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Methodenartikel

Im lebenden Organismus Nachweis der vaskulären Permeabilität in der submandibulären Drüse der Maus

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DOI:

10.3791/64167

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4. August 2022

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1Department of Physiology and Pathophysiology, Peking University School of Basic Medical Sciences, Key Laboratory of Molecular Cardiovascular Sciences, Ministry of Education, and Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Peking University School and Hospital of Stomatology & National Center of Stomatology & National Clinical Reseah Center for Oral Diseases & National Engineering Research Center of Oral Biomaterials and Digital Medical Devices, 3State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Im vorliegenden Protokoll wurde die endotheliale Barrierefunktion der submandibulären Drüse (SMG) durch Injektion verschiedener molekulargewichteter Fluoreszenztracer in die Winkelvenen von Versuchstiermodellen in vivo unter einem Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop bewertet.

Zusammenfassung

Speichel spielt eine wichtige Rolle für die Mund- und allgemeine Gesundheit. Die intakte endotheliale Barrierefunktion der Blutgefäße ermöglicht die Speichelsekretion, während die Endothelbarriere-Dysfunktion mit vielen sekretorischen Speicheldrüsenstörungen zusammenhängt. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine in vivo parazelluläre Permeabilitätsnachweismethode zur Bewertung der Funktion von endothelialen Tight Junctions (TJs) in submandibulären Drüsen (SMG) der Maus. Zunächst wurden fluoreszenzmarkierte Dextrans mit unterschiedlichen Molekulargewichten (4 kDa, 40 kDa oder 70 kDa) in die eckigen Venen von Mäusen injiziert. Danach wurde das einseitige SMG seziert und in der kundenspezifischen Halterung unter einem Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop fixiert, und dann wurden Bilder für Blutgefäße, Akini und Kanäle aufgenommen. Mit dieser Methode wurde die dynamische Echtzeit-Leckage der unterschiedlich großen Tracer von Blutgefäßen in die basalen Seiten der Acini und sogar über die Azinusepithelien in die Kanäle überwacht, um die Veränderung der endothelialen Barrierefunktion unter physiologischen oder pathophysiologischen Bedingungen zu bewerten.

Einleitung

Verschiedene Speicheldrüsen produzieren Speichel, der in erster Linie als erste Verteidigungslinie gegen Infektionen fungiert und die Verdauung unterstützt und dadurch eine wesentliche Rolle für die Mund- und allgemeine Gesundheit spielt1. Die Blutversorgung ist entscheidend für die Speicheldrüsensekretion, da sie ständig Wasser, Elektrolyte und Moleküle liefert, die den primären Speichel bilden. Die endotheliale Barrierefunktion, die durch den Tight Junction (TJ)-Komplex reguliert wird, begrenzt streng und empfindlich die Permeation von Kapillaren, die für Wasser, gelöste Stoffe, Proteine und sogar Zellen, die sich von den zirkulierenden Blutgefäßen in das Speicheldrüsengewebe bewegen, sehr durchlässig sind 2,3. Wir haben bereits festgestellt, dass die Öffnung der endothelialen TJs als Reaktion auf einen cholinergen Reiz die Speichelsekretion erleichtert, während die Beeinträchtigung der endothelialen Barrierefunktion mit Hyposekretion und lymphatischer Infiltration in den submandibulären Drüsen (SMGs) beim Sjögren-Syndrom4 verbunden ist. Diese Daten deuten darauf hin, dass dem Beitrag der endothelialen Barrierefunktion in Bezug auf eine Vielzahl von Speicheldrüsenerkrankungen genügend Aufmerksamkeit geschenkt werden muss.

Ein Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Dynamik von Zellen in intaktem Gewebe in vivo zu beobachten. Einer der Vorteile dieser Technik besteht darin, dass Nahinfrarotlicht (NIR) eine tiefere Gewebedurchdringung aufweist als sichtbares oder ultraviolettes Licht, wenn die Proben durch NIR angeregt werden, und unter geeigneten Bedingungen keine offensichtlichen Lichtschäden an Geweben verursacht 5,6. Tatsächlich sind die Speicheldrüsen ein sehr homogenes und oberflächliches Gewebe, in dem die oberflächlichen Azinuszellen nur etwa 30 μm von der Drüsenoberfläche entfernt sind 7,8. Es wurde gezeigt, dass die intravitale konfokale Mikroskopie die exokrine Sekretion und das Aktinzytoskelett in lebenden Mausspeicheldrüsen mit subzellulärer Auflösung untersuchen kann8. Die Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie hat jedoch nicht nur den Vorteil der konventionellen konfokalen Mikroskopie, sondern kann auch verwendet werden, um tieferes Gewebe und Bild klarer zu erkennen. Hier können fluoreszenzmarkierte Dextrans, die häufig als parazelluläre Permeabilitätstracerate eingesetzt werden und den Vorteil unterschiedlicher Größen haben, verwendet werden, um die Größe der TJ-Pore9 zu testen. In der vorliegenden Studie wird eine intravitale Echtzeit-Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie-Technik zur in situ Bewertung der endothelialen Barrierefunktion in Maus-SMGs etabliert. Jeder Arbeitsschritt zur in vivo vaskulären Permeabilitätsdetektion in Maus-SMGs ist im aktuellen Protokoll beschrieben. Hier ist ein Beispiel für die Detektion der endothelialen Barrierefunktion im SMG-Gangligationsmodell der Maus.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission für Tierforschung des Gesundheitswissenschaftlichen Zentrums der Universität Peking genehmigt und entsprachen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH-Publikation Nr. 85-23, überarbeitet 1996). Für die vorliegende Studie wurden männliche Wildtyp-Mäuse (WT) in der Altersgruppe von 8-10 Wochen verwendet. Die Versuchstiere wurden sorgfältig behandelt, um ihre Schmerzen und Beschwerden zu minimieren.

1. Verfahren für Tiere

  1. Bereiten Sie die Anästhetika und Tracer vor und verabreichen Sie sie.
    1. Halten Sie während der gesamten Studie sterile Bedingungen aufrecht und sterilisieren Sie die Instrumente durch Autoklavieren. Teilen Sie die Mäuse in zwei Gruppen ein.
      HINWEIS: Die Kontrollgruppe wurde unbehandelt gelassen, und die andere Gruppe mit einseitiger SMG-Gangligatur für 1 Tag diente als experimentelle Gruppe. Bei der Gruppierung müssen Mäuse mit ähnlichem Körpergewicht und Alter ausgewählt werden, um den Einfluss von Gewicht und Alter auf die Gefäßpermeabilität zu reduzieren.
    2. Wählen Sie geeignete Tracer wie Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-markiertes Dextran (Molekulargewicht: 4 kDa; FD4) und Rhodamin B-markiertes Dextran (Molekulargewicht: 70 kDa; RD70) (siehe Materialtabelle) mit ausgeprägten Anregungs-/Emissionsspektren zur Minimierung der Interferenz zwischen Fluoreszenzsignalen (unter Verwendung des FITC- bzw. Rhodamin-B-Filters) für den Permeabilitätstest.
      HINWEIS: Die Anregungswellenlängen von FD4 und RD70 betragen 488 nm bzw. 594 nm, und die ausgewählten Emissionswellenlängen sind 511-564 nm bzw. 617-669 nm.
    3. Die Tracer werden in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) in 100 mg/ml Brühen verdünnt und die vor Licht geschützten Aliquots bei −20 °C gelagert.
      HINWEIS: Dextran mit einem Molekulargewicht von 4 kDa tritt in Maus-SMGs auch ohne pathologische Zustände schnell aus dem Blut aus10.
    4. Intraperitoneal injizieren Sie das Tribromethanol (die Dosis für eine 25 g Maus betrug etwa 600 μL), um die Mäuse zu betäuben. Geben Sie Analgesie, wie von der örtlichen Tierethikkommission empfohlen.
      HINWEIS: Verwenden Sie nach der Einleitung der Anästhesie Tierarztsalbe auf den Augen, um Trockenheit zu verhindern. Passen Sie gut auf die Tiere auf11. Warten Sie, bis die Maus eine mechanische Stimulation toleriert, z. B. das Kneifen der Zehe ohne motorische Reaktion.
    5. Injizieren Sie eine Mischung aus zwei parazellulären Permeabilitätstracern mit unterschiedlichen Molekulargewichten (FD4 und RD70) in die Winkelvene (0,5 mg/g Körpergewicht). Injizieren Sie jeder Maus eine 100-μL-Tracerlösungsmischung, wobei 50 μL jedes Farbstoffs im Verhältnis 1:1 gemischt werden.
      1. Halten Sie nach der Anästhesie sanft den Kopf und den Hals der Maus, damit eine Seite des Augapfels leicht hervorsteht. Führen Sie eine Insulinspritze mit fluoreszierenden Tracern (achten Sie darauf, keine Luft in die Spritze einzuführen) im rechten Winkel zum Auge in den Augenwinkel ein.
        HINWEIS: Wenn die Winkelvene korrekt eingeführt wird, wird die Farbstofflösung leicht in die Vene injiziert, und während der Injektion besteht kein Widerstand. Darüber hinaus könnte die Schwanzveneninjektion bei Mäusen auch ein Kandidat für intravenöse Tracermoleküle sein.
  2. Führen Sie die SMG-Isolierung mit den folgenden Schritten durch.
    HINWEIS: Verwenden Sie sterile Werkzeuge, einschließlich Gewebescheren und Trennnickel, für die Operation.
    1. Trennen Sie eine einseitige Drüse vorsichtig, um die umliegenden Blutgefäße und Nerven unter einem stereoskopischen Mikroskop nicht zu beschädigen.
      1. Nach der Injektion von parazellulären Permeabilitätstracern legen Sie die Mäuse schnell auf den Karton und legen Sie sie in Rückenlage mit geklebten Gliedmaßen und Köpfen. Tragen Sie eine Haarentfernungscreme auf die Halshaut auf, um die Haare der Maus zu entfernen. Verwenden Sie 75% Ethanol, um die Haut vor der Operation zu desinfizieren.
      2. Schneiden Sie dann unter einem Stereomikroskop die Epidermis des Halses mit einer allgemeinen Gewebeschere ab, um beide Seiten der SMGs freizulegen (die rechte Drüse wurde in diesem Experiment behandelt). Als nächstes verwenden Sie ein stumpfes Gewebetrennungsnickel (siehe Materialtabelle), um die Kapsel vorsichtig von der Drüsenoberfläche zu trennen, wobei darauf zu achten ist, das Drüsengewebe und die Blutgefäße nicht zu beschädigen.
      3. Trennen Sie die Kapsel von der Drüsenoberfläche, ohne die Drüsenstruktur zu beschädigen. Stellen Sie außerdem sicher, dass der gesamte Prozess der Mausrückhaltung und Drüsentrennung innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen ist.

2. Aufbau des Zwei-Photonen-Mikroskops

  1. Schließen Sie die kundenspezifische Halterung an das Unterdruckgerät an und prüfen Sie im Vorfeld, ob der Unterdruckeffekt richtig erreicht wird.
    HINWEIS: Der Halter hat die Form einer Miniaturlupe mit einem flachen Stück rundem Glas in der Mitte (Durchmesser: 4,32 mm, Abbildung 1). Das Unterdruckgerät wurde im eigenen Haus so konstruiert, dass der Halter mit einem Gummischlauch, der mit einer Drainageflasche verbunden ist, verbunden ist und die Flasche über einen kurzen Gummischlauch am Unterdruckregler befestigt wird. Auf diese Weise kann der Unterdruckregler den Druck anpassen, um sicherzustellen, dass das Gewebe in den Halter gesaugt wird.
    1. Verbinden Sie eine Seite des Halters mit dem Unterdruckgerät. Um zu testen, ob das Unterdruckgerät intakt und geeignet ist, drehen Sie den Halter auf den Kopf, fügen Sie einen Tropfen Wasser hinzu und stellen Sie den Unterdruckwert auf 20 Einheiten ein. Wird das Wasser vollständig und schnell abgesaugt, wird das Unterdruckgerät erfolgreich mit der Halterung installiert.
  2. Legen Sie das freiliegende SMG der Maus vorsichtig auf den angepassten Halter und saugen Sie das Gewebe durch Unterdruckabsaugung so weit wie möglich vom Mauskörper weg, um Bewegungsartefakte zu reduzieren, die durch Atmung und andere Bedingungen verursacht werden.
  3. Stellen Sie das an der Drüse befestigte Stützmaterial unter einem 25x/NA 1.0 Wasserimmersionsobjektiv (speziell für NIR) vor.
    HINWEIS: Verwenden Sie in diesem Experiment ein aufrechtes Zwei-Photonen-Mikroskop (siehe Materialtabelle). Die Blutgefäße müssen sofort mit offensichtlicher Fluoreszenz nach der Tracerinjektion sichtbar sein.

3. Gefäßbildgebung und Permeabilitätserkennung

  1. Beginnen Sie mit der Bildgebung, kurz nachdem der Anblick der Drüse ausgewählt wurde.
    HINWEIS: In der Regel werden Zeitreihen von 45-50 Bildern in 20 s oder länger je nach Versuchsdesign aufgenommen.
  2. Erfassen Sie sequentielle Bilder entlang der Z-Achse, die 2 μm voneinander entfernt sind, von der Oberfläche der Drüse bis zu 70-140 μm in das Gewebe, um eine dreidimensionale (3D) Konstruktion zu erzeugen.
  3. Erfassen Sie Zeitrafferaufnahmen der Gefäße, um die vaskuläre Permeabilität im SMG zu messen.
    HINWEIS: Stellen Sie die Bedingungen des Programmmenüs nach dem Ausführen der Mikroskopsoftware wie folgt ein (siehe Materialtabelle).
    1. Klicken Sie im Explorer-Dialog auf Neuen Ordner hinzufügen und ändern Sie den Dateinamen.
    2. Kehren Sie zur Spalte Akquisition zurück. In XY beträgt das Format 512 x 512 und die Geschwindigkeit 400 Hz. Schalten Sie bidirektionales X ein.
    3. Stellen Sie den Zoomfaktor auf 0,75 und 1,5 für Zoom ein.
    4. Um Zeitrafferaufnahmen zu erstellen, wählen Sie xyt unter Aufnahmemodus aus. Stellen Sie die Dauer je nach experimentellem Bedarf auf 20 s, 30 min oder länger ein.
    5. Um die 3D-Konstruktion durchzuführen, stellen Sie den Erfassungsmodus auf xyz ein. Die Z-Step-Größe kann entsprechend der tatsächlichen Situation eingestellt werden.
    6. Nachdem Sie die Bedingungen eingestellt haben, klicken Sie auf Live , um die vaskuläre Bildgebung von zwei Kanälen und überlappenden Kanälen im Fotoformungsrahmen zu beobachten und die gewünschten Bereiche auszuwählen.
    7. Klicken Sie auf Start , um das Imaging zu starten.
      HINWEIS: Die Maus darf während des Bildgebungsvorgangs während der Narkose nicht unbeaufsichtigt gelassen werden.

4. Datenanalyse

  1. Um die Gefäßpermeabilität zu bewerten, verwenden Sie die Image J-Software, um das Fluoreszenzintensitätsverhältnis von FD4 und RD70 zwischen den äußeren und inneren Gefäßen zu berechnen und sie als extra- und intravaskuläre Intensität4 zu bezeichnen.
    HINWEIS: Die Veränderung der vaskulären Permeabilität durch die Verfolgung des Dextranstransports spiegelt die Veränderung der endothelialen Barrierefunktion wider. Beobachten Sie außerdem die vaskuläre Morphologie und Dichte, indem Sie den Durchmesser und die Anzahl der Gefäßveränderungen berechnen.
    1. Führen Sie die Image J-Software aus (siehe Materialtabelle).
    2. Klicken Sie auf Datei und wählen Sie Öffnen , um die unter dem Zwei-Photonen-Mikroskop aufgenommenen Blutgefäßbilder zu öffnen.
    3. Wählen Sie Bild und legen Sie Typ auf 16-Bit fest, um das Bildformat zu konvertieren.
    4. Wählen Sie Analysieren und dann unter Messungen festlegen die Option Fläche, Mittelwert und IntDen aus. Klicken Sie zur Bestätigung auf OK.
    5. Wählen Sie unter Analysieren die Option Extras aus, öffnen Sie ROI Manager und wählen Sie Alle anzeigen und Beschriftungen aus.
    6. Messen Sie den intravaskulären Fluoreszenzintensitätswert: Klicken Sie auf das Lasso-Tool auf der Hauptoberfläche, um den Umriss des Blutgefäßes zu skizzieren. Klicken Sie im ROI-Manager auf Hinzufügen. Folgen Sie diesem Schritt, um mit der Auswahl mehrerer Schiffe fortzufahren. Wählen Sie alle Objekte des ROI-Managers aus und klicken Sie auf Messen.
    7. Messen Sie den Gesamtwert für die Fluoreszenzintensität: Skizzieren Sie das gesamte Bild, klicken Sie auf Messen, und das Ergebnis ist der Gesamtfluoreszenzintensitätswert des Bildes.
    8. Berechnen Sie den Wert für die extravaskuläre Fluoreszenzintensität. Kopieren Sie die Daten zur Berechnung nach Excel. Extravaskuläres Fluoreszenzintensitätsverhältnis = (1 − intravaskulärer Fluoreszenzintensitätswert/Gesamtfluoreszenzintensitätswert) × 100%.

5. Nachgelagerte Anwendungen

  1. Berechnen Sie während des Experiments die Blutflussrate, indem Sie die Entfernung messen, die ein rotes Blutkörperchen (dargestellt als schwarzer Punkt unter dem Zwei-Photonen-Mikroskop)4 in einer Zeitdauer zurücklegt.
  2. Um die Bewegung der Blutzellen durch die Endothelzellen zu visualisieren, markieren Sie die Blutzellen durch Fluoreszenz. Dann injizieren Sie die fluoreszenzmarkierten Zellen mit FD4 oder RD70 über die Mausschwanzvene. Nach dem Umlauf für 5 Minuten verfolgen Sie die interessierten Zellen für einen bestimmten Zeitraum.
    HINWEIS: Insgesamt 2 x 106 CFSE (Carboxyfluorescein-Succinimidylester, ein membrandurchlässiger Fluoreszenzfarbstoff)-markierter Lymphozyten, die aus der Milz von Spendermäusen stammen, wurden durch Schwanzveneninjektion in Empfänger übertragen, und die Infiltration von Lymphozyten in SMGs wurde in experimentellen Tiermodellenuntersucht 4.

6. Tierpflege und -erholung

  1. Passen Sie während des gesamten Experiments gut auf die Tiere auf.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Tier, das einer Operation unterzogen wurde, nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurückgegeben wird, bis es während des Versuchs vollständig genesen ist.
  2. Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder genug Bewusstsein erlangt hat.
    HINWEIS: Beobachten Sie den Atemzustand der Mäuse kontinuierlich und halten Sie sie warm, indem Sie sie auf das Heizkissen des Tieres legen. Bereitstellung von postoperativen Schmerzerholungsunterkünften und Analgesie, wie von der örtlichen Tierethikkommission empfohlen.

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Ergebnisse

Dem Protokoll folgend, wurde das einseitige SMG an einem speziell angefertigten Halter befestigt und die Drüse so weit wie möglich vom Mauskörper entfernt gehalten, um zu verhindern, dass die Atmung Bewegungsartefakte verursacht. Der schnelle Fluss der roten Blutkörperchen (schwarze Punkte) in Blutgefäßen wurde unter dem Mikroskop beobachtet. Nachdem man das Gewebefeld unter einer Augenlinse gefunden hat, muss man umschalten, um die Mikroskopsoftware zu manipulieren. In der Kontrollgruppe befanden sich beide Tracer in de...

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Diskussion

Die Aufrechterhaltung und Regulierung der endothelialen Barrierefunktion sind essentiell für die vaskuläre Homöostase. Endothelzellen und ihre interzellulären Verbindungen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung und Kontrolle der vaskulären Integrität12. Die Scherkraft des Blutflusses, Wachstumsfaktoren und Entzündungsfaktoren können Veränderungen der vaskulären Permeabilität verursachen und somit am Auftreten und der Entwicklung systemischer Erkrankungen wie Bluthochdruck, Diab...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Zuschüsse 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 und 81974151) und der Beijing Natural Science Foundation (Grant 7202082) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-Photonen-Mikroskop (TCS-SP8 DIVE)Leica, Deutschland
4 kDa FITC-markiertes DextranSigma Aldrich46944
70 kDa Rhodamin B-markiertes DextranSigma AldrichR9379
Stumpfe Gewebetrennung NickelBejinghuabo CompanyNZW28
EnthaarungscremeVeet
Sterile EinwegspritzeZhiyu Company1 mL
Image J SoftwareNational Institutes of Health
InsulinspritzeBecton, Dickinson and Company02533161 mL
Leica Application Suite X SoftwareLeica Microsystems Microsystems Microtubes
AxygenMCT-150-C1,5 mL
Phosphat gepuffert Kochsalzlösung 1xServicebioG4207-500
GewebeschereBejinghuabo CompanyM286-05
TribromoethanolJITIAN BioJT0781

Referenzen

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