zugabe von Lysepuffer
phosphatgepufferter Kochsalzlösung	Gibco	10010023	Waschen, Probenverdünnung
Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran mit 0,45 mm Porengröße	ATTO		Zur Speicherung des Proteins während des Proteintransfers (Western Blot)
Proteasehemmer-Cocktail	Nacalai Tesque	25955-11	Hemmung der Proteasen in den sEVs-Proben nach Zugabe von Lysepuffer
Protein Assay Bicinchoninat Kit	Nacalai Tesque	06385-00	Proteinmessung
Probenpufferlösung mit 2-ME	Nacalai Tesque	30566-22	Reduktionsmittel für Western Blot
Natrium Chlorid	Nacalai Tesque	15266-64	Chemikalien für Western Blot
Natriumdodecylsulfat	Nacalai Tesque	31606-62	ionisches Tensid während der Gelelektrophorese
Tecnai G2 F20 S-TWIN Transmissionselektronenmikroskop	FEI, USA
Tetramethylethylendiamin	Nacalai Tesque	33401-72	Chemikalien zur Herstellung
von Gel-Tris-Base	1. Base	BIO-1400-500g	Chemikalien für Puffer (Western Blot)
Tween 20	GeneTex	GTX30962	Chemikalien für Western Blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD-Imager			CCD-Imager für die Erkennung von Western-Blot-Signalen