Methodenartikel

Eine einfache Tischfiltrationsmethode zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus humanen mesenchymalen Stammzellen

DOI:

10.3791/64106

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23. Juni 2022

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1Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia Medical Centre, 2My CytoHealth Sdn. Bhd., 3School of Biosciences, Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University, 4School of Pharmacy, Monash University Malaysia, 5Haematology Unit, Cancer Research Centre, Institute for Medical Research (IMR), National Institutes of Health (NIH), Ministry of Health Malaysia, 6School of Pharmacy, Faculty of Health & Medical Sciences, Taylor's University, 7Centre for Drug Discovery and Molecular Pharmacology (CDDMP), Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll demonstriert, wie die kleinen extrazellulären Vesikel (hUC-MSC-sEVs) von humanen Nabelschnurstammzellen (hUC-MSC-sEVs) mit einer einfachen Laborumgebung isoliert werden können. Die Größenverteilung, Proteinkonzentration, sEVs-Marker und Morphologie isolierter hUC-MSC-sEVs werden durch Nanopartikel-Tracking-Analyse, BCA-Protein-Assay, Western Blot bzw. Transmissionselektronenmikroskop charakterisiert.

Zusammenfassung

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Das auf Ultrazentrifugation basierende Verfahren gilt als die gängigste Methode zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs). Die Ausbeute dieser Isolationsmethode ist jedoch relativ gering, und diese Methoden sind ineffizient bei der Trennung von sEV-Subtypen. Diese Studie demonstriert eine einfache Benchtop-Filtrationsmethode zur Isolierung von aus humanen Nabelschnur gewonnenen kleinen extrazellulären MSC-Vesikeln (hUC-MSC-sEVs), die erfolgreich durch Ultrafiltration aus dem konditionierten Medium von hUC-MSCs getrennt wurden. Die Größenverteilung, die Proteinkonzentration, die exosomalen Marker (CD9, CD81, TSG101) und die Morphologie der isolierten hUC-MSC-sEVs wurden mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse, BCA-Protein-Assay, Western Blot bzw. Transmissionselektronenmikroskop charakterisiert. Die Größe der isolierten hUC-MSC-sEVs betrug 30-200 nm, mit einer Partikelkonzentration von 7,75 × 10 10 Partikeln/ml und einer Proteinkonzentration von80 μg/ml. Es wurden positive Banden für die exosomalen Marker CD9, CD81 und TSG101 beobachtet. Diese Studie zeigte, dass hUC-MSC-sEVs erfolgreich aus hUC-MSCs konditioniertem Medium isoliert wurden, und die Charakterisierung zeigte, dass das isolierte Produkt die in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018) genannten Kriterien erfüllte.

Einleitung

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Laut MISEV 2018 handelt es sich bei sEVs um nicht-replizierende Lipiddoppelschichtpartikel ohne funktionellen Zellkern mit einer Größe von 30-200nm1. MSC-abgeleitete sEVs enthalten wichtige Signalmoleküle, die eine wichtige Rolle bei der Geweberegeneration spielen, wie z. B. microRNA, Zytokine oder Proteine. Sie haben sich zunehmend zu einem Forschungs-"Hotspot" in der regenerativen Medizin und der zellfreien Therapie entwickelt. Viele Studien haben gezeigt, dass MSC-abgeleitete sEVs bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen genauso wirksam sind wie MSCs, wie z. B. Immunmodulation 2,3,4,5, Verbesserung der Osteogenese 6, Diabetes mellitus7,8 oder vaskuläre Regeneration 9,10. Im Laufe der frühen Phase der Studien wurden drei Hauptprobleme in Bezug auf die klinische Translation von MSCs-EVs hervorgehoben: die Ausbeute der EVs, die Reinheit der EVs (frei von Zelltrümmern und anderen biologischen Verunreinigungen wie Proteinen und Zytokinen) und die Integrität der Phospholipid-Doppelschichtmembran der EVs nach der Isolierung.

Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um sEVs zu isolieren, wobei die Dichte, Form, Größe und das Oberflächenprotein der sEVs ausgenutzt werden11. Die beiden gebräuchlichsten Methoden bei der Isolierung von sEVs sind ultrazentrifugationsbasierte und ultrafiltrationsbasierte Techniken.

Ultrazentrifugationsbasierte Methoden gelten als Goldstandardmethoden bei der Isolierung von sEVs. Zwei Arten von Ultrazentrifugationstechniken, die normalerweise verwendet werden, sind die differentielle Ultrazentrifugation und die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Ultrazentrifugationsmethoden führen jedoch oft zu einer geringen Ausbeute und erfordern teure Geräte für Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugen (100.000-200.000 × g)11. Darüber hinaus sind Ultrazentrifugationstechniken allein ineffizient bei der Trennung von EV-Subtypen (sEVs und große EVs), was zu einer unreinen Sedimentschichtführt 11. Schließlich könnte die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation auch zeitaufwändig sein und zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen erfordern, wie z. B. die Zugabe von Saccharosepuffer, um die Gradientenschädigung während der Beschleunigungs- und Verzögerungsschritte12 zu verhindern. Daher führt die Ultrazentrifugation in der Regel zu einer relativ geringen Ausbeute und ist nicht in der Lage, zwischen verschiedenen Populationen von EVs13 zu unterscheiden, was ihre Anwendung für die großtechnische EV-Präparation11 einschränkt.

Die zweite Methode der EV-Isolierung ist die Ultrafiltration, die auf der Größenfiltration basiert. Die Ultrafiltration ist im Vergleich zur Ultrazentrifugation relativ zeit- und kosteneffizient, da sie keine teuren Geräte oder langen Verarbeitungszeiten erfordert14. Daher scheint die Ultrafiltration eine effektivere Isolationstechnik zu sein als die beiden oben genannten Ultrazentrifugationsmethoden. Die isolierten Produkte können je nach Porengröße und höherer Ausbeute spezifischer sein15. Die zusätzliche Kraft, die während des Filtrationsprozesses entsteht, kann jedoch zur Verformung oder zum Ausbruch der EVs16 führen.

In der vorliegenden Arbeit wird ein kosten- und zeiteffizientes Benchtop-Protokoll zur Isolierung von MSC-abgeleiteten sEVs für nachgelagerte Analysen und therapeutische Zwecke vorgeschlagen. Die in diesem Artikel beschriebene Methode kombinierte eine einfache Filtrationsmethode mit einer Tischzentrifugation, um ertragreiche und qualitativ hochwertige EVs aus hUC-MSCs für die nachgelagerte Analyse zu isolieren, einschließlich Partikelgrößenanalyse, Biomarker-Assay und elektronenmikroskopischer Bildgebung.

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Protokoll

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HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Mesenchymale Stammzellen und Kultur der menschlichen Nabelschnur

  1. Kultivieren Sie die hUC-MSCs bei einer Aussaatdichte von 5 × 103/cm2 in DMEM, ergänzt mit 8 % humanem Thrombozytenlysat und 1 % Pen-Streptokokken. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5% CO2. Tauschen Sie das Zellkulturmedium alle 3 Tage aus, um ein ordnungsgemäßes Zellwachstum zu gewährleisten.
  2. Erweitern Sie die Zellen auf Passage 5 in T175-Kolben zur sEV-Isolierung.
    HINWEIS: Es werden viele Kolben benötigt, um eine hohe Ausbeute an sEVs zu erzielen (die Ausbeute steigt mit der Anzahl der Zellen).

2. Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus hUC - MSCs

  1. Ersetzen Sie das Nährmedium durch frisches, phenolrotfreies DMEM, das mit 1 % Pen-Streptokokken [konditioniertes Medium (CM)] ergänzt wird, wenn die Kultur bei Passage 5 eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht.
    VORSICHT: Verwenden Sie nur Basalmedien; Vermeiden Sie FBS und humane Thrombozytenlysat-Ergänzung, um eine Kontamination durch externe sEVs zu vermeiden.
  2. Nach 24 h zentrifugieren Sie den CM bei 200 × g für 5 min bei 4 °C, um Zellreste zu entfernen. Sammeln und filtern Sie den Überstand durch einen 0,22-μm-Filter, um Partikel zu entfernen, die größer als 220 nm sind.
  3. Füllen Sie die Zentrifugalfiltereinheit mit 30 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die durch einen 0,2-μm-Filter gefiltert wird. Zentrifugieren Sie die Zentrifugalfiltereinheit bei 3.500 × g für 5 min bei 4 °C.
  4. Füllen Sie das gefilterte CM in die Zentrifugalfiltereinheit (das maximale Volumen jeder Einheit beträgt 70 ml). Zentrifugieren Sie den CM bei 3.500 × g bei 4 °C.
    Anmerkungen: Die Dauer der Zentrifugation sollte von Zeit zu Zeit überwacht werden, bis die Lösung die Oberfläche des Filters erreicht hat.
  5. Entsorgen Sie die Lösung im Filtratlösungsbecher. Den Probenfilterbecher mit dem Konzentratauffangbecher bei 1.000 x g bei 4 °C für 2 min rückwärts zentrifugieren.
  6. Übertragen Sie das konzentrierte CM zurück in die Zentrifugalfiltereinheit. Geben Sie 30 ml filtriertes PBS in die Zentrifugalfiltereinheit und zentrifugieren Sie das Gerät bei 3.500 × g bei 4 °C.
  7. Entsorgen Sie die Lösung im Filtratlösungsbecher. Installieren Sie einen Konzentratsammelbecher auf der Filtereinheit und zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 4 °C bei 1.000 × g zurück, um die gereinigten sEVs zu erhalten.
  8. Filtern Sie die sEVs durch einen 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter.
  9. Übertragen Sie die Proben in neue Röhrchen und lagern Sie sie zur weiteren Analyse bei -80 °C.

3. Charakterisierung von hUC-MSC-sEVs

  1. Nanopartikel-Tracking-Analyse
    1. Verdünnen Sie die isolierten hUC-MSC-sEVs in gefiltertem PBS auf 20-100 Partikel/Frame.
    2. Geben Sie 1 ml der verdünnten Probe mit 1 ml Einwegspritzen in die NTA-Kammer.
    3. Stellen Sie die Messeinstellungen entsprechend ein: Stellen Sie die Kameraebene auf Stufe 14 ein, bestimmen Sie die Erkennungsschwelle , um so viele Partikel wie möglich einzuschließen, mit der Einschränkung, dass 10-100 rote Kreuze gezählt werden und die Anzahl der blauen Kreuze auf fünf begrenzt ist.
    4. Nehmen Sie für jede Messung fünf 1-minütige Videos auf und analysieren Sie sie mit der NanoSight-Software mit einer Nachweisschwelle von fünf.
    5. Nehmen Sie für jede Probe Messungen in dreifacher Ausfertigung vor.
  2. Western-Blotting-Analyse
    1. Die hUC-MSC-sEVs werden mit einem RIPA-Lysepuffer (Ice-Cold Radioimmunoprecipitation Assay) lysiert, 30 min bei 4 °C inkubiert und bei 200 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Sammle den Überstand ein.
    2. Quantifizieren Sie das Protein mit einem Bicinchoninsäure (BCA) Protein-Assay-Kit. Stellen Sie das Gelelektrophorese-Set entsprechend zusammen und führen Sie die Gelelektrophorese bei 90 V durch, bis das Protein das Ende des Stapelgels erreicht. Ändern Sie die Spannung auf 200 V, um die Proteine bis zum Ende des auflösenden Gels zu trennen.
    3. Führen Sie einen halbtrockenen Transfer durch, um die Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran bei 15 V für 1 h zu übertragen.
    4. Blockieren Sie die PVDF-Membran mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA)/Tris-gepufferter Kochsalzlösung-0,1 % v/v Tween 20 (TBS-T) für 1 h auf einem Schüttler bei Raumtemperatur. Die PVDF-Membran wird mit Primärantikörpern wie folgt inkubiert: monoklonaler Anti-CD-9-Antikörper der Maus (1:500), monoklonaler Anti-CD-81-Antikörper der Maus (1:500), monoklonaler Anti-TSG 101-Antikörper der Maus (1:500) bei 4 °C über Nacht unter ständigem Schütteln.
    5. Am nächsten Tag wird die PVDF-Membran 5 x 5 min mit TBS-T gewaschen und mit einem sekundären Antikörper, dem Meerrettichperoxidase-konjugierten Maus-IgG-kappa-bindenden Protein (m-IgGκ BP-HRP) (1:5.000), 1 h lang unter Rühren bei Raumtemperatur inkubiert.
    6. Waschen Sie die PVDF-Membran erneut fünfmal mit TBS-T und visualisieren Sie die Membran in einem ladungsgekoppelten (CCD) Imager mit einem Chemilumineszenz-Detektionsreagenz. Analysieren Sie das Expressionsniveau der Proteine mit der ImageJ-Software. Öffnen Sie zunächst die Bilddatei in ImageJ (Datei | Öffnen...). Verbessern Sie die Bildqualität, indem Sie Helligkeit und Kontrast anpassen ("Bild | Anpassen | Helligkeit/Kontrast). Passen Sie das Bild an, bis die Flecken deutlich sichtbar sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen und speichern Sie die Bilder im TIFF-Format (Datei | Speichern unter | TIFF...).
  3. Transmissionselektronenmikroskop
    1. Verdünnen Sie einen Teil der hUC-MSC-sEVs-Probe mit vier Teilen filtriertem PBS auf ein Gesamtvolumen von 10 μl und inkubieren Sie ihn 15 Minuten lang auf einem kohlenstoffbeschichteten Kupfergitter.
    2. Entfernen Sie die überschüssige Probe mit einem Labortuch und lassen Sie sie 3 Minuten lang an der Luft trocknen.
    3. Inkubieren Sie 10 μl 1%ige Phosphowolframsäure (PTA)-Lösung, um die Probe 3 Minuten lang zu färben.
    4. Entfernen Sie die überschüssige 1%ige PTA-Lösung mit einem Labortuch und lassen Sie sie 3 Minuten lang an der Luft trocknen.
    5. Verwenden Sie die Probe für die transmissionselektronenmikroskopische Bildgebung.
      HINWEIS: In Abbildung 1 finden Sie die zusammengefassten schematischen Experimentschritte.

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Ergebnisse

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Abbildung 2 zeigt, dass hUC-MSC-sEVs einen Partikelgrößenmodus bei 53 nm aufweisen, während andere signifikante Peaks der Partikelgröße bei 96 und 115 nm lagen. Die mit NTA gemessene Konzentration von hUC-MSC-sEVs betrug 7,75 × 1010 Partikel/ml. Die mit dem BCA-Assay gemessene Proteinkonzentration der hUC-MSC-sEVs betrug ca. 80 μg/ml.

In der Western-Blotting-Analyse zeigten hUC-MSC-sEVs positive Banden für die exosomalen Marker CD9, CD81 und TSG101, war...

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Diskussion

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EVs sind eine der wichtigen Untergruppen des Sekretoms in MSCs, die eine entscheidende Rolle bei normalen und pathologischen Prozessen spielen. Allerdings haben sEVs mit einem Größenbereich zwischen 30 und 200 nm in den letzten zehn Jahren als potenzielles Werkzeug für die zellfreie Therapie zugenommen. Es wurden verschiedene Techniken entwickelt, um sEVs aus MSCs zu isolieren. Differentielle Ultrazentrifugation, Ultrafiltration, polymerbasierte Fällung, Immunaffinitätserfassung und mikrofluidikbasierte Fällung weisen je...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Die Veröffentlichung dieses Videos wurde unterstützt von My CytoHealth Sdn. Bhd.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
40% AcrylamidNacalai Tesque06121-95Western Blot
95% EthanolNacalai Tesque14710-25Desinfektionsmittel
Absolute MethanolChemiz45081Zur Aktivierung der PVDF-Membran (Western Blot)
AccutaseSTEMCELL Technologies7920Zelldissoziationsenzym
AmmoniumpersulfatChemiz14475katalysiert die Gelpolymerisation (Gelelektrophorese
anti-CD 81 (B-11)Santa Cruz Biotechnologysc-166029Antikörper für sEVs-Marker
anti-TSG 101 (C-2)Santa Cruz Biotechnologysc-7964Antikörper für sEVs-Marker
RinderserumalbuminNacalai Tesque00653-31PVDF-Membran blockierend
bromophenolblauNacalai Tesque05808-61elektrophoretischer Farbmarker
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)MilliporeUFC710008sEVs-Isolierung
ChemiLumi One LNacalai Tesque7880Chemilumineszenz-Detektionsreagenz
CryoStor GefriermedienSigma-AldrichC3124-100MLZellkryokonservierung
Dulbecco' s modifizierter Eagle" s mediumNacalai Tesque08458-45Zellkulturmedien
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein MarkerSMOBIOPM2610Protein Molekulargewichtsmarker
Extra dickes LöschpapierATTOPuffer Reservior (Western Blot)
GlycerolMerckG5516Chemikalien für Western Blot
Glycine1st BaseBIO-2085-500gChemikalien für Puffer (Western Blot)
Meerrettichperoxidase-konjugiertes Maus-IgG-Kappa-bindendes Protein (m-IgGκ BP-HRP)Santa Cruz Biotechnologysc-516102Sekundärantikörper (Western Blot)
Human Wharton' s aus Gelee gewonnene mesenchymale Stammzellen (MSCs)Zentrum für Gewebezüchtung und regenerative Medizin, Medizinische Fakultät, The National University Malaysia
Maus-Antikörper anti-CD 9 (C-4)Santa Cruz Biotechnology  sc-13118Antikörper für sEVs-Marker
Nanosight NS300, ausgestattet mit einer CMOS-Kamera, einer 20-fach-Objektivlinse, einem blauen Lasermodul (488&dünnsp; nm) und NTA-Software v3.2Malvern Panalytical, UK
ParaformaldehydNacalai Tesque02890-45Probenfixierung während TEM
Penicillin– StreptomycinNacalai Tesque26253-84Antibiotikum für Medien
PhenylmethylsulfonylfluoridNacalai Tesque27327-81Hemmt Proteasen in den sEVs-Proben nach Zugabe von Lysepuffer
phosphatgepufferter KochsalzlösungGibco10010023Waschen, Probenverdünnung
Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran mit
0,45 mm Porengröße		ATTOZur Speicherung des Proteins während des Proteintransfers (Western Blot)
Proteasehemmer-CocktailNacalai Tesque25955-11Hemmung der Proteasen in den sEVs-Proben nach Zugabe von Lysepuffer
Protein Assay Bicinchoninat KitNacalai Tesque06385-00Proteinmessung
Probenpufferlösung mit 2-MENacalai Tesque30566-22Reduktionsmittel für Western Blot
Natrium ChloridNacalai Tesque15266-64Chemikalien für Western Blot
NatriumdodecylsulfatNacalai Tesque31606-62ionisches Tensid während der Gelelektrophorese
Tecnai G2 F20 S-TWIN TransmissionselektronenmikroskopFEI, USA
TetramethylethylendiaminNacalai Tesque33401-72Chemikalien zur Herstellung
von Gel-Tris-Base1. BaseBIO-1400-500gChemikalien für Puffer (Western Blot)
Tween 20GeneTexGTX30962Chemikalien für Western Blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD-ImagerCCD-Imager für die Erkennung von Western-Blot-Signalen
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Referenzen

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  3. Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
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  5. Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
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Schlagwörter

Ultrafiltration MethodConditioned MediumNanoparticle TrackingBCA Protein AssayWestern BlotTransmission Electron MicroscopeExosomal Markers

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