Bildgebung von CD19+ B-Zellen in einem experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Mausmodell mit Positronen-Emissions-Tomographie

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird die Methodik zur radioaktiven Markierung eines humanspezifischen monoklonalen Anti-CD19-Antikörpers beschrieben und erläutert, wie er zur Quantifizierung von B-Zellen im zentralen Nervensystem und in peripheren Geweben eines Mausmodells für Multiple Sklerose unter Verwendung von In-vivo-PET-Bildgebung, Ex-vivo-Gamma-Zählung und Autoradiographie-Ansätzen verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Multiple Sklerose (MS) ist die häufigste demyelinisierende Erkrankung des Zentralnervensystems (ZNS) bei jungen Erwachsenen, die im weiteren Verlauf der Erkrankung häufig zu neurologischen Defiziten und Behinderungen führt. B-Lymphozyten spielen eine komplexe und entscheidende Rolle in der MS-Pathologie und sind das Ziel mehrerer Therapeutika in klinischen Studien. Derzeit gibt es keine Möglichkeit, Patienten für spezifische Anti-B-Zell-Therapien genau auszuwählen oder die Auswirkungen dieser Behandlungen auf die B-Zell-Last im ZNS und in peripheren Organen nicht-invasiv zu quantifizieren. Die Bildgebung der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) hat ein enormes Potenzial, hochspezifische, quantitative Informationen über die räumlich-zeitliche Verteilung und Belastung von B-Zellen in lebenden Probanden zu liefern.

Diese Arbeit berichtet über Methoden zur Synthese und Verwendung eines PET-Tracers, der spezifisch für humane CD19⁺ B-Zellen ist, in einem etablierten B-Zell-gesteuerten Mausmodell der MS, der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), die mit dem humanen rekombinanten Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein 1-125 induziert wird. Hier werden optimierte Techniken zum Nachweis und zur Quantifizierung von CD19⁺ B-Zellen im Gehirn und Rückenmark mittels In-vivo-PET-Bildgebung beschrieben. Darüber hinaus werden in dieser Arbeit optimierte Methoden für die ex vivo Gamma-Zählung von krankheitsrelevanten Organen, einschließlich Knochenmark, Rückenmark und Milz, zusammen mit einer hochauflösenden Autoradiographie der CD19-Tracerbindung in ZNS-Geweben vorgestellt.

Einleitung

MS ist eine immunvermittelte neurologische Erkrankung; Das einzigartige Erscheinungsbild bei jedem Patienten kann das Management sowohl für Patienten als auch für Ärzte zu einer Herausforderung machen¹. Die Krankheit selbst ist gekennzeichnet durch das Vorhandensein von demyelinisierenden Läsionen und die Infiltration von Immunzellen im Gehirn und Rückenmark, was zu körperlichen und kognitiven Beeinträchtigungen führt². Das traditionelle Paradigma, dass MS eine T-Zell-vermittelte Erkrankung ist, wurde erstmals in einer wegweisenden klinischen Phase-II-Studie mit Rituximab³ in Frage gestellt, einer Therapie, die auf die CD20⁺ -Untergruppe der B-Zellen abzielt. Seitdem wurden weitere B-Zell-Therapien entwickelt, die auf CD19⁴ abzielen, einen Pan-B-Zell-Biomarker, der auf einem breiteren Spektrum von B-Zellen exprimiert wird, was sowohl diagnostisch als auch therapeutisch vorteilhaft sein kann. Darüber hinaus bieten die bestehenden Methoden zur Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlung (d. h. die Überwachung der Anzahl der Schübe und der Aktivität der Magnetresonanztomographie [MRT]) keine frühzeitigen Messungen des Ansprechens, wodurch die Patienten aufgrund einer suboptimalen Therapieauswahl und -optimierung einem erheblichen Risiko für ZNS-Schäden ausgesetzt sind. Daher besteht ein dringender Bedarf an Strategien zur Überwachung spezifischer Immunzellen, wie z. B. CD19⁺ B-Zellen, in Echtzeit im ZNS und in der Peripherie von MS-Patienten.

Die PET-Bildgebung ist ein robustes Bildgebungsverfahren , das eine In-vivo-Ganzkörpervisualisierung eines bestimmten Ziels von Interesse, wie z. B. CD19, ermöglicht. Während Blutentnahmen, Aufzeichnungen von Rückfallraten und die Überwachung von Läsionen mittels MRT Momentaufnahmen der Wirksamkeit der Behandlung liefern, kann die PET-Bildgebung es Forschern und Klinikern ermöglichen, die Wirksamkeit einer Therapie im gesamten Körper zu überwachen. Dieser proaktive Ansatz zur therapeutischen Überwachung ermöglicht es Ärzten, die Wirksamkeit von Medikamenten in Echtzeit zu beurteilen und bei Bedarf schnelle Anpassungen zu ermöglichen. Die Überwachung der Lokalisation und Dichte von Zellpopulationen, die mit einer Erkrankung assoziiert sind, ermöglicht auch eine longitudinale Beurteilung des Schweregrads anhand patientenspezifischer anatomischer Informationen. Daher ist es unerlässlich, reproduzierbare Analysemethoden zu etablieren, um das volle Potenzial der PET-Bildgebung im klinischen und präklinischen Umfeld zuverlässig auszuschöpfen.

In dieser Arbeit werden Methoden (Abbildung 1) zur Durchführung von PET-Bildgebung, Ex-vivo-Gammazählung und Autoradiographie (ARG) von CD19⁺ B-Zellen mit einem 64 Cu-markierten monoklonalen anti-humanen CD19-Antikörper (mAb), bekannt als 16C4-TM (⁶⁴Cu-hCD19-mAb), im experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE)-Mausmodell der MS beschrieben, das in transgenen Mäusen induziert wurde, die humanes CD19 (hCD19) unter Verwendung des humanen rekombinanten Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteins 1-125 (MOG_1-125). Wir stellen auch Methoden zur Verfügung, um die Radiotracer-Bindung im Gehirn und Rückenmark genau und reproduzierbar zu beurteilen, beides kritische Orte der Pathogenese, die in diesem und anderen neurodegenerativen Modellen oft stark betroffen sind. Diese Techniken ermöglichen eine nicht-invasive Untersuchung der Rolle von B-Zellen in der Krankheitspathologie und haben das Potenzial, klinisch übertragen zu werden, um die Wirksamkeit von Anti-B-Zell-Therapien bei MS zu bewerten.

Protokoll

Abbildung 1: Studiendesign. In diesem Artikel finden Sie einen Überblick über die wichtigsten Techniken. (A) Wenn die Mäuse auf dem Rücken in das Scanbett gelegt werden, wird die Bewegung in der Wirbelsäule reduziert. (B) PET/CT-Bildgebung der Mäuse. (C) Machen Sie einen Schnitt entlang der Rückenseite des Tieres, um die Wirbelsäule freizulegen. (D) Halbieren Sie die Wirbelsäule in zervikale/thorakale und lumbale Anteile und entfernen Sie die Abschnitte nach den fünf angegebenen Schnitten. (E) Verwenden Sie eine Spritze, um das Rückenmark aus der Wirbelsäule zu entfernen, indem Sie eine Abdichtung mit der Spritze und der Wirbelsäule herstellen und die kranialen und kaudalen Enden der Wirbelsäule wie gezeigt spülen. (F) Isolierte zervikale/thorakale und lumbale Rückenmarkssegmente. Abkürzung: PET/CT = Positronen-Emissions-Tomographie/Computertomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Alle Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit dem Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) an der Stanford University durchgeführt, einem Programm, das von der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC International) akkreditiert ist. Die Mäuse wurden vor Beginn der Studie mindestens 7 Tage lang an das Vivarium akklimatisiert, um den Stress für die Mäuse zu minimieren, da Stress die EAE-Induktion beeinträchtigen kann.

1. EAE-Induktion bei weiblichen humanisierten CD19-Mäusen

1. Induzieren Sie humanisierte CD19 C57BL/6J weibliche Mäuse im Alter von 9-13 Wochen mit EAE, wie zuvor beschrieben⁵ unter Verwendung von MOG_1-125.

2. Tierpflege und Scoring im EAE-Mausmodell

1. Bewerten Sie das Fortschreiten der Krankheit und pflegen Sie die Mäuse wie zuvor beschrieben⁵. Kurz gesagt, bewerten Sie dieses Modell auf einer Skala von 1-5 wie folgt: 1 ist Schwanzschwäche/Schlaffheit, 2 ist geschwächte Hintergliedmaßen, 3 ist Hintergliedmaßenlähmung, 4 ist Hintergliedmaßenlähmung mit Vordergliedmaßenschwäche, 5 ist todgeweiht.

3. mAb-Konjugation, Radiomarkierung und Charakterisierung

1. Konjugieren Sie den bifunktionellen Chelator 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäuremono-N-hydroxysuccinimidester (DOTA-NHS-ester) zu hCD19-mAb und markieren Sie ihn mit ⁶⁴Cu.
   1. Tauschen Sie mit einer Entsalzungssäule den hCD19-mAb-Speicherpuffer gegen HEPES-Puffer (pH 8,5-9) aus: Konditionieren Sie die Entsalzungssäule(n) mit HEPES. Berechnen Sie die Anzahl der benötigten Säulen basierend auf der Probenkapazität der Entsalzungssäule und dem erforderlichen mAb-Volumen: 0,5-ml-Röhrchen: 30-130 μl Probenvolumen, 300 μl Waschmittel; 2-ml-Röhrchen: 200-700 μl Probenvolumen, 1 ml Wash.
   2. Kühlen Sie die Zentrifuge für den Pufferaustausch über die Entsalzungskolonne auf 4 °C ab.
   3. Holen Sie die Entsalzungssäule aus dem Kühlschrank. Entfernen Sie den Boden der Entsalzungssäule, lösen Sie die Kappe und legen Sie die Säule in ein Auffangröhrchen.
   4. Bei 1.500 × g 2 min zentrifugieren, um die Lagerlösung zu entfernen; Entsorgen Sie den Durchfluss mit der Aufbewahrungslösung und verwenden Sie das Sammelröhrchen wieder. Markieren Sie auf der Säule eine Linie, an der der höchste Punkt des entsalzten verdichteten Harzes nach oben geneigt ist.
   5. Geben Sie HEPES-Puffer auf die untere Seite der Entsalzungskolonne. Stellen Sie die Entsalzungssäule mit der Linie nach außen in die Zentrifuge; 2 Minuten bei 1.500 × g schleudern. Entsorgen Sie den Durchfluss und verwenden Sie das Sammelröhrchen wieder.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.4 und 3.1.5 2x mit demselben Sammelröhrchen und verwerfen Sie den Durchfluss zwischen den Schritten.
   7. Setzen Sie die konditionierte Entsalzungssäule in ein neues Auffangröhrchen und etikettieren Sie. Dieses Röhrchen enthält das hCD19-mAb.
   8. Geben Sie hCD19-mAb an die Oberseite der konditionierten Entsalzungssäule(n) und verwenden Sie HEPES-Puffer, um die leere mAb-Durchstechflasche zu spülen. Fügen Sie diese oben in die Entsalzungssäule (Gesamtvolumen gemäß Herstellerempfehlung) ein. Bei 1.500 × g 2 min schleudern, um das hCD19-mAb zu eluieren. Bewahren Sie den Durchfluss mit dem hCD19-mAb auf.
   9. Messen Sie die Konzentration von hCD19-mAb mit einem UV/Vis-Spektralphotometer und stellen Sie sie bei Bedarf mit HEPES-Puffer auf 0,5 μg/μl ein.
   10. Zu der hCD19-mAb-Lösung wird 1/50^des Volumens der mAb-Lösung von 0,5 M EDTA hinzugefügt, um die Endkonzentration von EDTA 0,01 M in der hCD19-mAb-Lösung zu erhalten. Lassen Sie die hCD19-mAb-EDTA-Lösung 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
   11. Den DOTA-NHS-Ester aus dem Gefrierschrank nehmen und auf Raumtemperatur kommen lassen (10-15 min). Berechnen Sie das DMSO-Volumen, das dem DOTA-NHS-Ester zugesetzt werden soll, um eine DOTA-Konzentration zu erhalten, die die Zugabe des gewünschten DOTA/mAb-Molverhältnisses ermöglicht (das typischerweise in der Größenordnung von 1-2 DOTA/mAb liegt).
       HINWEIS: Das Volumen von DMSO-DOTA-NHS-Ester, das hCD19-mAb zugesetzt wird, sollte 10% des mAb-Volumens nicht überschreiten. Dies sollte mithilfe einer Tabellenkalkulation erfolgen, damit es schnell und wiederholt erfolgen kann.
   12. Basierend auf dem gewünschten Verhältnis von DOTA zu hCD19-mAb berechnen Sie die Menge an DOTA-NHS-Ester, die zu hCD19-mAb hinzugefügt werden soll.
       nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg DOTA → mg/mL DOTA/DMSO → ml DMSO → Verdünnungsfaktor der DOTA/DMSO-Lösung
   13. Wiegen Sie 1-2 mg des DOTA-NHS-Esters und geben Sie vorsichtig das richtige Volumen (berechnet in Schritt 3.1.11) DMSO in den DOTA-NHS-Ester. Mischen und schleudern.
   14. Das berechnete Volumen der DOTA-NHS-Esterlösung (Schritt 3.1.12) wird in die hCD19-mAb-Lösung pipettiert. Wischen Sie die Außenseite der Pipettenspitze vor der Zugabe ab, um sicherzustellen, dass kein zusätzlicher DOTA-NHS-Ester hinzugefügt wird (ohne die Menge in der Pipette zu verändern). Vorsichtig mischen und schleudern.
   15. Im Kühlschrank (4 °C) über Nacht (12-16 h) einwirken lassen.
2. Reinigung und Konzentration
   1. Die Zentrifuge wird für den Austausch des Zentrifugalkonzentrators auf 4 °C abgekühlt. Legen Sie einen PCR-Röhrchenblock aus Metall auf Trockeneis, um das Konjugat einzufrieren.
   2. Die DOTA-hCD19-mAb-Reaktion aus dem Kühlschrank nehmen und durch Zugabe von TRIS-Puffer in biologischer Qualität abschrecken: 10 % des gesamten Reaktionsvolumens. Entnehmen Sie 10-20 μg der Probe für die massenspektrometrische Analyse.
   3. Die Entsalzungskolonne(n) wird wie oben beschrieben (Schritte 3.1.1-3.1.5) mit 0,1 M Ammoniumacetatpuffer und pH 5,5 konditioniert.
   4. Die DOTA-hCD19-mAb-Lösung wird durch Puffer gegen Ammoniumacetat ausgetauscht (Schritte 3.1.1-3.1.8).
   5. DOTA-hCD19-mAb-Lösung konzentrieren: Geben Sie die Lösung in einen Zentrifugalkonzentrator mit 50 kDa Molekulargewicht gemäß den Volumenempfehlungen des Herstellers. Zentrifugieren Sie bei 4.000 × g für 10 Minuten (oder bis das Volumen um 80%-90% reduziert ist); Verwerfen Sie den Durchfluss.
   6. Wiederholen Sie dies neun weitere Male (insgesamt 10): Fügen Sie genügend Ammoniumacetat hinzu, um das Volumen wieder auf das maximal empfohlene Volumen zu bringen.
      HINWEIS: Die Gesamtmenge sollte dem entsprechen, was ursprünglich hinzugefügt wurde, einschließlich dessen, was in der Säule verbleibt, normalerweise 400-450 μl für einen Zentrifugalkonzentrator mit einer Kapazität von 500 μl.
      1. Spülen Sie die Durchstechflasche mit Ammoniumacetatpuffer, um alle DOTA-hCD19-mAb-Reste zu entfernen. Geben Sie das Waschmittel in den Zentrifugalkonzentrator.
      2. Bei 4.000 × g 10 min zentrifugieren.
         HINWEIS: Die Schleuderzeit kann bei nachfolgenden Drehungen verkürzt werden, wenn das Volumen in kürzerer Zeit auf 80%-90% reduziert wird.
   7. Entnehmen Sie die Proteinlösung aus dem Zentrifugalkonzentrator. Beachten Sie das Gesamtvolumen des DOTA-hCD19-mAb.
      1. In Zentrifugalkonzentrator 2 so viel Ammoniumacetatpuffer für ein Gesamtvolumen von 100 μl zugeben und zum Mischen pipettieren. Verschließen Sie die Zentrifugalkonzentratorsäule und invertieren Sie sie. Bei 4.000 × g 2 Minuten lang schleudern, um die Lösung aufzufangen. In ein neues Röhrchen umfüllen.
      2. Im Zentrifugalkonzentrator 500 wird eine Pipette verwendet, um die mAb-Lösung aus dem Zentrifugalkonzentrator zu sammeln. In eine neue Röhre geben.
   8. Messen Sie die Konzentration mit einem UV-Vis-Spektralphotometer. Wenn die Konzentration mehr als 2 mg/ml beträgt, mit Ammoniumacetat auf 2 mg/ml verdünnen.
   9. Aliquot 100 μg pro PCR-Röhrchen (ca. 50 μl); Beschriften Sie die Röhrchen mit DOTA-hCD19-mAb, Datum, Masse und Konzentration. Drehen Sie die Fläschchen herunter.
   10. DOTA-hCD19-mAb auf dem gekühlten PCR-Block auf Trockeneis einfrieren (oder auf Trockeneis einfrieren). Sobald alle Proben eingefroren sind, legen Sie sie in einen Gefrierschrank bei -80 °C.
   11. Messen Sie die Anzahl der DOTA pro hCD19-mAb mittels Massenspektrometrie. Bewahren Sie eine Probe des unkonjugierten (reinen) Antikörpers von jeder Konjugation auf, um das Verhältnis zu berechnen. Verwenden Sie die unten angegebene Gleichung (1); Das Molekulargewicht wird mit MW abgekürzt.
       (1)
3. Radioaktive Markierung
   HINWEIS: Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) für den Umgang mit Radioaktivität, einschließlich eines Laborkittels, Handschuhen und eines persönlichen Körper- und Ringdosimeters, gemäß den institutionellen Vorschriften. Überprüfen und wechseln Sie die Handschuhe regelmäßig, um eine radioaktive Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie eine Bleiabschirmung und vergrößern Sie den Abstand zur radioaktiven Quelle, indem Sie, wenn möglich, mit einer Zange hantieren.
   1. Übertragen Sie Radioaktivität mit einer Pipette aus der Versanddurchstechflasche in eine neue Durchstechflasche. Messen Sie die Radioaktivität.
   2. Entfernen Sie ein Aliquot für die erste radioaktive Markierungsreaktion. 50 μl Ammoniumacetat (pH 5,5) pro 1 mCi ⁶⁴Cu-CuCl₃ zugeben. Messen Sie den pH-Wert, indem Sie 1 μl auf einen pH-Streifen pipettieren, dessen Bereich 5,5 mit ausreichender Auflösung erfasst, um zwischen 5 und 6 zu unterscheiden.
   3. Wenn der pH-Wert nicht 4-5,5 beträgt, ändern Sie ihn mit 1 M NaOH oder 0,1 M HCl. Fügen Sie kleine Mengen von 1-5 μl 1 M NaOH hinzu, wenn der pH-Wert kleiner als 4 ist, oder 0,1 M HCl, wenn der pH-Wert größer als 5,5 ist, bis der richtige pH-Wert erreicht ist. Bei jeder Zugabe gründlich mischen, herunterschleudern und den pH-Wert wie oben beschrieben messen. Notieren Sie jede Zugabe und Entnahme einer Lösung (einschließlich der Überprüfung des pH-Werts), damit das endgültige Volumen berechnet werden kann.
   4. Sobald der optimale pH-Wert erreicht ist, werden 10 μg DOTA-hCD19-mAb pro 1 mCi ⁶⁴Cu-CuCl₃ zugegeben. Vorsichtig mischen und kurz schleudern.
   5. Stellen Sie das Reaktionsgefäß auf einen Thermomixer, der auf 37 °C und 400 Umdrehungen pro Minute (U/min) eingestellt ist.
   6. Nach 30 Minuten wird die Reaktion gelöscht: Das gesamte Reaktionsvolumen wird durch 50 geteilt und dieses Volumen von 0,5 M EDTA wird dem Reaktionsgemisch zugegeben.
   7. Bestimmen Sie die Markierungseffizienz mit sofortiger Dünnschichtchromatographie (ITLC), um den Prozentsatz an gebundenem und freiem Kupfer in der Lösung zu messen.
      1. Schneiden Sie 1 cm breite Streifen TLC-Papier zu. Markieren Sie 1 cm von der Ober- und Unterseite des Streifens und bereiten Sie ein Röhrchen (50-ml-Konuskolben) mit einer mobilen Phase von weniger als 1 cm 0,1 M Zitronensäure vor (der Gehalt an mobiler Phase sollte unter der 1-cm-Markierung auf dem Streifen liegen, wenn er in das Röhrchen gelegt wird).
      2. Pipettieren Sie 1 μl der Reaktionslösung auf den Streifen an der unteren 1 cm Markierung (Lösungsmittelvorderseite) und legen Sie den Streifen in das Röhrchen. Beobachten Sie, bis die Vorderseite des Lösungsmittels die obere 1-cm-Markierung erreicht, entfernen Sie den Streifen und wickeln Sie ihn in ein Stück Frischhaltefolie.
      3. Legen Sie den Streifen auf die Plattform und führen Sie ihn durch einen Radio-TLC-Imaging-Scanner. Suchen Sie nach dem radioaktiv markierten mAb am Ursprung und den freien ⁶⁴Cu, die sich mit der mobilen Phasenfront bewegen (Abbildung 2). Wenn der prozentuale Anteil an freiem Kupfer weniger als 5 % (95 % Markierungseffizienz) beträgt, fahren Sie mit der Injektion in die Tiere fort. Wenn der Anteil an freiem Kupfer mehr als 5 % beträgt, fahren Sie mit der Reinigung fort.
         HINWEIS: Der prozentuale Anteil an freiem Kupfer hängt im Allgemeinen vom Verhältnis von DOTA-mAb zu ⁶⁴Cu, der Reaktionszeit, dem pH-Wert und der Temperatur ab. Die Reaktionsbedingungen sollten von jedem Anwender für jeden neuen mAb optimiert werden, um konsistente Ergebnisse zu gewährleisten.
4. Aufreinigung über eine Einweg-Schwerkraftsäule in DNA-Qualität
   1. Konditionieren Sie eine Einweg-Schwerkraftflusssäule in DNA-Qualität (Entsalzungs-/Pufferaustauschsäule) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie die Einweg-DNA-Schwerkraftsäule auf einen Ringständer oder ein anderes Instrument hinter einer geeigneten Bleiabschirmung. Stellen Sie sicher, dass das Gerät stabil und leicht beweglich ist. Platzieren Sie das Rohr unter der Säule.
   2. Pipettieren Sie das grobe Reaktionsgemisch auf das Schwerkraft-Säulenharz. Warten Sie, bis die gesamte Flüssigkeit in das Harz geflossen ist. Pipettieren Sie ausreichend PBS, um das gesamte Volumen (Rohprodukt plus PBS) auf 500 μl zu bringen. Entsorgen Sie den Durchfluss.
   3. Platzieren Sie die Säule über 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung 1-10. Geben Sie 1 ml PBS in die Säule. Sammeln Sie fünf Tropfen in jedem Röhrchen, bis der Fluss gestoppt ist.
      HINWEIS: Möglicherweise sind weniger als 10 Röhrchen erforderlich.
   4. Verschließen Sie den Boden der Säule und messen Sie die Restradioaktivität. Messen Sie jede Durchstechflasche mit Durchfluss. Für jedes Fläschchen mit mehr als 50 μCi ist gemäß Schritt 3.3.7 ein ITLC zu erstellen, um das prozentual gebundene Kupfer in jeder Fraktion zu messen.
      HINWEIS: Die ersten ein oder zwei Fraktionen enthalten nur die mobile Phase; das radioaktiv markierte mAb eluiert zuerst (typischerweise die Brüche 2 oder 3 bis 5 oder 6) und die freien ⁶⁴Cu eluieren zuletzt (einige bleiben an der Säule haften). Die prozentual gebundenen ⁶⁴Cu können zwischen den Fraktionen variieren.
   5. Kombinieren Sie die Fraktionen mit einer Bindung von mehr als 95 % (weniger als 5 % freies Kupfer); Verwenden Sie die Injektionslösung. Falls gewünscht, führen Sie eine Größenausschluss-HPLC durch, um die radioaktive Markierung⁵ zu bestätigen und die molare Aktivität zu berechnen. Speichern Sie ein Aliquot, um die Konzentration auf einem UV-Vis-Spektralphotometer zu messen, nachdem es 10 Halbwertszeiten (127 h oder 5,3 Tage) abgelaufen ist.

4. Vorbereitung der Dosis

HINWEIS: Tragen Sie vor der Handhabung der Dosis geeignete PSA, einschließlich Laborkittel, Körper- und Fingerdosimeter und Handschuhe.

1. Injizieren Sie ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb 18-24 Stunden vor der PET-Untersuchung, um eine ausreichende Zirkulation des Radiotracers im Körper zu ermöglichen.
2. Den Bleibehälter mit dem ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb sofort hinter eine Bleiabschirmung stellen. Schalten Sie den Geigerzähler ein, um eine mögliche Kontamination zu überwachen.
   HINWEIS: Wechseln Sie häufig die Handschuhe, wenn Sie mit radioaktivem Material umgehen. Es wird empfohlen, während der Dosierung eine doppelte Behandschuhung zu tragen, um einen schnellen Handschuhwechsel zu ermöglichen. Platzieren Sie kontaminierte scharfe Gegenstände und Müll immer in dem dafür vorgesehenen abgeschirmten Müllbereich.
3. Verdünnen Sie ^{die 64}Cu-DOTA-hCD19-mAb auf eine geeignete Konzentration in einem 1,5-ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen mit geringer Bindung.
   HINWEIS: Das ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb bindet an Kunststoff, wenn es sich nicht um eine geringe Bindung handelt. ⁶⁴Cu bindet sich an Glas.
   1. Verdünnen Sie den Radiotracer in Kochsalzlösung, um eine Radiolyse zu verhindern und die gleichmäßige Dosierung zu vereinfachen.
   2. Bereiten Sie Dosen vor, um nach Möglichkeit zwischen 75 und 150 μCi in 100 μl zu verabreichen. Stellen Sie sicher, dass das maximale injizierte Gesamtvolumen 10 % des Körpergewichts der Maus nicht überschreitet.
4. Verwenden Sie eine 500 μl (50 cc) Insulinspritze, um die Dosis aus dem Kunststoffröhrchen mit geringer Bindung zu entnehmen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen in der Spritze befinden, da sie intravenös injiziert wird.
   1. Beschriften Sie die Spritzen mit den entsprechenden Tiernummern vor.
   2. Zeichnen Sie die Dosisaktivität und -zeit zur Datenanalyse in einem Labornotizbuch auf.
   3. Halten Sie die Dosen für die Injektion bereit, sobald die Tiere katheterisiert sind, um die Zeit unter Narkose zu verkürzen.
5. Nachdem die Dosen vorbereitet wurden, bereiten Sie einen Standard (Phantom) für das Scannen vor, um einen Kalibrierungsfaktor zu generieren.
   1. Füllen Sie ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 50-75 μCi Aktivität, verdünnt in Wasser (oder PBS).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Lösung gründlich gemischt wird. Der Standard kann frei von ⁶⁴Cu sein, die von der Beschriftung übrig bleiben.
      1. Messen Sie den Umfang der Aktivität in der Norm und erfassen Sie die Zeit.

5. Kanülierung und Injektion

ANMERKUNG: Siehe zuvor beschriebene Verfahren 6 für die intravenöse Kanülierung von Mäusen zur Injektion des Radiotracers⁶.

1. Wiegen und bewerten Sie die Mäuse auf den Schweregrad der Erkrankung, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben, bevor Sie die Mäuse in einer mit 1,5-3 % Isofluran gefüllten Knockdown-Box zur Vorbereitung auf die Verabreichung von Radiotracern anästhesieren.
   HINWEIS: Diese Mäuse werden auf dem Labortisch injiziert, nicht auf dem PET-Scanner, wie zuvor beschrieben. Es ist nicht erforderlich, die Katheter für die Injektion zu verkleben, da die Mäuse zwischen Kanülierung und Injektion nicht bewegt werden.
2. Sobald eine Maus kanüliert ist, führen Sie die Nadel in das Ende des Katheters ein und injizieren Sie langsam. Nach der Injektion eine kleine Kochsalzlösung durch den Katheter durchführen, um sicherzustellen, dass die gesamte Dosis injiziert wird.
   HINWEIS: Das Volumen sollte ungefähr dem Totvolumen des Katheters entsprechen, das bei den von den Autoren verwendeten Kathetern 50 μl beträgt.
   1. Injizieren Sie über ein Stück Labortuch, um alle Tropfen von Radiotracer aufzufangen. Berücksichtigen Sie dies bei der Messung der Restdosis.
   2. Notieren Sie den Zeitpunkt der Injektion in einem Labornotizbuch.
3. Entfernen Sie die Kanüle sofort nach der Injektion. Messen Sie die Kanüle, die Dosisspritze und das Gewebe mit einem Dosiskalibrator, um die Restdosis zu bestimmen, die nicht in die Maus injiziert wurde.
   1. Notieren Sie die Aktivität und Zeit in einem Labornotizbuch.
4. Nachdem die Mäuse injiziert wurden, beschriften Sie ihre Käfige mit einer Käfigkarte, die anzeigt, dass die Mäuse radioaktiv sind. Erfassen und protokollieren Sie die Käfige gemäß den institutionellen Richtlinien. Platzieren Sie die Mäuse dann in einem dafür vorgesehenen radioaktiven Haltebereich.

6. PET/CT-Bildgebung

1. Die PET-Bildgebung ist 18-24 Stunden nach der Injektion von ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb durchzuführen. Wiegen und ritzen Sie die Mäuse vor dem Scannen.
   HINWEIS: Die Bedienungsanleitung des Scanners hängt vom verwendeten Scanner ab.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Röntgenkomponente des PET/CT-Scanners aufgewärmt und für die Aufnahme bereit ist.
   2. Öffnen Sie die Erfassungssoftware des PET-Scanners auf dem Computer.
   3. Klicken Sie im Dropdown-Menü " Investigator Login " auf die entsprechenden Laborinformationen.
   4. Erstellen Sie auf der Seite Projekt entweder ein neues Projekt oder wählen Sie ein vorhandenes Projekt aus dem Dropdown-Menü aus.
   5. Wenn die Initialisierungsaufforderung automatisch auf dem Bildschirm angezeigt wird, klicken Sie auf Home Bed und warten Sie, bis das Bett nach Hause kommt. Klicken Sie dann auf CT aufwärmen.
      1. Stellen Sie sicher, dass die CT-Abschirmklappe geschlossen ist, damit sich der CT aufwärmen kann.
2. Während sich der Scanner aufwärmt, ritzen Sie die EAE-Mäuse ein und injizieren Sie ihnen subkutan 0,2-0,4 ml warme Kochsalzlösung in die Flanke, um sie mit Flüssigkeit zu versorgen.
3. Nachdem der Scanner aufgewärmt ist, kehren Sie zum Computer zurück, um die PET-Scans für die Studie einzurichten.
   HINWEIS: Diese können vor dem Tag des Scans eingerichtet werden.
   1. Klicken Sie unter der Überschrift " Aktuelle Studien " auf " Neue Studie erstellen". Füllen Sie den Namen der Studie, das Protokoll, die Verbindung und die Informationen zum Probanden aus.
      1. Wenn Sie eine PET/CT durchführen, wählen Sie zuerst PET-Protokoll und dann CT-Protokoll aus.
         HINWEIS: In der Regel reicht ein Standard-CT aus, um das EAE-Mausmodell zu scannen. Ein CT-Scan ist 1 Minute lang und wird mit Binning bei 2 x 2 bei einer Spannung von 80 kVp, einem Strom von 150 μA und 720 Projektionen aufgenommen. CT-Bilder werden mit einem modifizierten Feldkamp-Algorithmus rekonstruiert.
      2. Wählen Sie für das PET-Protokoll einen 10-15-minütigen statischen 64-Kupfer-Scan. Wenn dieser Scan noch nicht in der Liste der verfügbaren Protokolle enthalten ist, fügen Sie ihn hinzu, indem Sie im Menü Standard , Neues Protokoll erstellen | Dropdown-Menü "Isotope" . Wenn das gewünschte Isotop nicht aufgeführt ist, klicken Sie auf Mehr | Aus der Bibliothek hinzufügen und das gewünschte Isotop hinzufügen. Legen Sie die Scandauer fest, klicken Sie auf das Optionsfeld für Statischer Scan, benennen Sie das Protokoll und klicken Sie auf Speichern.
      3. Kehren Sie zur Registerkarte Studien zurück und fahren Sie fort, alle gewünschten Scans für den Tag zu benennen und einzurichten.
         HINWEIS: Es wird empfohlen, auch einen "CT-Test"-Scan einzurichten, bei dem nur ein Standard-CT verwendet wird, um die Bettpositionierung des ersten Scans zu überprüfen und eine optimale Platzierung zu gewährleisten. Dies sollte der erste Scanlauf für die Studie sein.
4. Sobald der Scanner fertig ist, betäuben Sie die Mäuse in einer Knockdown-Box, um sie auf den Scan vorzubereiten.
   HINWEIS: In diesem Stadium sind die Mäuse wahrscheinlich sehr krank; Es empfiehlt sich, die Zeit unter Narkose zu minimieren.
   1. Tragen Sie Augengel auf.
5. Stellen Sie sicher, dass das Scanbett mit vier Mäusen mit Heizelementen wie Heizkissen oder erhitzter Luft ausgestattet ist, wobei Isofluran auf 1,5 % bis 2 % eingestellt und das Heizkissen eingeschaltet ist (Abbildung 3). Legen Sie die Mäuse in Rückenlage auf das Scanbett.
   1. Mit dem Fortschreiten der EAE-Erkrankung wird die Wirbelsäule der Maus stark gekrümmt. Scannen Sie die Mäuse, während sie auf dem Rücken liegen, um die Wirbelsäule so weit wie möglich zu begradigen und die nachgelagerte Analyse zu verbessern. Ziehe vorsichtig am Schwanz der Maus, um die Wirbelsäule aufzurichten.
6. Sobald Sie sich in Rückenlage befinden, kleben Sie jede Maus mit weichem Mikroskopklebeband fest. Verwenden Sie einen Streifen Klebeband über dem Kopf und einen anderen sanft über dem Bauch, um die Bewegung durch die Atmung zu minimieren.
   1. Notieren Sie in einem Labornotizbuch, welche Maus sich in welcher Scanposition befindet.
7. Sobald die Mäuse gesichert sind, kehren Sie zum Scancomputer zurück, um den Scanner zu bedienen.
8. Öffnen Sie das Menü " Motion-Controller" . Klicken Sie auf PET Center FOV , um die Mäuse auf dem Scanbett in den PET-Ring zu bewegen. Für den ersten Scan des Tages klicken Sie auf CT Center FOV. Sobald Sie in Position sind, führen Sie den CT-Test-Scan durch, um sicherzustellen, dass die Position korrekt ist. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Bettposition zufriedenstellend ist.
   1. Legen Sie ein kleines Stück weißes Klebeband auf das Scanbett, um die richtige Bettplatzierung für den Rest der Studie zu markieren.
9. Sobald das Bett für den PET-Scan aufgestellt ist, starten Sie die Scansequenz, indem Sie auf Ausführen klicken.
   1. Warten Sie, bis sich der Scanner automatisch vom PET-Ring zum CT bewegt.
   2. Kontrollieren Sie immer visuell, ob sich die Tiere sowohl für PET als auch für CT in die richtige Position bewegt haben.
   3. Zeichnen Sie die Startzeit des Scans in einem Labornotizbuch auf, um die Zerfallskorrektur der während der Datenanalyse injizierten Dosis zu korrigieren.
10. Nachdem der Scan abgeschlossen ist, lassen Sie das Bild rekonstruieren. Überprüfen Sie die Daten, bevor Sie die Tiere entfernen.
    HINWEIS: Die Rekonstruktion von 3D-geordneten Teilmengen der Erwartungsmaximierung (OSEM) dauert für einen statischen Scan etwa 5 Minuten.
11. Überprüfen und genehmigen Sie die Daten visuell, wobei Sie die Milz als Positivkontrolle verwenden, da dieses Gewebe eine große Anzahl von B-Zellen enthält. Nehmen Sie die Tiere aus dem Scan-Bett und legen Sie sie in eine mit Isofluran gefüllte Knockdown-Box, um sie auf die Perfusion und die anschließende Dissektion vorzubereiten.
12. Wiederholen Sie die Schritte 6.5-6.12 für die verbleibenden Mäuse in der Studie.
13. Wenn alle Mäuse gescannt sind oder wenn Sie eine Gruppe scannen, die einen freien Platz im Scanbett hat, scannen Sie den in Schritt 4.6 vorbereiteten Standard.

7. Dissektion für Ex-vivo-Gammazählung und Autoradiographie

1. Stellen Sie vor dem Sezieren sicher, dass alle Gammazähl- und Zentrifugenröhrchen vorgewogen wurden.
2. Euthanasie durch Perfusion, wie zuvor beschrieben⁶, mit PBS und Thorakotomie, während die Mäuse tief betäubt sind (kontinuierliche Inhalation von 4 % Isofluran, 2 l/min 100 % O₂).
3. Um das Knochenmark zu entfernen, durchtrennen Sie beide Oberschenkelknochen am Knie und am Becken. Stellen Sie sicher, dass beide Köpfe aus dem Oberschenkelknochen entfernt werden.
   1. Legen Sie beide Oberschenkelknochen in ein 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen, das am Boden ein Loch hat (mit einer 20-G-Nadel) und dessen Deckel abgeschnitten ist.
   2. Legen Sie das 0,5-ml-Röhrchen mit den Oberschenkelknochen in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit abgeschnittenem Deckel.
   3. Platzieren Sie das gesamte Röhrchen-Setup in einer Mini-Zentrifuge. 4 Minuten bei 4.500 × g schleudern.
      HINWEIS: Das Knochenmark sollte durch das Loch im 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen gelöst werden und sich am Boden des 1,5-ml-Zentrifugenröhrchens absetzen.
      1. Trennen Sie die Röhrchen. Wiegen Sie die leeren Oberschenkelknochen im 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Wiegen Sie das Knochenmark im 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Platzieren Sie jedes Zentrifugenröhrchen in Gamma-Zählröhrchen.
4. Entferne das Gehirn mit einer Zange und einer Schere und achte darauf, dass der Hirnstamm intakt bleibt. Lege das Gehirn in ein Gamma-Zählröhrchen. Notieren Sie das Trockengewicht, spülen Sie es mit PBS und lassen Sie es auf Eis, bis es zur Zählung bereit ist.
5. Um das Rückenmark zu entfernen, führen Sie die folgenden Schritte aus.
   1. Entfernen Sie die Haut und das Fell, indem Sie einen Schnitt entlang der Rückenseite des Tieres machen, um die Wirbelsäule freizulegen (Abbildung 1).
   2. Trennen Sie die Lendenwirbelsäule (L) von der Halswirbelsäule (C) und der Brustregion, indem Sie entlang von drei Querebenen um und durch die Wirbelsäule schneiden: an der Basis des Halses (C1-Wirbel) (Abbildung 1D, Nummer 1); an der Basis des Brustkorbs (L1-Wirbel) (Abbildung 1D, Nummer 2); an der Basis des Beckens (L5-Wirbel) (Abbildung 1D, Nummer 3).
   3. Schnitt unter dem Brustkorb (Abbildung 1D, Nummer 2).
   4. Schnitt direkt über dem Kreuzbein, um die Lendenwirbelsäule zu trennen. Schneiden Sie die Wirbelsäule vorsichtig vom Beckenende ab, bis das lumbale Rückenmark sichtbar ist (Abbildung 1D, Nummer 3). Schneiden Sie das umgebende Gewebe ab, um die Lendenwirbelsäule und die Hals-/Brustregion der Wirbelsäule zu isolieren (Abbildung 1D, Nummern 4 und 5).
   5. Um das Rückenmark auszustoßen, verwenden Sie eine mit PBS gefüllte Spritze mit Gleitspitze (3-10 ml). Stellen Sie mit Daumen und Zeigefinger eine Abdichtung zwischen der Spritze und der Wirbelsäule her.
      1. Schieben Sie das PBS vorsichtig durch die Spritze, um das Rückenmark auf eine saugfähige Unterlage zu stoßen (Abbildung 1E). Wiederholen Sie den Vorgang für beide Wirbelsäulenregionen. Legen Sie das Rückenmarksgewebe in ein Gamma-Zählröhrchen.
      2. Notieren Sie das Trockengewicht und fügen Sie PBS hinzu, um sicherzustellen, dass sich das Gewebe am Boden des Röhrchens befindet, um ein Austrocknen zu vermeiden. Lege das Röhrchen auf Eis, bis es zum Zählen bereit ist.
      3. Das zervikale/thorakale Rückenmark aus dem kranialen Ende und das lumbale Rückenmark aus dem kaudalen Ende der Wirbelsäule ausstoßen (Abbildung 1E).

8. Ex-vivo-Gamma-Zählung

1. Öffnen Sie die Gamma-Zähler-Software. Navigieren Sie zur Arbeitsliste und wählen Sie das gewünschte Protokoll aus, z. B. ein 30-s-Zählprotokoll für ⁶⁴Cu.
2. Bereiten Sie mindestens drei Standards in separaten Röhrchen zu. Führen Sie sie jetzt aus, um sie in der Analyse zu verwenden (Schritt 10.2). Ziel ist es, drei replizierte Volumina und Aktivitätsmengen in drei separaten Röhrchen zu erzeugen.
   HINWEIS: Ein Volumen von 500 μl liefert gute Ergebnisse. Während die Aktivität durch das verwendete Gerät bestimmt wird, funktionieren 10 μCi im Allgemeinen gut.
3. Legen Sie die Standards in ein Rack, das mit dem Barcode beschriftet ist, der dem gewünschten Protokoll entspricht. Stellen Sie das Gestell auf den Gamma-Zähler.
4. Nachdem Sie die Orgelgewichte aufgezeichnet haben, legen Sie die Röhren mit den Orgeln auf das Gamma-Zählgestell nach den Röhren mit den Standards.
   HINWEIS: Zu den Organen, die für dieses Modell von Interesse sind, gehören axiale Lymphknoten, Blut, Knochenmark, Gehirn, zervikale Lymphknoten, Oberschenkelknochen, Herz, Leber, lumbales Rückenmark, Muskeln, Milz, Schwanz und zervikales/thorakales Rückenmark.
5. Platzieren Sie ein Gestell mit einem Stopp-Barcode auf der Rückseite des Gamma-Zählers.
6. Drücken Sie die Wiedergabetaste auf dem Computer. Drücken Sie nach Möglichkeit erst dann auf Play , wenn mehrere Racks oder Orgeln ausgeführt werden müssen, damit alle Röhren in einer Datei kontinuierlich gezählt werden können. Stellen Sie sicher, dass sich bei jedem Lauf ein Rack mit einem Stopp-Barcode auf der Rückseite des Gamma-Zählers befindet.
7. Führen Sie den Vorgang aus, bis alle Proben gezählt wurden. Speichern und exportieren Sie die Datei.

9. Ex-vivo-Autoradiographie (ARG) von ZNS-Gewebe

1. Befolgen Sie die zuvor veröffentlichten Schritte für das ARG des Gehirns und des Rückenmarks (wobei die von Chaney et al. beschriebenen Schritte 2-6 ausgeschlossen werden, da den Mäusen bereits Radiotracer aus dem PET-Scan injiziert wurde)⁶.
   HINWEIS: Spezifische Anweisungen zur Vorbereitung der ARG-Kassette für das Rückenmark finden Sie hier⁶.
2. Nachdem die Gamma-Zählung für das Lenden- und Hals-/Brustmark abgeschlossen ist, legen Sie die Schläuche sofort auf Eis, bis das gesamte ZNS-Gewebe gezählt wurde.
   HINWEIS: Beziehen Sie sich auf die zuvor veröffentlichte Methode für ARG des Gehirns⁶.
3. Kippen Sie die Schläuche vorsichtig, damit das Rückenmark auf eine saugfähige Unterlage fallen kann. Wenn das Rückenmark an der Seite des Schlauchs klebt, spülen Sie vorsichtig mit kaltem PBS und kippen Sie den Schlauch erneut. Trocknen Sie jedes Rückenmark vorsichtig ab, indem Sie es vorsichtig mit einem Laborgewebe abtupfen. Legen Sie das getrocknete Rückenmark geordnet auf ein dickes schwarzes Blatt Papier.
   1. Beschriften Sie neben dem Rückenmark mit einem weißen Stift zur einfachen Identifizierung.
   2. Lassen Sie an den Ecken und in der Mitte des schwarzen Papiers Platz, um Stapel von drei Objektträgern zu platzieren, die als Abstandshalter dienen, um die Kompression des Rückenmarks zu verhindern, wenn die ARG-Kassette geschlossen ist. Verwenden Sie 5-7 Stapel.
4. Sobald das gesamte Lenden- und Hals-/Brustmark auf dem schwarzen Papier positioniert und beschriftet ist, legen Sie das Stück Papier vorsichtig in die ARG-Kassette. Legen Sie die geöffnete Kassette auf eine Schale mit Trockeneis, um das Rückenmark einzufrieren.
5. Legen Sie nach dem Einfrieren vorsichtig eine Plastikfolie zwischen den digitalen Phosphorspeicherbildschirm und das Rückenmark und legen Sie den Bildschirm auf die Proben. Verschließen Sie die Kassette sofort und legen Sie sie für ca. 10 Halbwertszeiten (~127 h) in den Gefrierschrank bei -20 °C.
6. Wenn die Belichtungszeit abgelaufen ist, scannen Sie den Film mit einem Phosphor-Imager. Analysieren Sie das resultierende digitale Bild (Anweisungen finden Sie in Abschnitt 12).

10. Analyse der Bioverteilungsdaten

1. Richten Sie eine "Dosiskorrektur"-Tabelle ein, um die Zeitkorrektur für den radioaktiven Zerfall mathematisch zu bestimmen und so die Strahlendosis zu normalisieren und Vergleiche zwischen Probanden zu ermöglichen.
   1. Korrigieren Sie alle Dosen auf die Injektionszeit unter Berücksichtigung der Restaktivität, die nach der Injektion in der Spritze und im Katheter verbleibt.
   2. Berechnen Sie unter Verwendung der in Schritt 8.2 vorbereiteten Standards den Mittelwert der Aktivitätsmenge (μCi) und der normalisierten Anzahl pro Minute (CPM). Teilen Sie den durchschnittlichen CPM durch den durchschnittlichen Standardaktivitätsbetrag, um CPM/μCi zu erhalten.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Aktivitätsbetrag für jeden Standard bis zu dem Zeitpunkt abklingkorrigiert wird, zu dem der Gamma-Zähler den CPM der Standards zählt. Der Gamma-Zähler sollte alle CPM-Werte auf die Startzeit des Protokolls normalisieren.
2. Richten Sie die Tabelle "Ergebnisse" ein, um die endgültige prozentuale injizierte Dosis pro Gramm Gewebe (%ID/g) für jede Probe zu berechnen.
   1. Korrektur des normalisierten CPM vom Gamma-Zähler für jede Probe, die bis zur Injektionszeit des Tieres gezählt wird.
      HINWEIS: Die Abklingkorrektur kann zu einem beliebigen Zeitpunkt erfolgen. Stellen Sie sicher, dass alle Dosen und CPM-Werte auf den gleichen Zeitpunkt korrigiert werden.
   2. Normalisieren Sie den zerfallskorrigierten CPM auf die Masse jeder Probe, um den CPM pro Probe zu bestimmen. Berechnen Sie den gesamten injizierten CPM, indem Sie den CPM im Schwanz vom berechneten injizierten CPM subtrahieren.
      HINWEIS: Der Schwanz muss nicht massenkorrigiert werden, da dieser CPM-Wert einfach vom gesamten injizierten CPM abgezogen wird, um extravenösen Tracer aus der Injektion zu berücksichtigen.
   3. Dividieren Sie den CPM pro Masse durch den gesamten eingespritzten CPM, um %ID/g zu berechnen.
3. Richten Sie eine "Zusammenfassung"-Tabelle ein, um die Endergebnisse für die Eingabe in eine Grafiksoftware und die anschließende Datenvisualisierung und statistische Analyse anzuzeigen.

11. PET-Bildanalyse

1. Öffnen Sie die PET-Analysesoftware. Lick auf Datei |Lokale Daten öffnen | DICOM. Suchen Sie die gewünschte Datei (DICOM-Format). Öffnen Sie sowohl das PET als auch das CT.
2. Stellen Sie im Datenmanager den PET- und CT-Kontrast auf die gewünschten Werte ein.
3. Registrieren und beschneiden Sie einzelne Mäuse.
   1. Wählen Sie im Navigationsmenü die Registerkarte Neuorientierung/Registrierung aus.
   2. Wechseln Sie auf dieser Registerkarte zum Menü Starr. Legen Sie den CT-Scan (0) als festen Scan und den PET-Scan (1) als bewegten Scan fest.
   3. Wählen Sie " Starre Transformation" und " Schnelle Qualität" . Klicken Sie auf Registrieren.
   4. Nachdem die Registrierung abgeschlossen ist (5-10 min), klicken Sie auf das Häkchen , um die Registrierung zu speichern.
   5. Überprüfen Sie die Daten visuell, um sicherzustellen, dass die Registrierung erfolgreich war. Exportieren Sie die Sitzung, indem Sie auf Datei | Sitzung | Exportieren.
   6. Als nächstes schneiden Sie jede Maus in einem Ganzkörperausschnitt zu: Gehen Sie zum Navigationsmenü und klicken Sie auf Zuschneiden. Ziehen Sie die Seiten jedes Querschnitts von der äußeren Kante nach innen.
   7. Sobald die gewünschte Maus eng zugeschnitten ist, klicken Sie auf das Häkchen und exportieren Sie die Sitzung, um sie zu speichern.
   8. Als Nächstes schneiden und begradigen Sie die Köpfe jeder Maus für die Gehirnanalyse mit der manuellen Verschiebung, Rotationen und Spiegelungen im Menü Registrierung/Neuausrichtung . Exportieren, um zu speichern.
4. Analysiere das Rückenmark.
   1. Um mit der Analyse von Regions of Interest (ROIs) im Rückenmark zu beginnen, öffnen Sie das 3D-ROI-Tool über das Navigationsmenü .
   2. Verwenden Sie unter der Überschrift ROIs das Pluszeichen am unteren Rand des Menüs, um sechs ROIs zu erstellen: Lumbaler ROI, Zervikaler/Thorakaler ROI, Lendenskelett, Thoraxskelett, Lendenwirbelsäule, Brustmark.
      HINWEIS: Die lumbalen und zervikalen/thorakalen ROIs sind verallgemeinerte große ROIs, die zur Erstellung der Skelett-ROIs verwendet werden (Abbildung 4).
   3. Um visuelle Störungen durch das PET-Signal bei diesem Schritt zu vermeiden, klicken Sie auf F3 , um das PET auszuschalten.
   4. Wechseln Sie zum Anfang des 3D-ROI-Werkzeug-Operators. Klicken Sie auf den durchgezogenen Punkt rechts neben dem Cursorsymbol, um den 3D-Malmodus und das Menü Erodieren/Erweitern zu öffnen.
   5. Wählen Sie Kugel aus und ändern Sie die Größe auf 20 Pixel. Legen Sie "Dilatieren " auf +5 fest.
      1. Bevor Sie fortfahren, gehen Sie zum Ende des Menüs. Stellen Sie sicher, dass der ROI für die Lendenwirbelsäule ausgewählt ist, da dies der erste ROI ist, der gezeichnet wird.
   6. Auf dem CT finden Sie den L6-Wirbel der Wirbelsäule (wo die Wirbelsäule auf die Hüfte trifft). Beginnen Sie einen Wirbel oberhalb von L6 und zeichnen Sie einen groben ROI Lumbaler ROI über die fünf Wirbel über den Hüften (L1-L5 Wirbel). Wechseln Sie dann zum zervikalen/thorakalen ROI und verfolgen Sie den Rest der Wirbelsäule bis zur Schädelbasis.
      HINWEIS: Dies muss nicht präzise sein, da es verwendet wird, um anzugeben, wo die Otsu-Schwellenwerte in Schritt 11.4.8 auftreten sollen.
   7. Nachdem Sie die verallgemeinerten ROIs gezeichnet haben, gehen Sie zum Anfang des Operators. Wählen Sie das Menü Segmentierungsalgorithmen aus.
   8. Wählen Sie im Dropdown-Menü die Option Otsu-Schwellenwert aus. Wählen Sie für die Eingabe Lumbaler ROI aus. Vergewissern Sie sich, dass unten im Menü die Option Lendenskelett ausgewählt ist. Vergewissern Sie sich, dass im Dropdown-Menü neben Bild der CT-Scan ausgewählt ist, und klicken Sie auf Übernehmen. Wiederholen Sie den Vorgang für den zervikalen/thorakalen ROI und das thorakale Skelett.
      1. Wenn der Otsu-Schwellenwert die Wirbelsäule nicht ausreichend hervorhebt, verwenden Sie den globalen Schwellenwert und ändern Sie den Min-Wert auf 350 und den Max-Wert auf 3.500 für die manuelle Schwellenwertbestimmung und passen Sie ihn nach Bedarf an, um die Wirbel zu isolieren.
   9. Nachdem Sie die Skelett-ROIs mithilfe von Otsu Thresholding erstellt haben, kehren Sie zum Navigationsmenü (Cursorsymbol) zurück. Löschen oder markieren Sie die Spalte H (ausblenden) sowohl für die groben lumbalen als auch für die zervikalen/thorakalen ROIs , um sie auszublenden. Aktivieren Sie die Spalte I (unveränderlich) für beide Skelett-ROIs, damit sie nicht bearbeitet werden können.
   10. Kehren Sie abschließend zum Anfang des 3D-ROI-Tool-Operators zurück und gehen Sie zum Menü 3D-Malen , um die ROIs für das Rückenmark zu zeichnen.
       1. Wählen Sie das Kugelwerkzeug erneut aus und zeichnen Sie das Rückenmark innerhalb des Skeletts sowohl für die Lendenwirbelsäule als auch für die Brustmuskulatur nach, um sicherzustellen, dass die richtige ROI am unteren Rand des Menüs ausgewählt ist.
       2. Um eine ROI zu löschen , klicken Sie auf Command/Control und zeichnen Sie über das zu löschende Teil.
       3. Überprüfen Sie den ROI des Rückenmarks von allen drei Ebenen, um sicherzustellen, dass kein ROI außerhalb der Wirbelsäule gezeichnet wird.
5. Exportieren Sie die Ergebnisse der Rückenmarksanalyse.
   1. Wenn das PET-Signal in Schritt 11.4.3 ausgeschaltet wurde, drücken Sie F3 , nachdem die Rückenmark-ROIs gezeichnet wurden, um die PET wieder einzuschalten, oder wählen Sie den Visual Controller (VC) aus und klicken Sie auf die PET-Leiste.
   2. Gehen Sie zurück zum Navigationsmenü (Cursorsymbol). Klicken Sie auf das Rastersymbol , um die Tabelle anzuzeigen. Kopieren Sie die Tabelle in eine Tabellenkalkulationssoftware und speichern Sie sie.
   3. Zum Schluss exportieren Sie die Datei wie oben beschrieben in eine PET-Analysesoftware, um die gezeichneten ROIs zu speichern.
6. Analysieren Sie das Gehirn mit einem halbautomatischen 3D-Atlas.
   1. Öffnen Sie die Kopfschnittdatei. Importieren Sie den Maus-Gehirnatlas, indem Sie im Menü "Erweiterte Module" das 3D-Gehirnatlas-Werkzeug auswählen. Stellen Sie sicher, dass die Referenz auf CT eingestellt ist und die Option Zuschneiden deaktiviert ist. Legen Sie einen Pfad für das Ausgabeverzeichnis fest.
   2. Ändern Sie unter " Erweiterte Einstellungen" die Option "Transformieren " in "Versor-affin". Behalten Sie alle anderen Standardeinstellungen bei. Klicken Sie auf Ausführen.
   3. Passen Sie den Atlas im Menü Neuausrichtung/Registrierung manuell an und verwenden Sie das CT des Schädels als Richtlinie für die Anpassung des Atlas.
      1. Seien Sie sehr vorsichtig, wenn eine Skalierung erforderlich ist, da dies das Volumen der Gehirnstruktur stark beeinflussen kann. Klicken Sie auf das Häkchen , wenn die Anpassung abgeschlossen ist.
      2. Führen Sie den Atlas erneut aus, wobei die Option "3D-ROIs importieren" ausgewählt ist.
      3. Exportieren Sie die Datei, um den Atlas zu speichern, der an den beschnittenen Kopf angepasst ist.
   4. Nachdem Sie alle ROIs von den gewünschten Organen gezeichnet und exportiert haben, berechnen Sie einen Standard-Bindungskorrekturwert. Korrigieren Sie alle Daten und konvertieren Sie sie in %ID/g, wie zuvor beschrieben⁶. Normalisieren Sie auf das Organ, das für das Tiermodell geeignet ist, z. B. das Herz, um sich auf Radiotracer zu normalisieren, der im Blutpool vorhanden ist.

12. Ex-vivo-Autoradiographie-Analyse

1. Öffnen Sie die digitale Bilddatei (.gel) mit der Bildanalysesoftware. Stellen Sie Helligkeit und Kontrast auf den gewünschten Schwellenwert ein. Wenden Sie bei Bedarf eine geeignete Farbnachschlagetabelle an.
   HINWEIS: Royal oder Grays werden empfohlen, um die Visualisierung zu erleichtern.

Ergebnisse

Das hCD19-mAb wurde DOTA-konjugiert und mit ⁶⁴Cu radioaktiv markiert, wie in Abbildung 2 dargestellt. EAE und naive Mäuse wurden 18-24 Stunden nach der Injektion mit ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb einer PET/CT-Untersuchung unterzogen (Abbildung 3). PET/CT-Bilder wurden mit der PET-Analysesoftware co-registriert, und das ZNS-Gewebe wurde mit manuellen ROIs oder einem halbautomatischen 3D-Gehirnatlas analysiert. Die Radiotracerbindung in ROIs (Abbildung 4) war bei EAE-Mäusen höher als bei naiven Mäusen. Ex vivo Gamma-Zählung und ARG zeigten eine erhöhte Bindung im Rückenmark (sowohl lumbale als auch zervikale Brustsegmente) und Gehirn (nur ARG) von EAE-Mäusen im Vergleich zu naiven Mäusen (Abbildung 5 und Abbildung 6). Die Ex-vivo-Gammazählung von perfundierten Mäusen zeigte auch eine verminderte Radiotracerbindung in peripheren Organen, einschließlich Milz, Oberschenkelknochen und Knochenmark (Abbildung 5), was mit B-Zellen übereinstimmt, die in diesem EAE-Modell die Peripherie verlassen und das ZNS infiltrieren.

Abbildung 2: Konjugations- und Radiomarkierungsschema zur Generierung von 64 Cu-markierten humanspezifischen CD19-monoklonalen Antikörpern, 16C4-TM mAb (⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb), zusätzlich zu Qualitätskontrolldaten. (A) Reaktion von DOTA-NHS-Ester mit monoklonalem hCD19-Antikörper zur Herstellung von hCD19-DOTA-Konjugat (nicht maßstabsgetreu) und radioaktive Markierung mit 64 Cu-CuCl3_{zur Herstellung} von ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb. (B) Repräsentativer ITLC-Chromatograph. Der Peak bei 40-60 cm ist der radioaktiv markierte Antikörper; ungebunden ⁶⁴Cu-CuCl₃ reist mit der mobilen Phase und wäre von 200 bis 240 cm vorhanden. In diesem Chromatographen ist kein freies ⁶⁴Cu-CuCl₃ nachweisbar. (C) die Spezifikationen für die Qualitätskontrolle des radioaktiv markierten Antikörpers. Abkürzungen: DOTA-NHS-Ester = 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäuremono-N-hydroxysuccinimidester; ITLC/HPLC = sofortige Dünnschichtchromatographie/Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; MALDI/LC-MS = matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation/Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie; CPM = Zählungen pro Minute. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Fotos, die zeigen, wie Mäuse in einem 3D-gedruckten Bett innerhalb des PET-Scanners gesichert werden, um eine qualitativ hochwertige Bildgebung des Rückenmarks und des Gehirns zu ermöglichen und gleichzeitig die Bewegung zu minimieren. (A) 3D-gedrucktes Vier-Maus-Scannerbett (auch bekannt als "Maushotel"), ausgestattet mit Heizelementen und Anästhesieschläuchen. (B) Anästhesierte Mäuse in Rückenlage, um die Geradheit der Wirbelsäule zu maximieren; Die Bettposition jeder Maus wird aufgezeichnet. (C) Mäuse, die sicher über ihren Kopf geklebt sind, um die Bewegung im Gehirn zu minimieren, und über den Bauch, um die Bewegung der Atmung zu minimieren, ohne die Atmung zu beeinträchtigen. (D) Das Mausbett befindet sich im Inneren des Scanners und ist mit Klebeband auf das Scanbett geklebt. Der Anästhesieschlauch wurde vom Scanner an das Bett angeschlossen und das Isofluran auf 2 % eingestellt. Die Atmung der Mäuse wurde überwacht, um einen angemessenen Isofluranspiegel zu gewährleisten, bevor die Scannertür geschlossen wurde. Abkürzung: PET = Positronen-Emissions-Tomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Rückenmarks- und Gehirnanalyse und Ergebnisse mit PET-Analysesoftware . (A) i) ROIs (rosa und hellbraun), die auf die Wirbelsäule gezeichnet werden, um die Lendenwirbel von den Brust- und Halswirbeln zu trennen und das Bild für die Otsu-Schwelle vorzubereiten. ii ) Wirbelsäulenwirbel (türkis und rot) wurden mit Otsu Thresholding segmentiert. iii ) Die Wirbel wurden dann im 3D-ROI-Menü unveränderlich gemacht und das Rückenmark in zervikale/thorakale (violett) und lumbale (marineblaue) ROIs unterteilt. iv) Der Wirbel-ROI wurde entfernt, so dass Rückenmark-ROIs und ein repräsentativer Hirnatlas angewendet wurden. (B) Repräsentative Analyse der PET-Ergebnisse aus verschiedenen ZNS-Regionen, dargestellt als %ID/g, normalisiert auf den ROI des Herzens bei jedem Tier. Bei der PET-Erfassung handelte es sich um einen 10-minütigen statischen Scan mittels PET/CT-Bildgebung. Quantifizierung der Hirnregionen mit einem halbautomatischen Gehirnatlas-Ansatz, dargestellt in Panel A. iv) Repräsentative Ergebnisse zeigen entweder eine Signifikanz oder einen Trend zu einem signifikanten Anstieg der Tracerbindung im Gehirn und im thorakalen Rückenmark. Statistiken, die mit dem t-Test des Schülers durchgeführt wurden (*: p < 0,0332). Abkürzungen: PET = Positronen-Emissions-Tomographie; ROIs = Regionen von Interesse; ZNS = Zentrales Nervensystem; CT = Computertomographie; %ID/g = prozentuale injizierte Dosis pro Gramm Gewebe; EAE = experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Repräsentative Quantifizierung der ex vivo Gammazählung in verschiedenen Organen bei EAE und naiven Mäusen, ausgedrückt als %ID/g. Nach dem PET-Scan wurden die Mäuse mit PBS perfundiert, um den im Blut vorhandenen Radiotracer zu entfernen, der entweder frei oder an im Blut ansässige CD19⁺ B-Zellen gebunden war, und die Organe wurden schnell präpariert und gewogen, um ein genaues Gewicht jedes Organs zu erhalten. Die Tracerbindung ist in Milz und Knochenmark bei EAE-Mäusen im Vergleich zu naiven Mäusen signifikant verringert. Eine erhöhte Radiotracerbindung wird sowohl in den lumbalen als auch in den zervikalen/thorakalen Rückenmarksegmenten von EAE-Mäusen beobachtet. Das Gehirn zeigt keinen signifikanten Anstieg des Radiotracer-Signals, obwohl es zu einem signifikanten Anstieg tendiert. Statistiken, die mit dem t-Test des Schülers durchgeführt wurden (*: p < 0,0332; ****: p < 0,0001). Abkürzungen: PET = Positronen-Emissions-Tomographie; %ID/g = prozentuale injizierte Dosis pro Gramm Gewebe; EAE = experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Ex vivo ARG-Bilder zeigen ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb-Bindungen in sagittalen Hirnschnitten und ganzem Rückenmark von EAE im Vergleich zu naiven Mäusen. Digitale Phosphorspeicherfilme wurden mit einem Phosphor-Imager gescannt, nachdem sie für etwa 10 Halbwertszeiten (127 h oder 5 Tage) radioaktiven Gewebeproben ausgesetzt worden waren. Die resultierenden Bilder zeigen ein visuell höheres Signal im Gehirn von EAE-Mäusen im Vergleich zu Hirnschnitten von naiven Mäusen, was aufgrund der Regionen, von denen bekannt ist, dass sie in diesem Modell B-Zellen enthalten, zu erwarten^{ist 5}. Insbesondere gibt es ein erhöhtes Tracer-Signal im Hirnstamm, im Kleinhirn und in den Ventrikeln von EAE-Maus-Hirnabschnitten. Dieser Anstieg des Signals für EAE-Maus-Hirnschnitte spiegelt das wider, was in der oben beschriebenen PET-Quantifizierung des gesamten Gehirns gefunden wurde. In ähnlicher Weise gibt es eine Zunahme der Radiotracer-Bindung sowohl im zervikalen/thorakalen als auch im lumbalen Rückenmarksegment im Vergleich zum naiven Rückenmark, was die Ergebnisse der Ex-vivo-Gammazählung widerspiegelt. Abkürzungen: PET = Positronen-Emissions-Tomographie; EAE = experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis; Vent = Ventrikel; Cb = Kleinhirn; BS = Hirnstamm; TSc = Brust- und Halswirbelsäule kombiniert; LSc = lumbales Rückenmark. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: Färbung von ZNS-Geweben von naivem und EAE-Maushirngewebe mit CD45R/B220. B-Zellen werden im Hirnstamm, in der Hirnhaut und in der weißen Substanz von EAE-Mäusen beobachtet (n = 7 EAE, n = 5 naive Mäuse, durchschnittlich vier Scheiben pro Tier). Diese Zahl stammt von ⁵. Maßstabsbalken = 5 mm (geringe Vergrößerung [1x]) in sagittalen Hirnbildern, 100 μm (hohe Vergrößerung [20x]) im Hirnstamm, in den Hirnhäuten und in der weißen Kleinhirnsubstanz. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Methode zur Abbildung von humanen CD19⁺ B-Zellen in einem Mausmodell der MS unter Verwendung von CD19-PET. Aufgrund des heterogenen Erscheinungsbildes der MS und des unterschiedlichen Ansprechens auf die Behandlung kann das Management in der Klinik eine Herausforderung darstellen, und neue Ansätze für die Therapieauswahl und -überwachung sind dringend erforderlich. Die PET-Bildgebung könnte als leistungsfähiges Instrument zur Überwachung des Krankheitsverlaufs und des individuellen Ansprechens auf eine B-Zell-deplementierende Therapie dienen. Neben der MS könnte die CD19-PET-Bildgebung auch zur Überwachung der B-Zell-Depletion nach der Behandlung von Subtypen von Lymphomen und Leukämien oder anderen B-Zell-vermittelten Erkrankungen eingesetzt werden. Dieses Protokoll und repräsentative Daten zeigen den Nutzen der Bildgebung von B-Zellen bei neurologischen Erkrankungen.

Um humane CD19⁺ B-Zellen im Kontext von MS zu untersuchen, wählten wir das B-Zell-abhängige MOG_{1-125 EAE-Modell} ⁷. Ähnlich wie andere EAE-Modelle zeigt sich dieses Modell mit Symptomen einer fortschreitenden Lähmung und Infiltration von Immunzellen in das ZNS. Das MOG_1-125-Modell ist jedoch insofern einzigartig, als es sich um ein B-Zell-getriebenes Modell handelt: Mäuse enthalten eine unterschiedliche Anzahl von B-Zellen im Subarachnoidalraum in den Hirnhäuten, im Hirnstamm, im Parenchym und in den Ventrikeln. Diese Lymphozyten können in diesen Regionen spärlich verstreut sein und/oder follikelartige Strukturen bilden, die auch beim Menschen mit MS ^8,9 beobachtet werden. Zusätzlich zur Verwendung naiver Mäuse als Kontrollen kann ein vollständiges Induktionskit verwendet werden, das nur für das Freund's Adjuvans (CFA) verwendet wird (d. h. eine identische Induktionsemulsion wie die, die EAE-Mäusen ohne das MOG-Protein verabreicht wird). Im EAE-Mausmodell ist die Blut-Hirn-Schranke (BHS) dysfunktional und ermöglicht es größeren Entitäten, wie z. B. Antikörpern, die Grenze zu überwinden. Der CD19-mAb-Radiotracer bindet und verbleibt nur dann im ZNS, wenn B-Zellen vorhanden sind; Der Tracer zirkuliert zurück in den Blutpool, wenn keine B-Zellen vorhanden sind. Wir haben dies mit Hilfe von Gammazählung und Ex-vivo-Autoradiographie von ZNS-Geweben nachgewiesen, indem wir vor der Messung der Radioaktivitätswerte in den Geweben perfundiert haben. Wir haben dies auch in früheren Publikationen gezeigt, in denen über die Verwendung von mAb-basierten PET-Radiotracern (d.h. immunPET-Bildgebungsansätzen) zum Nachweis von B-Zellen im ZNS berichtet^{wurde 1,2}.

Der DOTA-Chelator wurde verwendet, da er in der klinischen PET-Bildgebung mit Kupfer-64-markierten Peptiden und Antikörpern verwendet wird, und wir wollen den hCD19-mAb für die klinische Bildgebung von MS-Patienten übersetzen. DOTA hat in vivo eine ausreichende Bindungsaffinität zu Kupfer-64. Die In-vivo-Stabilität ist sehr wichtig, da freies ⁶⁴Cu in die Leber gelangt und das Signal des gebundenen Radiotracers verschleiern kann. Daher ist es wichtig, das Signal in der Leber zu messen, um das relative Signal im Vergleich zu anderen Organen zu berechnen. Der Muskel wird in der Regel als Kontrollgewebe verwendet, aber im Falle von EAE kann es zu einer Entzündung in den Muskeln kommen. Die Halbwertszeit von ⁶⁴Cu beträgt 12,7 h, was dem DOTA-hCD19-mAb ausreichend Zeit gibt, um an sein Ziel zu binden und gleichzeitig sicherzustellen, dass das Signal mittels PET gemessen werden kann. Bei der Herstellung des Konjugats sollten Testreaktionen in kleinem Maßstab (75-125 μg) durchgeführt werden, um die Menge an DOTA zu bestimmen, die zu mAb hinzugefügt werden muss, um das gewünschte DOTA/mAb-Verhältnis zu erzeugen (z. B. kann eine Reaktion von 6-10-fachem Überschuss an DOTA-NHS-Ester pro mol mAb ein Konjugat von 1-2 DOTA/mAb ergeben). Auch die Reaktionszeit und -temperatur (z.B. 2-4 h oder über Nacht bei 4 °C oder Raumtemperatur) beeinflusst das DOTA/mAb-Verhältnis und sollte optimiert werden. Eine Titration mit nicht-radioaktivem Kupfer kann durchgeführt werden, um die Anzahl der DOTAs pro mAb zu berechnen; Wir empfehlen jedoch, MALDI-MS und/oder LC-MS durchzuführen, um zuverlässigere und genauere Ergebnisse zu erzielen.

Das berechnete DOTA/mAb-Verhältnis ist ein Durchschnittswert für eine bestimmte Probe, und es ist mit einer gewissen Abweichung zu rechnen. Für MALDI werden mehrere Aufnahmen pro Probe für die konjugierten und unkonjugierten mAbs gemacht. Anschließend berechnen wir das Verhältnis von konjugiert zu unkonjugiert, um die durchschnittliche Anzahl von DOTA/mAb zu bestimmen. Das DOTA/mAb-Verhältnis ist wichtig, da zu viele Chelatoren die Antikörperbindung stören und zu wenige zu einer inkonsistenten radioaktiven Markierung und einem niedrigen Signal führen. Das Verhältnis zwischen den Konjugatchargen sollte sehr eng sein, um eine konsistente Signalintensität und Bindungskinetik aufrechtzuerhalten. Im Idealfall sollte für alle Experimente innerhalb einer bestimmten Studie dieselbe Charge Konjugat verwendet werden. Eine vielversprechende Technik, um mögliche Auswirkungen auf die Immunreaktivität aufgrund einer möglichen Überkonjugation zu reduzieren, ist die Verwendung der ortsspezifischen Konjugation¹⁰ , wobei die Chelator-Konjugation ortsselektiv auf die schwerkettigen Glykane des Antikörpers ausgerichtet ist und somit die Zugabe von 1 Chelator pro mAb garantiert.

Die Reaktionsbedingungen für die radioaktive Markierung sollten optimiert werden, um die höchste Markierungseffizienz und -ausbeute zu gewährleisten, da sich unter anderem Unterschiede in der Antikörper-, DOTA/mAb-Ratio und der molaren Aktivität von ⁶⁴Cu auf die radioaktive Markierung auswirken. Die Verwendung des optimalen Konjugatverhältnisses ^{von 64}Cu zu mAb kann es ermöglichen, den Radiotracer ohne Reinigung zu verwenden, wodurch die für die Radiomarkierung erforderliche Zeit und der Verlust aufgrund der Schwerkraftflusssäule und des radioaktiven Zerfalls reduziert werden. Eine konsistente und zuverlässige molare Aktivität kann auch erreicht werden, wenn das gleiche Konjugatverhältnis ^{von 64}Cu zu mAb verwendet wird, was besonders wichtig ist, wenn Ergebnisse über mehrere Kohorten von Mäusen oder bildgebende Studien hinweg verglichen werden. Die ITLC-Bedingungen können auch an jeden Benutzer angepasst werden. Wenn eine Aufreinigung erforderlich ist, sollte ein Aliquot für die HPLC- und/oder UV/Vis-Spektrophotometrie gespeichert werden, damit die molare Aktivität berechnet werden kann.

Es ist wichtig zu beachten, dass die Verwendung radioaktiv markierter Antikörper für die Bildgebung eine Herausforderung darstellen kann. Es ist wichtig, dass der für den Radiotracer verwendete Antikörper biologisch inert ist, um keine physiologische Wirkung zu haben. Da Antikörper einen langen Blutaufenthalt haben, muss man außerdem lange genug auf die Zirkulation, Bindung und Clearance eines bestimmten mAb warten, um ein geeignetes Signal zum Hintergrund zu gewährleisten, ohne die Bildqualität zu beeinträchtigen. In der Regel ist es ausreichend, 20-48 Stunden auf einen 64 Cu-markierten mAb zu warten, aber man sollte bei der Beurteilung eines neuen mAb-PET-Tracers 2, 4, 6, 12, ²⁴, 48 Stunden nach der Injektion eine Bildgebung durchführen, um den besten Zeitpunkt für die Bildgebung in einem bestimmten Nagetiermodell zu bestimmen. Das Gleiche gilt für die Aufnahme von ARG-Bildern mit dem höchsten Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis. Die repräsentativen Bilder in diesem Protokoll wurden 18-20 Stunden nach der Injektion aufgenommen, obwohl je nach verwendetem Radioisotop auch andere Zeitpunkte verwendet werden können. Unterschiedliche Antikörper, die an verschiedene Epitope von CD19 binden, führen zu unterschiedlichen Ergebnissen und sollten streng charakterisiert werden.

Bei der Analyse des Rückenmarkssignals ist es wichtig, die Mäuse auf dem Rücken im Scanbett zu positionieren, um die durch die Atmung verursachten Bewegungen zu reduzieren. Darüber hinaus kann die Platzierung in Rückenlage dazu beitragen, die Wirbelsäule bei Mäusen zu begradigen, die aufgrund des Fortschreitens der EAE-Krankheit eine erhöhte Wirbelsäulenverkrümmung aufweisen. Ein weiterer wichtiger Aspekt, der bei der Detektion von Signalen in der Wirbelsäule und im Rückenmark zu berücksichtigen ist, ist die Vermeidung der Injektion von MOG_1-125 in die Flanke, da die Injektionsstellen aufgrund der damit verbundenen Immunantwort in diesen Bereichen den Tracer binden können. Die unmittelbare Nähe der Injektionsstelle kann die Rückenmarksanalyse beeinträchtigen. Somit sind Injektionen in den Brustkorb für die hierin beschriebene Anwendung bevorzugt.

Die verwendeten Bildanalysetechniken sind spezifisch für die ZNS-Bildgebung. Ein Gehirnatlas innerhalb der Bildanalysesoftware liefert reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse, solange die Registrierung von PET und CT korrekt ist. Die Verwendung des halbautomatischen 3D-Gehirnatlas und dessen Anpassung an den Schädel jeder Maus ermöglicht konsistente ROIs zwischen den Tieren. Da es derzeit keinen automatisierten oder halbautomatischen Ansatz zur Analyse des Signals im Rückenmark gibt, müssen manuelle ROIs gezogen werden. Insbesondere bei der Quantifizierung von CD19⁺ B-Zellen (oder einem anderen Zelltyp, der sowohl im Knochenmark als auch im Rückenmark vorhanden ist) ist es wichtig, das Signal, das von der Wirbelsäule und dem Knochenmark ausgeht, so weit wie möglich zu eliminieren. Der Grund dafür ist, dass naive Mäuse bekanntermaßen mehr CD19⁺ B-Zellen in ihrem Knochenmark enthalten als EAE-Mäuse, bei denen B-Zellen die Peripherie verlassen, um das ZNS zu infiltrieren ^5,11. Dieses Knochenmarksignal kann das wahre Signal im Rückenmark verschleiern.

Um das wahre Rückenmarkssignal abzugrenzen und gleichzeitig den Beitrag des Signals von der Wirbelsäule und dem Knochenmark zu minimieren, kann die Otsu-Schwelle des CT-Bildes verwendet werden, um einen unveränderlichen ROI für die Wirbelsäule zu erzielen. Ein separater Rückenmark-ROI kann dann einfach innerhalb der Wirbelsäule gezeichnet werden. Die gleiche Technik kann auch zur Messung des Knochenmarks im Oberschenkelknochen angewendet werden. Dies ist eine sehr nützliche Methode, um Einblicke in die Tracerbindung im Rückenmark zu gewinnen. Aufgrund der relativ geringen räumlichen Auflösung der PET und der Probleme im Zusammenhang mit dem partiellen Volumeneffekt beim Scannen kleiner anatomischer Regionen von Mäusen ermöglicht die Verwendung zusätzlicher ex vivo Bestätigungstechniken (z. B. Gamma-Zählung, ARG) die Validierung der Radiotracer-Bindung im Rückenmark ohne das Vorhandensein von Blut, Liquor oder Spillover-Signal von der Wirbelsäule.

Das Signal im zervikalen/thorakalen Rückenmark variiert bei den EAE-Mäusen tendenziell in Abhängigkeit von der Schwere der Erkrankung und davon, wie viele B-Zellen während der adaptiven Immunantwort infiltrieren. Diese Variation in der Anzahl der infiltrierten B-Zellen sowie die geringe Menge an B-Zellen im ZNS im Vergleich zu denen im Becken-/Rückenmarksknochenmark naiver Mäuse kann die In-vivo-Quantifizierung von Rückenmarksgewebe bei Mäusen schwierig machen. Aufgrund der räumlichen Auflösung der PET in der Bildgebung von Kleintieren kann das Signal aus dem Knochenmark auf das Rückenmarksignal übergreifen. Die hier durchgeführte Ex-vivo-Bioverteilung und Autoradiographie helfen bei der Validierung des PET-Signals der Wirbel im Vergleich zum Rückenmarksgewebe. Mäuse werden vor der Sektion perfundiert, um alle ungebundenen Tracer im Blutpool zu entfernen, so dass die Ergebnisse der Gammazählung und der Autoradiographie den Tracer widerspiegeln, der tatsächlich in jedem Organ gebunden ist, und nicht den Tracer, der sich im Blutpool in diesem Organ befindet.

Radiotracer zirkulieren durch das Blut, und insbesondere bei Antikörper-Tracern ist oft noch Wochen nach der ersten Injektion ungebundener Radiotracer im Blut vorhanden. Da wir das Gehirn und das Rückenmark abbilden, die viele Blutgefäße haben, ist es wichtig zu verstehen, welcher Teil des Signals wirklich auf die Tracerbindung im Gehirn/Gewebe von Interesse zurückzuführen ist, im Vergleich zu dem, der im Blutpool vorhanden ist. Es ist also notwendig, das Gehirnsignal durch das Signal im Herz-/Blutpool zu teilen. Im klinischen Umfeld können die gleichen Bildanalysetechniken wie die Otsu-Schwelle von Wirbeln und ROIs von Rückenmarksgeweben zur Quantifizierung verwendet werden. Angesichts der größeren Gewebevolumina beim Menschen im Vergleich zu Mäusen sollte es deutlich weniger Auswirkungen von Teilvolumeneffekten geben, was zu einer verbesserten Genauigkeit führt und die Notwendigkeit von Ex-vivo-Techniken zur Bestätigung von In-vivo-Befunden zunichte macht. Der Einsatz von PET in der Klinik wird es Ärzten ermöglichen, die Therapie für jeden Patienten in Abhängigkeit von seiner individuellen B-Zell-Belastung zu personalisieren.

ARG ist besonders nützlich für die Aufnahme hochauflösender Bilder, um eine genauere Abgrenzung der räumlichen Lage der Tracerbindung in kleinen Regionen wie Hirnstamm und Kleinhirn zu ermöglichen. Dieselben Abschnitte und/oder benachbarte Abschnitte können für immunhistochemische Färbungen aufbewahrt werden, um das Vorhandensein von B-Zellen zu bestätigen. Wir haben zuvor ZNS-Gewebe mit CD45R/B220 gefärbt (Ergänzende Abbildung S1), um die Anzahl der B-Zellen mit dem PET- und ARG-Signal ^5,9 zu korrelieren. Die Färbung kann dann räumlich mit den ARG-Ergebnissen verglichen werden, um zu überprüfen, ob das Radiotracer-Signal mit dem Färbemuster übereinstimmt. B-Zellen können in Clustern oder diffus im gesamten Hirnstamm vorhanden sein; Die PET-Sensitivität ist hoch genug, um das Signal zu messen, was für die klinische Translation ermutigend ist. Bei der ARG des Rückenmarks wird durch die Entfernung des Rückenmarks aus den Wirbeln sichergestellt, dass das gemessene Signal auf eine Tracerbindung im Rückenmarksgewebe und nicht auf das Knochenmark und/oder Blut zurückzuführen ist, die PET-Bilder aufgrund von Teilvolumeneffekten verdecken können.

Ähnlich wie bei ARG ermöglicht die Ex-vivo-Gammazählung die Quantifizierung des radioaktiven Signals in einzelnen Organen. Für diese spezielle Technik ist es wichtig, das Nassgewicht des Gewebes zu messen und sicherzustellen, dass es sich am Boden der jeweiligen Röhrchen befindet, bevor die Röhrchen in den Gamma-Zähler eingesetzt werden. Die Röhrchen müssen mit der Mausnummer und dem Gewebe beschriftet sein, damit das richtige Röhrchen verwendet wird; Das Röhrchen wird dann auf einer kalibrierten Waage gewogen und die Organe werden auf das Zehntel Mikrogramm (0,0001 mg) genau eingeführt. Einige Gewebe sind extrem klein und der Unterschied in der Röhrchenmasse vorher und nachher liegt in der Größenordnung von 0,0001 mg. Das Gewebe sollte unmittelbar nach der Dissektion gewogen werden, um einen Feuchtigkeitsverlust zu vermeiden, der zu einer geringeren Masse führt. Nach dem Wiegen sollten die Hirn- und Rückenmarksröhrchen mit PBS gefüllt werden, um ein Austrocknen zu verhindern, bevor diese Gewebe für ARG eingefroren werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,5 mL 50 kDa MWCO Zentrifugalfilter	MiliporeSigma	UFC505008	Zentrifugalfilter
64Cu-CuCl3	Washington University in St. Louis; Universität von Wisonsin, Madison; oder ein anderer Anbieter
AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner Eckert	& Ziegler	AR-2000
Autoradiographie-Kassette	Cole Palmer	EW-21700-34	Aluminium, 8" x 10"
Autoradiographie-Film	GE Life Sciences	28-9564-78	Lagerung Phosphor Sieb BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 x 25 cm, nur Sieb
Schmetterling Nadelkatheter	SAI Infusion Technologies	BLF-24
DOTA-NHS-Ester	Makrozyklika	B-280
EAE Induktionskit	Hooke Laboratories	EK-2160
Geiger Zähler	Ludlum	14C
GNEXT PET/CT Scanner	Sofie	GNEXT
Hidex Automatischer Gamma-Zähler	Hidex	AMG
HPLC-Säule	Phenomenex	00H-2146-K0	5 μ m SEC-s3000 400 Å, 300 x 7,8 mm
Illustra NAP-5 Säule	Cytiva	DNA-Schwerkraftsäule
Bild J	NIH		ARG Analysesoftware
Entnahmeröhrchen mit geringer Proteinbindung (1,5 mL)	Thermo Scientific	PI90410
NanoDrop Lite Spektralphotometer	Thermo Scientific	840281400	UV-Vis Mikro-/Nanospektralphotometer
PCR-Röhrchen 0,2 ml, für	Eppendorf	30124707
Typhoon Phosphor Imager in DNA-Qualität 9410	GE Healthcare	8149-30-9410
VivoQuant	Invicro	Version 4 Patch 3	PET-Analysesoftware; muss erworben werden Gehirnatlas Add-on
Zeba Spin Entsalzungssäulen, 7 K MWCO, 0,5 mL	Thermo Scientific	PI89882	Entsalzungssäule