Methodenartikel

Ein standardisiertes präanalytisches Flüssigbiopsieprotokoll für nachgeschaltete zirkulatorfreie DNA-Anwendungen

DOI:

10.3791/64123

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16. September 2022

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1The Liquid Biopsy and Biomarker Working Module, the Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Flüssigbiopsie hat unseren Ansatz für translationale Onkologiestudien revolutioniert, wobei die Probenentnahme, -qualität und -lagerung entscheidende Schritte für ihre erfolgreiche klinische Anwendung sind. Hier beschreiben wir ein standardisiertes und validiertes Protokoll für nachgelagerte zirkulatorfreie DNA-Anwendungen, das in den meisten translationalen Forschungslabors angewendet werden kann.

Zusammenfassung

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Der Begriff Liquid Biopsy (LB) bezieht sich auf Moleküle wie Proteine, DNA, RNA, Zellen oder extrazelluläre Vesikel im Blut und anderen Körperflüssigkeiten, die aus dem Primär- und / oder metastasierenden Tumor stammen. LB hat sich zu einer tragenden Säule in der translationalen Forschung entwickelt und hat begonnen, Teil der klinischen Onkologiepraxis zu werden, die eine minimal-invasive Alternative zur soliden Biopsie bietet. Das LB ermöglicht die Echtzeitüberwachung eines Tumors über eine minimal-invasive Probenextraktion, wie z.B. Blut. Die Anwendungen umfassen die Krebsfrüherkennung, die Nachsorge von Patienten zur Erkennung des Krankheitsverlaufs, die Beurteilung der minimalen Resterkrankung und die mögliche Identifizierung der molekularen Progression und des Resistenzmechanismus. Um eine zuverlässige Analyse dieser Proben zu erreichen, die in der Klinik gemeldet werden kann, sollten die präanalytischen Verfahren sorgfältig abgewogen und strikt befolgt werden. Probensammlung, -qualität und -speicherung sind entscheidende Schritte, die ihre Nützlichkeit in nachgelagerten Anwendungen bestimmen. Hier stellen wir standardisierte Protokolle aus unserem Flüssigbiopsie-Arbeitsmodul zur Entnahme, Verarbeitung und Lagerung von Plasma- und Serumproben für die nachgeschaltete Flüssigbiopsieanalyse auf Basis zirkulierender DNA vor. Die hier vorgestellten Protokolle erfordern eine Standardausrüstung und sind flexibel genug, um in den meisten Laboratorien, die sich auf biologische Verfahren konzentrieren, angewendet zu werden.

Einleitung

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Der Begriff "Flüssigbiopsie" wurde 20101 als das Vorhandensein von Molekülen (z. B. Protein, Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA)), Zellen oder extrazellulären Vesikeln (z. B. Exosomen) im Blut und anderen Körperflüssigkeiten definiert, die aus dem Primärtumor stammen. Die Verwendung von Flüssigbiopsieproben hat die translationale onkologische Forschung revolutioniert, da Gewebebiopsien, die zu einem bestimmten Zeitpunkt auf eine bestimmte Region beschränkt sind, aufgrund der Tumorheterogenität relevante Klone übersehen können. Darüber hinaus spielt die Flüssigbiopsie eine relevante Rolle bei Tumorarten, bei denen Primärgewebe k....

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Protokoll

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Die vorherige ethische Genehmigung wurde von den teilnehmenden Zentren vor der Entnahme von Blutproben eingeholt. Die folgenden Protokolle zur Serum- und Plasmaisolierung wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Grundsätzen für die biomedizinische Forschung durchgeführt.

HINWEIS: Vorherige Überlegungen vor Beginn des Protokolls finden Sie hier. Für die Verwendung menschlicher Proben in der biomedizinischen Forschung ist eine vorherige ethische Genehmigung mit der entsprechenden Einverständniserklärung erforderlich. Für die Handhabung von Blutproben ist eine Biosicherheitskabine der Klasse II erforderlich. Ein Laborkittel, Schutzhandschuh....

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Ergebnisse

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Nach Zentrifugation der Blutröhrchen ohne Antikoagulans erscheint die obere Phase blassgelb und entspricht der Serumfraktion (Abbildung 2). Dieser Bruchteil wird sorgfältig entfernt und zur späteren Analyse aliquotiert.

Hämolyse kann entweder in der Plasma- oder Serumfraktion vorhanden sein, und die obere Phase hat ein rötliches Aussehen, was auf das Vorhandensein und den Grad der Hämolyse hinweist (Abbildung 3).

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Diskussion

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Die Flüssigbiopsie hat zahlreiche potenzielle Anwendungen zu verschiedenen Zeiten während der Behandlung von Krebs. Erstens, bei der Diagnose, um molekulare Marker des Tumors zu identifizieren, die auf das Vorhandensein einer potenziellen Tumorläsion hindeuten würden, die klinisch weiter untersucht werden könnte. Zweitens während der Behandlung zur Echtzeitüberwachung der Krankheit, zur Beurteilung der molekularen Reaktion der Behandlung, zur klonalen Evolution und zur Früherkennung von Krankheitsrückfällen oder Behandlu.......

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Offenlegungen

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Beatriz Bellosillo (BB): BB erhielt Honorare für Referenten, Beratungs- oder Beratungsfunktionen von Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer und BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL erhielt Honorare für Redner-, Beratungs- oder Beratungsfunktionen von Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline und Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT erhielt Honorare für Redner-, Beratungs- oder Beratungsrollen von Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM und ESMO. Javier Hernandez-Losa (JHL): erhielt Honorare für Referenten-, Beratungs- oder Beratungsfunktionen von Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly und Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) berichtet, dass er Forschungsstipendien im Zusammenhang mit dieser Studie von Novartis und Forschungsstipendien, die nichts mit dieser Studie zu tun haben, von AstraZeneca und Beigene erhalten hat. Die übrigen Autoren haben keine Angaben zum Manuskript.

Danksagungen

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Wir danken dem Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC) für die Unterstützung und den folgenden Projektzuschuss: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC Plattform zur Standardisierung und Förderung der Flüssigbiopsie. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL Eppendorf RöhrchenEppendorf0030 120.086Alle Standardröhrchen/-geräte können verwendet werden
10 mL serologische EinwegpipettenBIOFILGSP010010Alle Standardröhrchen/-geräte können verwendet werden
10 mL Vacutainer K2 EDTA RöhrchenBecton Dickinson367525Diese Röhrchen können für die Plasmaentnahme verwendet werden
15 mL Zentrifugenröhrchen aus PolypropylenBIOFILCFT411150Alle Standardröhrchen/-geräte können verwendet werden
3,5 mL BD Vacutainer-Röhrchen ohne AntikoagulansBecton Dickinson368965Entweder 8,5 oder 3,5 mL Röhrchen können für die Serumentnahme verwendet werden
4 mL Kryo-Fläschchen aus Polypropylen, runder Boden, selbststehendesCorning430662Alle Standardröhrchen/-geräte können verwendet werden
4 mL Vacutainer K2 EDTA-RöhrchenBecton Dickinson367864Diese Röhrchen können für die Plasmaentnahme verwendet werden
4200 TapeStation SystemAgilentG2991BAEs stehen mehrere Quantifizierungsmethoden zur Verfügung, die spezifisch für cfDNA
5 mL serologische EinwegpipettenBIOFILGSP010005verwendet werden Alle Standardröhrchen/-geräte können verwendet werden
8,5 mL BD Vacutainer-Röhrchen ohne AntikoagulansBecton Dickinson366468Für die Serumentnahme können entweder 8,5- oder 3,5-ml-Röhrchen verwendet werden
Zentrifuge, fähig zu ~3000 x g mit einem AusschwingrotorThermo Fisher ScientificSorvall ST 16   10688725Alle Standardrohre/-geräte können verwendet werden
Gefrierschrank-Aufbewahrungsboxen für 1– 4 mLkryo-FläschchenCorning431120Diese Boxen werden benötigt, wenn 4-ml-Fläschchen zur Aufbewahrung
verwendet werden p1000 PipettenspitzenCORNING4809Alle Standardröhrchen/-geräte können verwendet werden
QIAamp Zirkulierendes Nukleinsäure-KitQiagen55114Jedes im Handel erhältliche Kit, das spezifisch für die cfDNA-Isolierung ist, kann mit diesem Blutaufbereitungsprotokoll verwendet werden.
Streck  Zellfreie DNA BCT CE-Röhrchen 10 mLStreck218997Diese Röhrchen können für die Plasmaentnahme verwendet werden
Temperatur Gefrierschrank (-80 ° C)ESCO2180104Es können alle Standardrohre/-geräte verwendet werden

Referenzen

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  1. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
  2. Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

BlutprobenverarbeitungPlasmainsolierungSerumgewinnungH molyse DetektionProbenlagerungZentrifugationsprotokollOnkologieforschung

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