Isolierung, Charakterisierung und therapeutische Anwendung extrazellulärer Vesikel aus kultivierten humanen mesenchymalen Stammzellen

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die differentielle Zentrifugation zur Isolierung und Charakterisierung repräsentativer EVs (Exosomen und Mikrovesikel) aus kultivierten humanen MSCs. Weitere Anwendungen dieser Elektrofahrzeuge werden ebenfalls in diesem Artikel erläutert.

Abstract

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind heterogene Membran-Nanopartikel, die von den meisten Zelltypen freigesetzt werden, und sie werden zunehmend als physiologische Regulatoren der organismischen Homöostase und wichtige Indikatoren für Pathologien anerkannt. In der Zwischenzeit zeichnet sich ihr immenses Potenzial ab, zugängliche und kontrollierbare Krankheitstherapeutika zu etablieren. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) können große Mengen an EVs in Kultur freisetzen, die eine effektive Geweberegeneration ankurbeln und umfangreiche therapeutische Anwendungen mit guter Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit ermöglichen. Es besteht eine wachsende Nachfrage nach einfachen und effektiven Protokollen für die Erfassung und Anwendung von MSC-EVs. Hier wird ein detailliertes Protokoll basierend auf der differentiellen Zentrifugation bereitgestellt, um repräsentative EVs aus kultivierten humanen MSCs, Exosomen und Mikrovesikeln für weitere Anwendungen zu isolieren und zu charakterisieren. Die Anpassungsfähigkeit dieser Methode wird für eine Reihe von nachgelagerten Ansätzen wie Markierung, lokale Transplantation und systemische Injektion gezeigt. Die Implementierung dieses Verfahrens wird dem Bedarf an einer einfachen und zuverlässigen Erfassung und Anwendung von MSC-EVs in der translationalen Forschung Rechnung tragen.

Introduction

Stammzellen sind undifferenzierte pluripotente Zellen mit Selbsterneuerungsfähigkeit und translationalem Potenzial¹. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) lassen sich im Labor leicht isolieren, kultivieren, expandieren und aufreinigen, was für Stammzellen auch nach mehreren Passagen charakteristisch bleibt. In den letzten Jahren hat sich die Evidenz für die Ansicht verdichtet, dass MSCs in therapeutischer Anwendung parakrin wirken ^2,3. Insbesondere die Sekretion extrazellulärer Vesikel (EVs) spielt eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der biologischen Funktionen von MSCs. Als heterogene membranöse Nanopartikel, die von den meisten Zelltypen freigesetzt werden, bestehen EVs aus Unterkategorien, die als Exosomen (Exos), Mikrovesikel (MVs) und noch größere apoptotische Körper bezeichnet werden ^4,5. Unter ihnen ist Exos mit einer Größe von 40-150 nm das am besten untersuchte EV, das endosomalen Ursprungs ist und unter physiologischen Bedingungen aktiv sezerniert wird. MVs werden durch Abstoßen direkt von der Oberfläche der Zellplasmamembran mit einem Durchmesser von 100-1.000 nm gebildet, die sich durch eine hohe Expression von Phosphatidylserin und eine hohe Expression von Oberflächenmarkern von Spenderzellen auszeichnen⁶. EVs enthalten RNA, Proteine und andere bioaktive Moleküle, die ähnliche Funktionen wie die Elternzellen haben und eine wichtige Rolle bei der Zellkommunikation, der Immunantwort und der Reparatur von Gewebeschäden spielen⁷. MSC-EVs wurden in der regenerativen Medizin umfassend als leistungsfähiges zellfreies therapeutisches Werkzeug untersucht⁸.

Die Isolierung und Reinigung von MSC-abgeleiteten Elektrofahrzeugen ist ein häufiges Problem im Bereich der Forschung und Anwendung. Gegenwärtig sind die Differential- und Dichtegradienten-Ultrazentrifugation⁹, der Ultrafiltrationsprozess 10, die immunmagnetische Trennung 11, der molekulare Ausschlusschromatograph¹² und der mikrofluidische Chip¹³ weit verbreitete Methoden zur Isolierung und Reinigung von EVs. Bei den Vor- und Nachteilen der einzelnen Ansätze können die Menge, Reinheit und Aktivität der gesammelten Elektrofahrzeuge nicht gleichzeitig erfüllt werden^14,15. In der vorliegenden Arbeit wird das differentielle Zentrifugationsprotokoll zur Isolierung und Charakterisierung von EVs aus kultivierten MSCs im Detail gezeigt, das eine effiziente therapeutische Nutzung unterstützt hat 16,17,18,19,20. Die Anpassungsfähigkeit dieser Methode für eine Reihe von nachgelagerten Ansätzen, wie z. B. Fluoreszenzmarkierung, lokale Transplantation und systemische Injektion, wurde ebenfalls beispielhaft dargestellt. Die Implementierung dieses Verfahrens wird dem Bedarf an einer einfachen und zuverlässigen Sammlung und Anwendung von MSC-EVs in der translationalen Forschung Rechnung tragen.

Protocol

Alle Tierverfahren wurden vom Komitee für Tierpflege und -nutzung der Vierten Militärmedizinischen Universität genehmigt und in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. Es wurden acht Wochen alte C57Bl/6-Mäuse (keine Präferenz für Weibchen oder Männchen) verwendet. Kryokonservierte MSCs aus menschlicher Nabelschnur (UCMSCs), die für die vorliegende Studie verwendet wurden, stammen aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle). Die Verwendung menschlicher Zellen wurde von der Ethikkommission der Vierten Medizinischen Militäruniversität genehmigt.

1. Kultur humaner mesenchymaler Stammzellen (hMSCs)

1. Bereiten Sie das für die experimentelle Arbeit erforderliche Zubehör und Lösungen vor, einschließlich Pipetten, Pipettenspitzen, 10-cm-Petrischale, Thermostatausrüstung (Wasserbad), Gummihandschuhe, 75%iger Alkohol, Nährmedium (inkubiert bei 37 °C), tödliches Kälberserum (FBS) und 100-fache Penicillin-Streptomycin (P/S)-Lösung (siehe Materialtabelle).
2. Bereiten Sie kommerziell erhältliches Alpha-Minimum Essential Medium (α-MEM) vor, indem Sie es mit 20 % FBS und 1 % P/S ergänzen.
   Anmerkungen: Verdünnen Sie alle Lösungen, die für die Isolierung und Analyse von Elektrofahrzeugen verwendet werden, in hochreinem gefiltertem Wasser, das vom Reinstfilterwasserreinigungssystem hergestellt wird (siehe Materialtabelle).
3. Rückgewinnung der kryokonservierten MSCs aus der menschlichen Nabelschnur (UCMSCs) aus dem flüssigen Stickstoff, indem sie in einem 37 °C warmen Wasserbad geschmolzen werden.
4. Die geschmolzene Zellsuspension wird schnell und schonend in ein 15-ml-Röhrchen mit 5 ml Nährmedium überführt (Schritt 1.2). Bei 4 °C, 500 x g für 5 min zentrifugieren.
5. Entfernen Sie den Überstand mit einer sterilen Pipette und halten Sie den Zellausfall zurück. Geben Sie 2 ml Nährmedium in das Zentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig.
6. Säen Sie die Zellen in eine 10-cm-Petrischale und fügen Sie 8 ml Nährmedium zu insgesamt 10 ml hinzu.
7. Kultivieren Sie MSCs bei 37 °C in 5% CO₂ im Zellinkubator.

2. Differentialzentrifugation zur Isolierung von Exos und MVs

1. Wenn die MSCs auf >90 % Konfluenz anwachsen, ersetzen Sie das Nährmedium durch α-MEM, das mit 20 % EV-depletiertem FBS und 1 % P/S für 8 ml jeder Schale ergänzt wird.
   Anmerkungen: Zentrifugieren Sie FBS bei 4 °C, 1,50,000 x g über Nacht, um EVs und andere Verunreinigungen zu entfernen.
2. Nach 48 Stunden Kultur wird das Nährmedium (Schritt 2.1) in 50-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt.
3. Zentrifugieren Sie das MSC-Nährmedium bei 4 °C, 800 x g für 10 min.
4. Entfernen Sie die Zellfragmente und Zelltrümmer, indem Sie den Überstand in saubere konische 1,5-ml-Röhrchen übertragen.
   HINWEIS: Die Verwendung von konischen 1,5-ml-Röhrchen ist erforderlich, um die EV-Ausbeute zu erhöhen.
5. Den Überstand bei 4 °C, 16.000 x g für 30 min zentrifugieren. Das Pellet besteht aus MVs. MVs aus jeder Zellschale wurden mit 50 μl PBS resuspendiert.
6. Der durch Zentrifugation in Schritt 2.5 erhaltene Überstand wird mit einer Pipette in die gereinigten Ultrazentrifugenröhrchen übertragen. Bei 1,50,000 x g für 2 h bei 4 °C zentrifugieren.
7. Entsorgen Sie den Überstand und sammeln Sie den Rest, bei dem es sich um Exos handelt. Resuspendieren Sie Exos aus sieben Zellschalen in 50 μl PBS.
   HINWEIS: Die UCMSCs mit sechstem Durchgang werden für die EV-Isolierung verwendet. Um genügend MVs und Exos für den experimentellen Einsatz zu erhalten, werden in der Regel 7-8 Schalen mit kultivierten Zellen benötigt. Die EV-Proben werden sofort für die folgenden Charakterisierungsschritte oder für therapeutische Anwendungen verwendet, die besser nicht gelagert werden.
   ACHTUNG: Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen von Elektrofahrzeugen, und lagern Sie Elektrofahrzeuge am besten kurzfristig bei 4 °C und nicht bei -80 °C.

3. Detektion von Partikelanzahl und Größenverteilung von EVs aus MSCs

HINWEIS: Für die Bewertung der Größenverteilung wird die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) mit einem handelsüblichen Nanopartikel-Tracking-Analysator durchgeführt (siehe Materialtabelle).

1. Verdünnen Sie 1 μl EVs (aus Schritt 2.5 und Schritt 2.7) in 1.499 μl PBS und mischen Sie genug in einem 15-ml-Röhrchen.
2. Betreiben Sie den Tracking-Analysator gemäß den Anweisungen des Herstellers. Starten Sie zunächst die kompatible Software (siehe Materialtabelle).
3. Füllen Sie die Probenzelle mit destilliertem Wasser und lassen Sie das Gerät dann mit der Zellprüfung beginnen.
4. Kalibrieren Sie das Gerät mit einer vorbereiteten Standardlösung. Stellen Sie sicher, dass die Partikelanzahl, die auf der Software-Erkennungsschnittstelle angezeigt wird, zwischen 50 und 400 liegt (vorzugsweise etwa 200). Klicken Sie auf OK.
   Anmerkungen: Bereiten Sie die Standardlösung vor, indem Sie 1 μl Kalibrierlösung (siehe Materialtabelle) in 1 ml destilliertem Wasser rekonstituieren, um eine primäre Lösung zu erzeugen, und nehmen Sie dann 100 μl der primären Lösung und fügen Sie 25 ml destilliertes Wasser hinzu, um eine Standardlösung (1:250.000) herzustellen. Lagern Sie dieses Arbeitsreagenz eine Woche lang bei 4 °C.
5. Spülen Sie die Probenzelle mit 5 ml destilliertem Wasser aus.
6. Spülen Sie den Kanal vor der Probenanalyse mit 1 ml destilliertem Wasser. Stellen Sie sicher, dass die auf der Software-Erkennungsschnittstelle angezeigte Partikelanzahl kleiner als 10 ist.
7. Injizieren Sie 1 ml der in Schritt 3.1 vorbereiteten EV-Probe. Führen Sie den Vesikeltest gemäß der Bedienungsanleitung des Geräts durch.
   VORSICHT: Die Probe und das destillierte Wasser werden mit einer 1-ml-Spritze mit einer konstanten Geschwindigkeit von 0,5 ml/s unter sorgfältiger manueller Kontrolle injiziert.

4. Charakterisierung der EV-Morphologie mittels Transmissionselektronenmikroskop (TEM)

1. Verdünnen Sie 1 μl EVs aus Schritt 2.7 mit 199 μl PBS und mischen Sie ausreichend. Geben Sie 20 μl EV-Suspensionstropfen in das formvar/kohlenstoffbeschichtete quadratische Netz (siehe Materialtabelle) und lassen Sie es 3 Minuten lang einwirken.
2. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem kleinen Filterpapier und lassen Sie sie 15 Sekunden einwirken, um die Oberfläche leicht zu trocknen.
3. Negativfärbung von EV-Proben mit 1,5 % Phosphowolframsäuretröpfchen für 40 s.
4. Entfernen Sie die überschüssige Phosphowolframsäure und lassen Sie sie 15 s stehen, um die Oberfläche leicht zu trocknen.
5. Geben Sie die Probe mit formvar/kohlenstoffbeschichtetem quadratischem Netz in eine saubere, mit Filterpapier bedeckte Schale. Beobachten und erfassen Sie Bilder mit einem Transmissionselektronenmikroskop.
   HINWEIS: In diesem Prozess werden Exos als Beispiel genommen.

5. Kennzeichnung von aus MSCs abgeleiteten Elektrofahrzeugen

1. Nach der Extraktion der EVs (Schritt 2.5) mit 250 μl PBS in einem konischen 1,5-ml-Röhrchen resuspendieren.
2. Verwenden Sie ein weiteres konisches 1,5-ml-Röhrchen zur Herstellung der Arbeitslösung des PKH26-Farbstoffs. Verwenden Sie 1 μl PKH26-Markierungsreagenz, verdünnt mit 250 μl Verdünnungsmittel C (eine Komponente des kommerziell erhältlichen EV-Markierungskits, das für die vorliegende Studie verwendet wurde, siehe Materialtabelle).
   Anmerkungen: Bereiten Sie die Arbeitslösung unmittelbar vor Gebrauch vor.
   VORSICHT: Bei übermäßigem PKH26-Farbstoff oder -Kennzeichnung ohne Vorverdünnung besteht die Gefahr, dass die EVs beschädigt werden.
3. Mischen Sie die resuspendierten Elektrofahrzeuge mit der Arbeitslösung. Lassen Sie es 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen und fügen Sie dann 500 μl EV-abgereichertes FBS hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
4. Bei MVs bei 4 °C, 16.000 x g für 30 min zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette verwerfen. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu, um die Rückstände zu spülen.
5. Bei 4 °C, 16.000 x g für 30 min zentrifugieren und den Überstand entsorgen, um den ungebundenen Farbstoff zu entfernen.
6. Resuspendieren Sie den Rückstand mit 200 μl PBS. Geben Sie 20 μl Suspension auf den Objektträger und beobachten Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop.
   HINWEIS: In diesem Prozess werden MVs als Beispiel genommen.

6. Lokale Transplantation und systemische Injektion von MSC-EVs

Anmerkungen: Legen Sie die EVs bei den folgenden Verfahren vor der Injektion auf Eis.

1. Führen Sie eine lokale Transplantation durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Betäuben Sie die Mäuse mit 4% (vol/vol) Isofluran. Halten Sie die Anästhesie während des Eingriffs bei 1%-3% Isofluran.
   2. Verabreichen Sie vor der Operation 5 mg/kg Carprofen (IP) zur Analgesie, um die Schmerzen nach dem Eingriff zu minimieren.
   3. Rasieren Sie vor der Wundentfernung das Rückenhaar und sterilisieren Sie die Rückenfläche, indem Sie abwechselnd 3 Runden von 10 % Povidon-Jod und 75 % Ethanol auftragen.
   4. Erzeugen Sie mit einer Biopsiestanze ( siehe Materialtabelle) eine Wunde mit einem Durchmesser von 1 cm in voller Dicke auf der Rückenhaut.
   5. Resuspendieren Sie die MSC-abgeleiteten EVs aus zwei Schalen in 100 μl PBS und verabreichen Sie die Injektion in die subkutane Schicht des Wundbetts, um jede Wunde mit vier Stellen.
      HINWEIS: Es werden durchschnittlich 100 μg EVs pro Maus (EVs aus zwei 10-cm-Zellschalen) injiziert. Zehn 10-cm-Schalen mit MSCs werden benötigt, um genügend EVs zu liefern, um ein Experiment von n = 5 in einem Mausmodell durchzuführen.
   6. Wickeln Sie die Mäuse nach der Behandlung mit steriler Gaze ein und legen Sie sie bis zum Aufwachen auf Wärmedämmkissen (siehe Materialtabelle).
   7. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse nicht unbeaufsichtigt gelassen werden, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt haben. Bringen Sie die Mäuse erst dann in die Gesellschaft anderer Tiere zurück, wenn sie sich vollständig erholt haben.
   8. Verabreichen Sie je nach Bedarf zusätzliche Dosen der Analgesie an Tag 2 und Tag 3 nach der Operation.
2. Führen Sie eine systemische Injektion durch.
   1. Resuspendieren Sie MSC-abgeleitete EVs in 200 μl PBS und mischen Sie sie dann mit Heparinlösung in einem Volumenverhältnis von 10:1.
   2. Setzen Sie die Mäuse in das Bildgebungssystem der Schwanzvene ein (siehe Materialtabelle). Drücken Sie den Schalter, um den Hebel anzuheben.
   3. Desinfizieren Sie die Schwanzvene vor der intravenösen Injektion mit einem Alkoholpad. Dann injizieren Sie den Mäusen systematisch die in Schritt 6.2.1 hergestellte Suspension durch die Schwanzvene. Das Verfahren wird von einem Schwanzvenen-Illustrator unterstützt.
      Anmerkungen: Injizieren Sie die EV-Suspension sofort nach dem Mischen mit Heparin. Durchschnittlich werden 100 μg EVs pro Maus (EVs aus zwei 10-cm-Zellschalen) injiziert. Zehn 10-cm-Schalen mit MSCs werden benötigt, um genügend EVs zu liefern, um ein Experiment von n = 5 in einem Mausmodell durchzuführen.
      ACHTUNG: Die Injektion von Schwanzvenen aus Mäusen ist in der Regel auf ein Volumen von 200 μl begrenzt. Die Injektion sollte langsam erfolgen und aufhören, wenn Sie eine Beule oder einen Widerstand sehen, was darauf hindeutet, dass die Nadel aus der Vene heraus ist. Wenn die Mäuse unerwünschte klinische Symptome wie Kräuseln und Zittern zeigen, könnte dies eine Schockreaktion auf eine großvolumige Injektion, eine schnelle Injektion oder Toxizität/Anaphylaxie sein.

Results

MVs und Exos aus kultivierten humanen UCMSCs werden nach dem experimentellen Workflow isoliert (Abbildung 1). Die NTA-Ergebnisse zeigen, dass die Größe von Exos aus humanen MSCs von 40 nm bis 335 nm mit einer Peakgröße von etwa 100 nm und die Größe von MVs von 50 nm bis 445 nm mit einer Peakgröße von 150 nm reicht (Abbildung 2). Die morphologische Charakterisierung von MSC-abgeleiteten Exos zeigt eine typische Schalenform (Abbildung 3

Discussion

EVs spielen eine wichtige Rolle bei verschiedenen biologischen Aktivitäten, darunter die Präsentation von Antigenen, der Transport von genetischem Material, die Modifikation der Zellmikroumgebung und andere. Darüber hinaus bringt ihre breite Anwendung neue Ansätze und Möglichkeiten für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten^{mit sich 21}. Die Implementierung therapeutischer Anwendungen von EVs basiert auf der erfolgreichen Isolierung und Charakterisierung. Aufgrund des Fehlens standardisierter I...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Povidon-Jod (Betadin)	Weizhenyuan	10053956954292	Wunddesinfektion
Kalibrierlösung	Particle Metrix	110-0020	Kalibrieren Sie das NTA-Instrument
Carprofen	Sigma	53716-49-7	Analgetische Medizin
Kaudalvenen-Imager	KEW Life Science	KW-XXY	Kaudalvenen-Imager
Zentrifuge	Eppendorf	5418R	Zentrifugation
Tödliches Rinderserum	Corning	35-081-CV	Kultur von UCMSCs
Formvar/kohlenstoffbeschichtetes quadratisches Netz	PBL Assay Science	24916-25	Transmissionselektronenmikroskop
Heizkissen	Zhongke Life Science	Z8G5JBMz	Nachbehandlung von Tieren
Heparinlösung	StemCell	7980	Systemische Injektion
Isofluran	RWD Life Science	R510-22	Tieranästhesie
Minimum Essentielles Medium Alpha basic (1x)	Gibco	C12571500BT	Kultur von UCMSCs
Nanopartikel-Tracking-Analysator	Particle Metrix	ZetaView PMX120	Nanopartikel-Tracking-Analyse
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	Resuspendierung von EVs
Penicillin/Streptomycin	Procell Life Science	PB180120	Kultur von UCMSCs
Phosphotungssäure	Solarbio	12501-23-4	Transmissionselektronenmikroskop
Pipette	Eppendorf	3120000224
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma-Aldrich	MINI26	Labeling EVs
Hautbiopsie-Stanze	Acuderm	69038-10-50	Hautdefekte
Software ZetaView	Particle Metrix	Version 8.05.14 SP7
Thermostat-Geräte	Grant	v-0001-0005
	HITACHI	HT7800	Transmissionselektronenmikroskop
UCMSCs	Bai'ao	UKK220201	Kommerziell UCMSCs
Ultrazentrifuge	Beckman	XPN-100	Zentrifugation
Reinstwasser-Reinigungssystem für gefiltertes Wasser	Milli-Q	IQ 7000	Aufbereitung von Reinstwasser