Die Flüssigbiopsie hat unseren Ansatz für translationale Onkologiestudien revolutioniert, wobei die Probenentnahme, -qualität und -lagerung entscheidende Schritte für ihre erfolgreiche klinische Anwendung sind. Hier beschreiben wir ein standardisiertes und validiertes Protokoll für nachgelagerte zirkulatorfreie DNA-Anwendungen, das in den meisten translationalen Forschungslabors angewendet werden kann.
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Methodenartikel
Ein standardisiertes präanalytisches Flüssigbiopsieprotokoll für nachgeschaltete zirkulatorfreie DNA-Anwendungen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Begriff Liquid Biopsy (LB) bezieht sich auf Moleküle wie Proteine, DNA, RNA, Zellen oder extrazelluläre Vesikel im Blut und anderen Körperflüssigkeiten, die aus dem Primär- und / oder metastasierenden Tumor stammen. LB hat sich zu einer tragenden Säule in der translationalen Forschung entwickelt und hat begonnen, Teil der klinischen Onkologiepraxis zu werden, die eine minimal-invasive Alternative zur soliden Biopsie bietet. Das LB ermöglicht die Echtzeitüberwachung eines Tumors über eine minimal-invasive Probenextraktion, wie z.B. Blut. Die Anwendungen umfassen die Krebsfrüherkennung, die Nachsorge von Patienten zur Erkennung des Krankheitsverlaufs, die Beurteilung der minimalen Resterkrankung und die mögliche Identifizierung der molekularen Progression und des Resistenzmechanismus. Um eine zuverlässige Analyse dieser Proben zu erreichen, die in der Klinik gemeldet werden kann, sollten die präanalytischen Verfahren sorgfältig abgewogen und strikt befolgt werden. Probensammlung, -qualität und -speicherung sind entscheidende Schritte, die ihre Nützlichkeit in nachgelagerten Anwendungen bestimmen. Hier stellen wir standardisierte Protokolle aus unserem Flüssigbiopsie-Arbeitsmodul zur Entnahme, Verarbeitung und Lagerung von Plasma- und Serumproben für die nachgeschaltete Flüssigbiopsieanalyse auf Basis zirkulierender DNA vor. Die hier vorgestellten Protokolle erfordern eine Standardausrüstung und sind flexibel genug, um in den meisten Laboratorien, die sich auf biologische Verfahren konzentrieren, angewendet zu werden.
Einleitung
Der Begriff "Flüssigbiopsie" wurde 20101 als das Vorhandensein von Molekülen (z. B. Protein, Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA)), Zellen oder extrazellulären Vesikeln (z. B. Exosomen) im Blut und anderen Körperflüssigkeiten definiert, die aus dem Primärtumor stammen. Die Verwendung von Flüssigbiopsieproben hat die translationale onkologische Forschung revolutioniert, da Gewebebiopsien, die zu einem bestimmten Zeitpunkt auf eine bestimmte Region beschränkt sind, aufgrund der Tumorheterogenität relevante Klone übersehen können. Darüber hinaus spielt die Flüssigbiopsie eine relevante Rolle bei Tumorarten, bei denen Primärgewebe knapp oder nicht zugänglich ist, da sie eine invasive Biopsie vermeiden kann, wodurch Kosten und Risiken für Patienten reduziert werden. Darüber hinaus entwickeln sich die molekularen Eigenschaften des Tumors hauptsächlich aufgrund des Therapiedrucks ständig weiter, und Flüssigbiopsieproben können die klonale Dynamik des Tumors erfassen, da sie longitudinal, in verschiedenen klinischen und therapeutischen Zeiten der Krankheit wie Ausgangswert, bei der Behandlung, beim besten Ansprechen und beim Fortschreiten der Krankheit oder sogar davor entnommen werden können. Das Konzept der "Echtzeit-Flüssigbiopsie" bedeutet, dass dynamische Veränderungen im Tumor in Echtzeit überwacht werden können, was eine Präzisionsmedizin bei dieser Krankheit ermöglicht. Die Flüssigbiopsie hat zahlreiche potenzielle Anwendungen in der Klinik, darunter Screening und Früherkennung von Krebs, Echtzeitüberwachung von Krankheiten, Erkennung von minimalen Resterkrankungen, Untersuchung von Mechanismen zur Behandlungsresistenz und Stratifizierung von Patienten auf der therapeutischen Ebene1. Die Früherkennung von Krankheitsrezidiven und -progression ist bei vielen Tumorarten ein ungedeckter klinischer Bedarf und ein Schlüsselfaktor für die Steigerung des Überlebens und der Lebensqualität von Krebspatienten. Routinemäßigen Bildgebungsmodalitäten und löslichen Tumormarkern fehlt möglicherweise die für diese Aufgabe erforderliche Sensitivität und / oder Spezifität. Daher werden in der Klinik dringend neuartige prädiktive Marker benötigt, etwa auf Basis zirkulierender freier Nukleinsäuren.
Die Arten von Proben, die für Flüssigbiopsiestudien verwendet werden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Blut-, Urin-, Speichel- und Stuhlproben. Andere tumorspezifische Proben können Zellaspirate, Zerebrospinalflüssigkeit, Pleuraflüssigkeit, Zysten- und Aszitesflüssigkeit, Sputum und Pankreassaft2 sein. Die ehemaligen Flüssigkeiten können verschiedene Arten von krebsabgeleiteten Materialien, zirkulierende Tumorzellen (CTC) oder Fragmente wie Exosomen und zellfreie zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) enthalten. Nukleinsäuren können in extrazellulären Vesikeln (EVs) verkapselt oder aufgrund von Zelltod und -schäden in Körperflüssigkeiten freigesetzt werden. Zirkulierende freie DNA (cfDNA) wird hauptsächlich aus apoptotischen oder nekrotischen Zellen in den Blutkreislauf freigesetzt und ist bei allen Individuen vorhanden, wobei sie bei entzündlichen oder onkologischen Erkrankungen erhöhte Spiegel aufweist3. Exosomen sind kleine extrazelluläre Vesikel (~ 30-150 nm), die von Zellen mit Nukleinsäuren, Proteinen und Lipiden sezerniert werden. Diese Vesikel sind Teil des interzellulären Kommunikationsnetzwerks und kommen häufig in vielen Arten von Körperflüssigkeitenvor 2. Die Nukleinsäuren, die in EVs eingeschlossen sind, sind vor der rauen Umgebung in Körperflüssigkeiten geschützt und bieten somit eine robustere Möglichkeit, diese Moleküle in der Flüssigbiopsieumgebung zu untersuchen.
Insgesamt sind die Konzentrationen zirkulierender Nukleinsäuren in Flüssigbiopsieproben sehr niedrig, weshalb für den Nachweis empfindliche Methoden wie digitale PCR oder Next-Generation-Sequencing (NGS) erforderlich sind. Das präanalytische Management der Probe ist entscheidend, um die Blutzelllyse und die Freisetzung intakter DNA zu verhindern, was zu einer Kontamination der cfDNA mit der genomischen DNA führt. Darüber hinaus ist bei der Probenentnahme darauf zu achten, dass Inhibitoren enzymbasierter Analysemethoden nicht vorhanden sind.
Hier stellen wir eine standardisierte Methode zur Entnahme und Lagerung von Plasma- und Serumproben vor, die ein entscheidender erster Schritt für flüssigbiopsiebasierte Downstream-Anwendungen einschließlich zirkulierender Nukleinsäureanalysen ist.
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Protokoll
Die vorherige ethische Genehmigung wurde von den teilnehmenden Zentren vor der Entnahme von Blutproben eingeholt. Die folgenden Protokolle zur Serum- und Plasmaisolierung wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Grundsätzen für die biomedizinische Forschung durchgeführt.
HINWEIS: Vorherige Überlegungen vor Beginn des Protokolls finden Sie hier. Für die Verwendung menschlicher Proben in der biomedizinischen Forschung ist eine vorherige ethische Genehmigung mit der entsprechenden Einverständniserklärung erforderlich. Für die Handhabung von Blutproben ist eine Biosicherheitskabine der Klasse II erforderlich. Ein Laborkittel, Schutzhandschuhe und eine Brille sollten während des gesamten Verfahrens getragen werden, um eine Infektion durch durch Blut übertragene Krankheitserreger zu vermeiden. Für die Verarbeitung von Serumproben sind mindestens 30 min erforderlich. Nach der Blutextraktion in Röhrchen ohne Antikoagulans 30-45 min bei Raumtemperatur (RT) halten, um die Bildung von Gerinnseln zu ermöglichen. Für die Plasmapräparation sind mindestens 40 min erforderlich, und die Proben sollten innerhalb von 4 Stunden ab dem Zeitpunkt der Extraktion verarbeitet werden, wenn Ethylendiamin-Tetraessigsäureröhrchen (EDTA) verwendet werden, oder innerhalb von 24-48 Stunden, wenn zellstabilisierende Entnahmeröhrchen oder spezifische zellfreie DNA-Entnahmeröhrchen verwendet werden. Nach Angaben einiger Hersteller sind die Proben in diesen Spezialröhrchen jedoch bis zu 2 Wochen haltbar. Es ist wichtig, auf Hämolyse zu prüfen, die der Plasma- oder Serumfraktion ein rötliches Aussehen verleiht. Informationen zu hämolysierten Beispielen in der Diskussion finden Sie im Abschnitt zur Fehlerbehebung.
1. Serumpräparation für Flüssigbiopsiestudien
HINWEIS: Die Gesamtzeit für diesen Schritt beträgt 30 Minuten (Abbildung 1).
- Extrahieren Sie 4-10 ml Blut in Röhrchen, die kein Antikoagulans enthalten (rote oder rote/grau-schwarze Kappe) und halten Sie sie bei RT für 30-45 min. Verarbeiten Sie diese Proben innerhalb von 4 Stunden ab dem Zeitpunkt der Entnahme.
- Erfassen Sie Uhrzeit und Datum der Probenextraktion und der Subjektidentifikation (ID) in einer entsprechend gestalteten Probendatenbank.
- Mit einem Laborkittel, Schutzhandschuhen und einer Brille zentrifugieren Sie das Röhrchen mit frischem Blut bei RT (15 °C-25 °C) für 10 min bei 1.600 (± 150) x g, wobei die maximale Pause angewendet wird.
- Nach der Zentrifugation das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge entfernen; Die obere Phase des Serumüberstands erscheint klar und gelblich (Abbildung 2). Überprüfen Sie, ob die Probe Anzeichen einer Hämolyse aufweist (Abbildung 3), und zeichnen Sie gegebenenfalls das Vorhandensein einer Hämolyse auf.
- In einer Biosicherheitskabine der Klasse II wird das Serum als 250-μL-Aliquots in Auffangröhrchen überführt.
HINWEIS: Das Volumen der Aliquots muss an die Studienanforderungen angepasst werden. - Das Serum sofort aufrecht in einer Lagerbox bei -80 °C einfrieren und die Zeit der Probenlagerung aufzeichnen.
- Stellen Sie sicher, dass die Proben innerhalb des erforderlichen Zeitrahmens von 4 Stunden verarbeitet wurden.
2. Plasmapräparation für Flüssigbiopsiestudien
HINWEIS: Die Gesamtzeit für die Ausführung dieses Schritts beträgt 40 Minuten (Abbildung 4).
- Extrahieren Sie 4-10 ml Blut in Röhrchen, die Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthalten. Verarbeiten Sie die Proben innerhalb von 4 Stunden ab dem Zeitpunkt der Entnahme.
- Notieren Sie Uhrzeit und Datum der Probenextraktion und die Betreff-ID in einer entsprechend gestalteten Beispieldatenbank.
- Mit einem Laborkittel, Schutzhandschuhen und einer Brille zentrifugieren Sie das EDTA-Röhrchen bei RT (15 °C-25 °C) für 10 min bei 1.600 (± 150) x g, wobei die maximale Pause angewendet wird.
HINWEIS: Beachten Sie die Anweisungen des Herstellers, wenn Sie andere Auffangrohre verwenden. - Nach der Zentrifugation erscheint der Plasmaüberstand klar und gelblich. Prüfen Sie, ob die Probe Anzeichen einer Hämolyse aufweist (Abbildung 3) und übertragen Sie das Plasma (Überstand) mit einer serologischen Einwegpipette (oder Einweg-Bulbpipette oder p1000-Pipetten mit Filterspitze) in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, ohne die Zellschicht zu stören. Lassen Sie ein kleines Restvolumen des Plasmas über der Zellschicht (ca. 5 mm).
- Wenn eine Hämolyse beobachtet wird, verwerfen Sie die Probe für weitere Analysen. (Abbildung 5). Lesen Sie den Abschnitt zur Fehlerbehebung in der Diskussion, um Hämolyse zu beurteilen.
- Zentrifugieren Sie das Plasma in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen bei RT (15 °C-25 °C) für 10-20 min bei 3.000 (±150) x g. Führen Sie diesen Schritt durch, um alle verbleibenden intakten Blutzellen zu entfernen, die aus dem ersten Zentrifugationsschritt übernommen wurden.
- Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig das Röhrchen aus der Zentrifuge und geben Sie 1-4 ml Plasma mit einer serologischen Einwegpipette (oder Einweg-Birnenpipette oder p1000-Pipetten mit Filterspitze) auf 1-4 ml kryogene Polypropylen-Durchstechflaschen ab. Ein Restvolumen des Plasmas (ca. 0,3 ml oder 7 mm Höhe) muss am Boden des Röhrchens belassen werden, um eine Kontamination des Plasmas mit Blutzellen zu vermeiden (Abbildung 5).
- Sofort das Plasma aufrecht in der Lagerbox bei -80 °C einfrieren und die Zeit der Probenlagerung aufzeichnen. Stellen Sie sicher, dass die Proben innerhalb des erforderlichen Zeitrahmens von 4 Stunden verarbeitet wurden.
- Sammeln Sie die Zellschicht (Buffy Coat) mit einem P1000 und einer gefilterten Spitze und übertragen Sie sie in eine 2-ml-Röhre. Sofort einfrieren und bei -80 °C lagern.
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Ergebnisse
Nach Zentrifugation der Blutröhrchen ohne Antikoagulans erscheint die obere Phase blassgelb und entspricht der Serumfraktion (Abbildung 2). Dieser Bruchteil wird sorgfältig entfernt und zur späteren Analyse aliquotiert.
Hämolyse kann entweder in der Plasma- oder Serumfraktion vorhanden sein, und die obere Phase hat ein rötliches Aussehen, was auf das Vorhandensein und den Grad der Hämolyse hinweist (Abbildung 3).
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Diskussion
Die Flüssigbiopsie hat zahlreiche potenzielle Anwendungen zu verschiedenen Zeiten während der Behandlung von Krebs. Erstens, bei der Diagnose, um molekulare Marker des Tumors zu identifizieren, die auf das Vorhandensein einer potenziellen Tumorläsion hindeuten würden, die klinisch weiter untersucht werden könnte. Zweitens während der Behandlung zur Echtzeitüberwachung der Krankheit, zur Beurteilung der molekularen Reaktion der Behandlung, zur klonalen Evolution und zur Früherkennung von Krankheitsrückfällen oder Behandlu...
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Offenlegungen
Beatriz Bellosillo (BB): BB erhielt Honorare für Referenten, Beratungs- oder Beratungsfunktionen von Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer und BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL erhielt Honorare für Redner-, Beratungs- oder Beratungsfunktionen von Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline und Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT erhielt Honorare für Redner-, Beratungs- oder Beratungsrollen von Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM und ESMO. Javier Hernandez-Losa (JHL): erhielt Honorare für Referenten-, Beratungs- oder Beratungsfunktionen von Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly und Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) berichtet, dass er Forschungsstipendien im Zusammenhang mit dieser Studie von Novartis und Forschungsstipendien, die nichts mit dieser Studie zu tun haben, von AstraZeneca und Beigene erhalten hat. Die übrigen Autoren haben keine Angaben zum Manuskript.
Danksagungen
Wir danken dem Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC) für die Unterstützung und den folgenden Projektzuschuss: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC Plattform zur Standardisierung und Förderung der Flüssigbiopsie. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL Eppendorf Röhrchen | Eppendorf | 0030 120.086 | Alle Standardröhrchen/-geräte können verwendet werden |
| 10 mL serologische Einwegpipetten | BIOFIL | GSP010010 | Alle Standardröhrchen/-geräte können verwendet werden |
| 10 mL Vacutainer K2 EDTA Röhrchen | Becton Dickinson | 367525 | Diese Röhrchen können für die Plasmaentnahme verwendet werden |
| 15 mL Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen | BIOFIL | CFT411150 | Alle Standardröhrchen/-geräte können verwendet werden |
| 3,5 mL BD Vacutainer-Röhrchen ohne Antikoagulans | Becton Dickinson | 368965 | Entweder 8,5 oder 3,5 mL Röhrchen können für die Serumentnahme verwendet werden |
| 4 mL Kryo-Fläschchen aus Polypropylen, runder Boden, selbststehendes | Corning | 430662 | Alle Standardröhrchen/-geräte können verwendet werden |
| 4 mL Vacutainer K2 EDTA-Röhrchen | Becton Dickinson | 367864 | Diese Röhrchen können für die Plasmaentnahme verwendet werden |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Es stehen mehrere Quantifizierungsmethoden zur Verfügung, die spezifisch für cfDNA |
| 5 mL serologische Einwegpipetten | BIOFIL | GSP010005 | verwendet werden Alle Standardröhrchen/-geräte können verwendet werden |
| 8,5 mL BD Vacutainer-Röhrchen ohne Antikoagulans | Becton Dickinson | 366468 | Für die Serumentnahme können entweder 8,5- oder 3,5-ml-Röhrchen verwendet werden |
| Zentrifuge, fähig zu ~3000 x g mit einem Ausschwingrotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Alle Standardrohre/-geräte können verwendet werden |
| Gefrierschrank-Aufbewahrungsboxen für 1– 4 mLkryo-Fläschchen | Corning | 431120 | Diese Boxen werden benötigt, wenn 4-ml-Fläschchen zur Aufbewahrung |
| verwendet werden p1000 Pipettenspitzen | CORNING | 4809 | Alle Standardröhrchen/-geräte können verwendet werden |
| QIAamp Zirkulierendes Nukleinsäure-Kit | Qiagen | 55114 | Jedes im Handel erhältliche Kit, das spezifisch für die cfDNA-Isolierung ist, kann mit diesem Blutaufbereitungsprotokoll verwendet werden. |
| Streck Zellfreie DNA BCT CE-Röhrchen 10 mL | Streck | 218997 | Diese Röhrchen können für die Plasmaentnahme verwendet werden |
| Temperatur Gefrierschrank (-80 ° C) | ESCO | 2180104 | Es können alle Standardrohre/-geräte verwendet werden |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
