Ein Protokoll zur fluoreszierenden, durchflusszytometrischen Quantifizierung von seneszenten Krebszellen, die durch Chemotherapeutika in Zellkultur oder in murinen Tumormodellen induziert werden, wird vorgestellt. Optionale Verfahren umfassen die Co-Immunfärbung, die Probenfixierung zur Erleichterung der Analyse großer Chargen oder Zeitpunkte sowie die Anreicherung lebensfähiger seneszenter Zellen durch durchflusszytometrische Sortierung.
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Methodenartikel
Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zelluläre Seneszenz ist ein Zustand des proliferativen Stillstands, der durch biologische Schäden induziert wird, der normalerweise über Jahre in alternden Zellen entsteht, aber auch schnell in Tumorzellen als Reaktion auf Schäden auftreten kann, die durch verschiedene Krebsbehandlungen induziert werden. Die Seneszenz von Tumorzellen wird im Allgemeinen als unerwünscht angesehen, da alternde Zellen gegen den Tod resistent werden und die Tumorremission blockieren, während sie die Tumormalignität und die Behandlungsresistenz verschlimmern. Daher ist die Identifizierung von seneszenten Tumorzellen von anhaltendem Interesse für die Krebsforschungsgemeinschaft. Es gibt verschiedene Seneszenzassays, von denen viele auf der Aktivität des bekannten Seneszenzmarkers basieren, der Seneszenz-assoziierten Beta-Galactosidase (SA-β-Gal).
Typischerweise wird der SA-β-Gal-Assay unter Verwendung eines chromogenen Substrats (X-Gal) an festen Zellen durchgeführt, wobei die langsame und subjektive Zählung von "blauen" alternden Zellen durch Lichtmikroskopie durchgeführt wird. Verbesserte Assays mit zellpermeanten, fluoreszierenden SA-β-Gal-Substraten, einschließlich C12-FDG (grün) und DDAO-Galactosid (DDAOG; weit rot), haben die Analyse lebender Zellen ermöglicht und die Verwendung von Hochdurchsatz-Fluoreszenzanalyseplattformen, einschließlich Durchflusszytometern, ermöglicht. C12-FDG ist eine gut dokumentierte Sonde für SA-β-Gal, aber ihre grün fluoreszierende Emission überlappt sich mit der intrinsischen zellulären Autofluoreszenz (AF), die während der Seneszenz aufgrund der Akkumulation von Lipofuszin-Aggregaten entsteht. Durch die Verwendung der tiefroten SA-β-Gal-Sonde DDAOG kann die grünzelluläre Autofluoreszenz als sekundärer Parameter zur Bestätigung der Seneszenz verwendet werden, was die Zuverlässigkeit des Assays erhöht. Die verbleibenden Fluoreszenzkanäle können für die Färbung der Zelllebensfähigkeit oder die optionale fluoreszierende Immunmarkierung verwendet werden.
Mit Hilfe der Durchflusszytometrie demonstrieren wir die Verwendung von DDAOG und Lipofuszin-Autofluoreszenz als Dual-Parameter-Assay zur Identifizierung von seneszenten Tumorzellen. Es wird eine Quantifizierung des Prozentsatzes lebensfähiger seneszenter Zellen durchgeführt. Falls gewünscht, kann ein optionaler Immunmarkierungsschritt enthalten sein, um die interessierenden Antigene der Zelloberfläche zu bewerten. Identifizierte seneszente Zellen können auch flusszytometrisch sortiert und für die nachgeschaltete Analyse gesammelt werden. Gesammelte seneszente Zellen können sofort lysiert (z. B. für Immunoassays oder Omics-Analysen) oder weiter kultiviert werden.
Einleitung
Seneszente Zellen sammeln sich normalerweise während des normalen biologischen Alterns über Jahre in Organismen an, können sich aber auch schnell in Tumorzellen als Reaktion auf Schäden entwickeln, die durch verschiedene Krebsbehandlungen, einschließlich Bestrahlung und Chemotherapie, verursacht werden. Obwohl sie sich nicht mehr vermehren, können therapieinduzierte seneszente (TIS) Tumorzellen zur Behandlungsresistenz beitragen und ein Rezidiv bewirken 1,2,3. Von TIS-Zellen sezernierte Faktoren können die Tumormalignität verschlimmern, indem sie Immunevasion oder Metastasier....
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Protokoll
Alle beschriebenen Tierarbeiten wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Chicago genehmigt.
1. Aufbereitung und Lagerung von Stammlösungen
HINWEIS: Wenn Zellen durchflusssortiert werden, sollten alle Lösungen mit sterilen Techniken vorbereitet und durch eine 0,22-μm-Filtervorrichtung gefiltert werden.
- Bereiten Sie eine Stammlösung von DDAO-Galactosid bei 5 mg/ml in DMSO vor. Aliquot bei 50 μL pro Röhrchen (oder gewünschtem Volumen). Bei −20 °C im Dunkeln bis zu 1 Jahr lagern.
- Eine Stammlösung von Bafilomycin A1 bei 1 mM in DMSO wird hergestel....
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Ergebnisse
Mehrere Experimente wurden durchgeführt, um die Vergleichbarkeit von DDAOG mit X-Gal und C12-FDG für den Nachweis der Seneszenz durch SA-β-Gal zu demonstrieren. Zunächst wurde X-Gal verwendet, um seneszente B16-F10-Melanomzellen zu färben, die durch ETO induziert wurden (Abbildung 2A). Eine intensive blaue Farbe entwickelte sich in einer Untergruppe von ETO-behandelten Zellen, während andere Zellen eine weniger intensive blaue Färbung aufwiesen. Die Morphologie war in den meisten .......
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Diskussion
In den letzten zehn Jahren hat sich die Durchflusszytometrie aufgrund der zunehmenden Popularität der Tumorimmunologie, der Entwicklung kostengünstigerer Durchflusszytometer und der Verbesserung gemeinsamer Instrumentierungseinrichtungen an akademischen Einrichtungen zu einer immer häufigeren Assay-Plattform in der Krebsforschung entwickelt. Multicolor-Assays sind jetzt Standard, da die meisten neueren Instrumente mit violetten, blau-grünen und roten bis fernroten optischen Arrays ausgestattet sind. Daher ist dieses DDAO.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben für diese Studie keine Interessenkonflikte zu erklären.
Danksagungen
Wir danken der Cytometry and Antibody Core Facility der University of Chicago für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Das Animal Research Center an der University of Chicago stellte Tierunterkünfte zur Verfügung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Bafilomycin A1 | Research Products International | B40500 | |
| Bleomycinsulfat | Cayman | 13877 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | US Biological | A1380 | |
| Calcein Violet 450 AM Viabilitätsfarbstoff | ThermoFisher Scientific | 65-0854-39 | eBioscience |
| DPP4 Antikörper, PE-Konjugat | Biolegend | 137803 | Klon H194-112 |
| Zelllinie: A549 menschliches Lungenadenokarzinom | American Type Culture Collection | CCL-185 | |
| Zelllinie: B16-F10 Mausmelanom | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| Zellschaber | Corning | 3008 | |
| Zellsiebe, 100 & Mikro; m | Falcon | 352360 | |
| DDAO-Galactosid | Life Technologies | D6488 | |
| DMEM Medium 1x | Life Technologies | 11960-069 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| DNAse I | Sigma | DN25 | |
| Doxorubicin, Hydrochlorid-Injektion (USP) | Pfizer | NDC 0069-3032-20 | |
| Doxorubicin, PEGyliertes liposomales (USP) | Sun Pharmaceutical | NDC 47335-049-40 | |
| EDTA 0,5 M | Life Technologies | 15575-038 | |
| Etoposid | Cayman | 12092 | |
| FBS | Omega | FB-11 | |
| Fc-Rezeptor-Blockierungsreagenz | Biolegend | 101320 | Anti-Maus CD16/32 |
| Durchflusszytometer (Zellanalysator) | Becton Dickinson (BD) | Verschiedenes | LSRFortessa |
| Durchflusszytometer (Zellsortierer) | Becton Dickinson (BD) | Verschiedenes | FACSAria |
| GlutaMax 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES 1 M | Lonza | BW17737 | |
| Liberase TL | Sigma | 5401020001 | Roche |
| Paraformaldehyd 16% | Elektronenmikroskopie | Sciences 15710 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Life Technologies | 15140122 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1x | Corning | MT21031CV | Dulbecco's PBS (ohne Calcium und Magnesium) |
| Regenbogen-Kalibrierpartikel, Ultra-Kit | SpheroTech | UCRP-38-2K | 3.5-3.9 µ m, 2E6/mL |
| RPMI-1640 mittel 1x | Life Technologies | 11875-119 | |
| Natriumchlorid 0,9% (USP) | Baxter Healthcare Corporation | 2B1324 | |
| Software zur Erfassung von Zytometerdaten, "FACSDiva" | Becton Dickinson (BD) | n/a | Kontaktieren Sie BD für Lizenz |
| Software zur Analyse von Zytometerdaten, "FlowJo" | TreeStar | n/a | Kontaktieren Sie TreeStar für die Lizenz |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-114 |
Referenzen
- Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
- Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: fri....
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Nachdrucke und Genehmigungen
