Isolierung und direkte neuronale Reprogrammierung von Maus-Astrozyten

Bob A. Hersbach; Tatiana Simon; Giacomo Masserdotti

doi:10.3791/64175

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Methodenartikel

Isolierung und direkte neuronale Reprogrammierung von Maus-Astrozyten

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DOI:

10.3791/64175

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7. Juli 2022

Bob A. Hersbach¹^,²^,³ , Tatiana Simon² , Giacomo Masserdotti¹^,²

¹Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, ²Department of Physiological Genomics, Biomedical Center Munich, Ludwig-Maximilians University, ³Graduate School of Systemic Neurosciences, BioCenter, Ludwig-Maximilians University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung hochangereicherter Kulturen von Astrozyten, die aus verschiedenen Regionen des Zentralnervensystems postnataler Mäuse stammen, und deren direkte Umwandlung in funktionelle Neuronen durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren.

Zusammenfassung

Die direkte neuronale Reprogrammierung ist ein leistungsfähiger Ansatz, um funktionelle Neuronen aus verschiedenen Starterzellpopulationen zu erzeugen, ohne multipotente Zwischenprodukte zu durchlaufen. Diese Technik verspricht nicht nur im Bereich der Krankheitsmodellierung große Versprechungen, da sie es beispielsweise ermöglicht, Fibroblasten für Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen in Neuronen umzuwandeln, sondern stellt auch eine vielversprechende Alternative für zellbasierte Ersatztherapien dar. Ein großer wissenschaftlicher Durchbruch war in diesem Zusammenhang der Nachweis, dass differenzierte nicht-neuronale Zellen innerhalb des Zentralnervensystems, wie Astrozyten, in vitro in funktionelle Neuronen umgewandelt werden können. Seitdem hat die direkte In-vitro-Reprogrammierung von Astrozyten in Neuronen substanzielle Einblicke in die molekularen Mechanismen geliefert, die der erzwungenen Identitätsumwandlung zugrunde liegen, und die Hürden, die eine effiziente Reprogrammierung verhindern. Die Ergebnisse von In-vitro-Experimenten, die in verschiedenen Labors durchgeführt wurden, sind jedoch aufgrund der Unterschiede in den Methoden zur Isolierung, Kultur und Neuprogrammierung von Astrozyten schwer zu vergleichen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur zuverlässigen Isolierung und Kultivierung von Astrozyten mit hoher Reinheit aus verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems von Mäusen im postnatalen Alter mittels Magnetzellsortierung. Darüber hinaus bieten wir Protokolle zur Umprogrammierung kultivierter Astrozyten in Neuronen durch virale Transduktion oder DNA-Transfektion an. Mit diesem schlanken und standardisierten Protokoll können die molekularen Mechanismen untersucht werden, die der Aufrechterhaltung der Zellidentität, der Etablierung einer neuen neuronalen Identität sowie der Generierung spezifischer neuronaler Subtypen und ihrer funktionellen Eigenschaften zugrunde liegen.

Einleitung

Das zentrale Nervensystem (ZNS) von Säugetieren ist hochkomplex und besteht aus Hunderten von verschiedenen Zelltypen, darunter eine große Anzahl verschiedener neuronaler Subtypen 1,2,3,4,5,6. Im Gegensatz zu anderen Organen oder Geweben ^7,8,9 hat das ZNS von Säugetieren eine sehr begrenzte Regenerationsfähigkeit; Der neuronale Verlust nach einer traumatischen Hirnverletzung oder ....