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Methodenartikel

Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie

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DOI:

10.3791/64176

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13. September 2022

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Protokoll zur fluoreszierenden, durchflusszytometrischen Quantifizierung von seneszenten Krebszellen, die durch Chemotherapeutika in Zellkultur oder in murinen Tumormodellen induziert werden, wird vorgestellt. Optionale Verfahren umfassen die Co-Immunfärbung, die Probenfixierung zur Erleichterung der Analyse großer Chargen oder Zeitpunkte sowie die Anreicherung lebensfähiger seneszenter Zellen durch durchflusszytometrische Sortierung.

Zusammenfassung

Zelluläre Seneszenz ist ein Zustand des proliferativen Stillstands, der durch biologische Schäden induziert wird, der normalerweise über Jahre in alternden Zellen entsteht, aber auch schnell in Tumorzellen als Reaktion auf Schäden auftreten kann, die durch verschiedene Krebsbehandlungen induziert werden. Die Seneszenz von Tumorzellen wird im Allgemeinen als unerwünscht angesehen, da alternde Zellen gegen den Tod resistent werden und die Tumorremission blockieren, während sie die Tumormalignität und die Behandlungsresistenz verschlimmern. Daher ist die Identifizierung von seneszenten Tumorzellen von anhaltendem Interesse für die Krebsforschungsgemeinschaft. Es gibt verschiedene Seneszenzassays, von denen viele auf der Aktivität des bekannten Seneszenzmarkers basieren, der Seneszenz-assoziierten Beta-Galactosidase (SA-β-Gal).

Typischerweise wird der SA-β-Gal-Assay unter Verwendung eines chromogenen Substrats (X-Gal) an festen Zellen durchgeführt, wobei die langsame und subjektive Zählung von "blauen" alternden Zellen durch Lichtmikroskopie durchgeführt wird. Verbesserte Assays mit zellpermeanten, fluoreszierenden SA-β-Gal-Substraten, einschließlich C12-FDG (grün) und DDAO-Galactosid (DDAOG; weit rot), haben die Analyse lebender Zellen ermöglicht und die Verwendung von Hochdurchsatz-Fluoreszenzanalyseplattformen, einschließlich Durchflusszytometern, ermöglicht. C12-FDG ist eine gut dokumentierte Sonde für SA-β-Gal, aber ihre grün fluoreszierende Emission überlappt sich mit der intrinsischen zellulären Autofluoreszenz (AF), die während der Seneszenz aufgrund der Akkumulation von Lipofuszin-Aggregaten entsteht. Durch die Verwendung der tiefroten SA-β-Gal-Sonde DDAOG kann die grünzelluläre Autofluoreszenz als sekundärer Parameter zur Bestätigung der Seneszenz verwendet werden, was die Zuverlässigkeit des Assays erhöht. Die verbleibenden Fluoreszenzkanäle können für die Färbung der Zelllebensfähigkeit oder die optionale fluoreszierende Immunmarkierung verwendet werden.

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie demonstrieren wir die Verwendung von DDAOG und Lipofuszin-Autofluoreszenz als Dual-Parameter-Assay zur Identifizierung von seneszenten Tumorzellen. Es wird eine Quantifizierung des Prozentsatzes lebensfähiger seneszenter Zellen durchgeführt. Falls gewünscht, kann ein optionaler Immunmarkierungsschritt enthalten sein, um die interessierenden Antigene der Zelloberfläche zu bewerten. Identifizierte seneszente Zellen können auch flusszytometrisch sortiert und für die nachgeschaltete Analyse gesammelt werden. Gesammelte seneszente Zellen können sofort lysiert (z. B. für Immunoassays oder Omics-Analysen) oder weiter kultiviert werden.

Einleitung

Seneszente Zellen sammeln sich normalerweise während des normalen biologischen Alterns über Jahre in Organismen an, können sich aber auch schnell in Tumorzellen als Reaktion auf Schäden entwickeln, die durch verschiedene Krebsbehandlungen, einschließlich Bestrahlung und Chemotherapie, verursacht werden. Obwohl sie sich nicht mehr vermehren, können therapieinduzierte seneszente (TIS) Tumorzellen zur Behandlungsresistenz beitragen und ein Rezidiv bewirken 1,2,3. Von TIS-Zellen sezernierte Faktoren können die Tumormalignität verschlimmern, indem sie Immunevasion oder Metastasierung fördern 4,5. TIS-Zellen entwickeln komplexe, kontextspezifische Phänotypen, veränderte Stoffwechselprofile und einzigartige Immunantworten 6,7,8. Daher ist die Identifizierung und Charakterisierung von TIS-Tumorzellen, die durch verschiedene Krebsbehandlungsansätze induziert werden, ein Thema von anhaltendem Interesse für die Krebsforschungsgemeinschaft.

Zum Nachweis von TIS-Tumorzellen sind konventionelle Seneszenz-Assays weit verbreitet, die hauptsächlich auf dem Nachweis einer erhöhten Aktivität des Seneszenzmarkerenzyms, der lysosomalen Beta-Galactosidase GLB19, basieren. Der Nachweis bei einem nahezu neutralen (statt sauren) lysosomalen pH-Wert ermöglicht den spezifischen Nachweis von Seneszenz-assoziierter Beta-Galactosidase (SA-β-Gal)10. Ein seit mehreren Jahrzehnten verwendeter Standard-SA-β-Gal-Assay verwendet X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid), ein blau-chromogenes Beta-Galactosidase-Substrat, um SA-β-Gal in fixierten Zellen lichtmikroskopischnachzuweisen11. Der X-Gal-Assay ermöglicht die qualitative visuelle Bestätigung von TIS unter Verwendung handelsüblicher Reagenzien und Laborgeräte. Ein einfaches Durchlichtmikroskop ist das einzige Instrument, das erforderlich ist, um das Vorhandensein des blauen Chromogens zu bewerten. Das X-Gal-Färbeverfahren kann jedoch nicht empfindlich sein und manchmal mehr als 24 Stunden dauern, bis sich die Farbe entwickelt. Auf die Färbung folgt eine subjektive Bewertung einzelner seneszenter Zellen mit niedrigem Durchsatz, basierend auf der Zählung der Zellen, die eine gewisse Intensität des blauen Chromogens unter einem Lichtmikroskop aufweisen. Da X-Gal zellundurchlässig ist, erfordert dieser Assay lösungsmittelfixierte Zellen, die für die nachgeschaltete Analyse nicht gewonnen werden können. Bei der Arbeit mit begrenzten Proben von Tieren oder Patienten kann dies ein großer Nachteil sein.

Verbesserte SA-β-Gal-Assays unter Verwendung zellpermeanter, fluoreszierender Enzymsubstrate, einschließlich C 12-FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranosid, grün) und DDAOG (9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on-7-yl) β-D-Galactopyranosid, weit rot) sind bereits in der Literaturerschienen 12,13,14,15. Die chemische Sondenstruktur und die optischen Eigenschaften von DDAOG sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt. Diese zellpermeierten Sonden ermöglichen die Analyse lebender (und nicht fixierter) Zellen, und fluoreszierende statt chromogene Sonden erleichtern die Verwendung von schnellen Hochdurchsatz-Fluoreszenzanalyseplattformen, einschließlich High-Content-Screening-Instrumenten und Durchflusszytometern. Sortierdurchflusszytometer ermöglichen die Gewinnung angereicherter Populationen lebender alternder Zellen aus Zellkulturen oder Tumoren für die nachgeschaltete Analyse (z. B. Western Blotting, ELISA oder Omics). Die Fluoreszenzanalyse liefert auch ein quantitatives Signal, das eine genauere Bestimmung des Prozentsatzes der alternden Zellen innerhalb einer bestimmten Probe ermöglicht. Zusätzliche Fluoreszenzsonden, einschließlich Viabilitätssonden und fluorophormarkierter Antikörper, können problemlos für die Multiplexanalyse von Zielen jenseits von SA-β-Gal hinzugefügt werden.

Ähnlich wie DDAOG ist C12-FDG eine Fluoreszenzsonde für SA-β-Gal, aber ihre grün fluoreszierende Emission überlappt sich mit intrinsischem zellulärem AF, der während der Seneszenz aufgrund der Akkumulation von Lipofuszin-Aggregaten in Zellen16 entsteht. Durch die Verwendung der tiefroten DDAOG-Sonde kann grüner zellulärer AF als sekundärer Parameter zur Bestätigung der Seneszenzverwendet werden 17. Dies verbessert die Assay-Zuverlässigkeit durch die Verwendung eines zweiten Markers zusätzlich zu SA-β-Gal, der oft als einzelner Marker für die Seneszenz18 unzuverlässig sein kann. Da der Nachweis von endogenem Vorhofflimmern in seneszenten Zellen ein markierungsfreier Ansatz ist, ist es eine schnelle und einfache Möglichkeit, die Spezifität unseres DDAOG-basierten Assays zu erweitern.

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Verwendung von DDAOG und AF als schnellen Dual-Parameter-Durchflusszytometrie-Assay zur Identifizierung lebensfähiger TIS-Tumorzellen aus In-vitro-Kulturen oder isoliert aus medikamentös behandelten Tumoren, die in Mäusen etabliert wurden (Abbildung 1). Das Protokoll verwendet Fluorophore, die mit einer Vielzahl von handelsüblichen Durchflusszytometrie-Analysatoren und -Sortierern kompatibel sind (Tabelle 1). Die Quantifizierung des Prozentsatzes lebensfähiger seneszenter Zellen mittels Standard-Durchflusszytometrie-Analyse ist möglich. Falls gewünscht, kann ein optionaler Immunmarkierungsschritt durchgeführt werden, um die interessierenden Zelloberflächenantigene gleichzeitig mit der Seneszenz zu bewerten. Identifizierte seneszente Zellen können auch mit der Standard-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) angereichert werden.

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Abbildung 1: Experimenteller Workflow. Eine schematische Zusammenfassung der wichtigsten Punkte des DDAOG-Assays. (A) Ein TIS-induzierendes Medikament wird Säugetierkulturzellen zugesetzt oder tumortragenden Mäusen verabreicht. Zeit ist dann für den Beginn der TIS vorgesehen: für Zellen, 4 Tage nach der Behandlung; für Mäuse, insgesamt 22 Tage, mit drei Behandlungen alle 5 Tage plus 7 Tage Erholung. Zellen werden geerntet oder Tumore in Suspension dissoziiert. (B) Die Proben werden mit Baf behandelt, um den lysosomalen pH-Wert für den Nachweis von SA-β-Gal für 30 min einzustellen; dann wird eine DDAOG-Sonde für 60 min hinzugefügt, um SA-β-Gal zu erkennen. Die Proben werden 2x in PBS gewaschen und kurz ein Lebensfähigkeitsfleck hinzugefügt (15 min). Optional können Proben in offenen Fluoreszenzkanälen mit fluoreszierenden Antikörpern angefärbt und/oder für eine spätere Analyse fixiert werden. (C) Die Proben werden mit einem Standard-Durchflusszytometer analysiert. Lebensfähige Zellen werden in Punktdiagrammen visualisiert, die rotes DDAOG (was SA-β-Gal anzeigt) versus grüne Autofluoreszenz (Lipofuszin) zeigen. Ein Gate zur Bestimmung des Prozentsatzes der TIS-Zellen wird basierend auf unbehandelten Kontrollproben (nicht gezeigt) erstellt. Wenn ein Sortierzytometer (FACS) verwendet wird, können TIS-Zellen gesammelt und für weitere In-vitro-Assays wieder in Kultur gebracht oder für molekularbiologische Assays lysiert und verarbeitet werden. Abkürzungen: DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; TIS = therapieinduzierte Seneszenz; FL-Ab = fluorophorkonjugierter Antikörper; Baf = Bafilomycin A1; SA-β-Gal = Seneszenz-assoziierte Beta-Galaktosidase; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

FluorophorErkenntEx/Em (nm)Zytometerlaser (nm)Zytometerdetektor / Bandpassfilter (nm)
DDAOGSA-β-Gal645/6601640670 / 30
AFLipofuszin< 600488525 / 50
CV450Lebensfähigkeit408/450405450 / 50
PEAntikörper/Oberflächenmarker565/578561582 / 15

Tabelle 1: Optische Spezifikationen für Fluorophore und Zytometer. Die in diesem Protokoll verwendeten Zytometerspezifikationen sind für ein Gerät mit insgesamt 4 Lasern und 15 Emissionsdetektoren aufgeführt. DDAOG, das bei 645/660 nm nachgewiesen wird, ist die Form der Sonde, die von SA-β-Gal1 gespalten wurde. Unspaltetes DDAOG kann bei 460/610 nm eine geringe Fluoreszenz aufweisen, wird aber durch Waschschritte im Protokoll entfernt. Abkürzungen: DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; AF = Autofluoreszenz; PE = Phycoerythrin; SA-β-Gal = Seneszenz-assoziierte Beta-Galaktosidase.

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Protokoll

Alle beschriebenen Tierarbeiten wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Chicago genehmigt.

1. Aufbereitung und Lagerung von Stammlösungen

HINWEIS: Wenn Zellen durchflusssortiert werden, sollten alle Lösungen mit sterilen Techniken vorbereitet und durch eine 0,22-μm-Filtervorrichtung gefiltert werden.

  1. Bereiten Sie eine Stammlösung von DDAO-Galactosid bei 5 mg/ml in DMSO vor. Aliquot bei 50 μL pro Röhrchen (oder gewünschtem Volumen). Bei −20 °C im Dunkeln bis zu 1 Jahr lagern.
  2. Eine Stammlösung von Bafilomycin A1 bei 1 mM in DMSO wird hergestellt. Aliquot bei 50 μL pro Röhrchen (oder gewünschtem Volumen). Bei −20 °C bis zu 6 Monate lagern.
  3. Bereiten Sie eine Stammlösung von Calcein Violet 450 AM bei 1 mM in DMSO vor. Aliquot bei 50 μL pro Röhrchen (oder gewünschtem Volumen). Bei −20 °C im Dunkeln bis zu 1 Jahr lagern.
  4. Zur Behandlung kultivierter Zellen in vitro 10 mM konzentrierte Stammlösungen von Seneszenz-induzierenden Wirkstoffen in dem geeigneten Lösungsmittel herstellen und mit 0,2 μm Spritzenfiltern sterilisieren. Bei −20 °C oder nach Anweisung des Herstellers lagern.
    HINWEIS: Für die Verabreichung von seneszenzinduzierenden Chemotherapeutika in vivo (an Mäuse mit etablierten Tumoren) sollten die Wirkstoffe USP-Grad haben und kurz vor der Injektion aus konzentriertem Bestand zu Kochsalzlösung verdünnt werden.
  5. Bereiten Sie das komplette Kulturmedium für die verwendete(n) Zelllinie(n) vor.
    HINWEIS: Bereiten Sie beispielsweise Medium für B16-F10- oder A549-Zellen mit DMEM 1x + 10% FBS + 1x Glutaminersatz + 1x Penicillin / Streptomycin vor. Medien müssen steril gehalten werden. Andere zelllinienspezifische Medienformulierungen können verwendet werden. Bestimmte Komponenten wie Glutathion können in einigen Fällen den Beginn der Seneszenz stören. Empirische Tests verschiedener Medienformulierungen sollten durchgeführt werden, wenn der Beginn der Seneszenz geringer ist als erwartet oder nicht mit Kontrollchemotherapeutika beobachtet wird.
  6. Bereiten Sie Färbe- und Waschpuffer vor.
    1. Bereiten Sie 1% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS zur Verwendung bei Färbeverfahren vor. 2 g BSA werden in 200 ml PBS gelöst und 10 min oder bis zur vollständigen Auflösung bei Raumtemperatur gerührt.
    2. 0,5% BSA in 1x PBS als Waschpuffer zubereiten. 100 ml des in Schritt 1.6.1 hergestellten 1%igen BSA werden zu 100 ml 1x PBS für 0,5% BSA verdünnt.
    3. Puffer bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern.
  7. Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd in 1x PBS vor. Verwenden Sie handelsübliche, versiegelte Paraformaldehydampullen (z. B. 16% v / v) für Komfort und Stabilität: 2,5 ml 16% PFA + 7,5 ml 1x PBS (= 10 mL 4% PFA). Passen Sie das vorbereitete Volumen in Abhängigkeit vom Gesamtvolumen an, das pro Experiment benötigt wird.
    HINWEIS: Bereiten Sie sich nach Bedarf nur auf die Zellfixierung vor; Jedes Mal frisch zubereiten.
  8. FACS-Sortierpuffer vorbereiten: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% BSA (pH 7,2). Sterilfiltrieren durch eine 0,22 μm Filtervorrichtung und bei 4 °C bis zu 1 Monat lagern.
    HINWEIS: Bereiten Sie sich nach Bedarf nur für die FACS-Sortierung vor. Die Formulierungen der Durchflusssortierpuffer können je nach FACS-Instrument variieren. Die obige Formulierung ist kompatibel mit dem in dieser Studie verwendeten Instrument (siehe Materialtabelle). Konsultieren Sie die Richtlinien des Herstellers.
  9. Tumordissoziationslösung vorbereiten: 20 μg/ml Liberase TL + 100 μg/ml DNAse I in RPMI-1640-Medien (ohne FBS oder andere Ergänzungen). Stammlösungen sind nützlich, um Liberase TL (hergestellt und gelagert nach Anweisung des Herstellers) und DNAse I (100 mg/ml in doppelt destilliertem Wasser [ddH2O], gelagert bei −20 °C) bereitzuhalten.
    HINWEIS: Bereiten Sie sich nach Bedarf vor, wenn Sie nur Tumore verwenden; Jedes Mal frisch zubereiten.

2. Induktion der Seneszenz durch Chemotherapeutika in kultivierten Krebszellen

HINWEIS: Alle Schritte zur Zellmanipulation in diesem Abschnitt sollten in einer Biosicherheitswerkbank mit sterilen Praktiken durchgeführt werden. Dieser Abschnitt ist für adhärente Zelltypen geschrieben. Suspensionszellen können mit geeigneten Modifikationen wie angegeben verwendet werden.

  1. Züchten Sie Krebszelllinien gemäß dem Standardprotokoll des Lieferanten oder des Labors, das die spezifische(n) Zelllinie(n) zur Verfügung gestellt hat.
    HINWEIS: Zellen mit niedriger Passage (p < 10) werden im Allgemeinen bevorzugt, da es in unbehandelten Zellproben zu einem geringeren Grad an replikativer Seneszenz, d.h. niedrigerem Hintergrund, kommt.
  2. Einen Tag vor der Seneszenzinduktion durch Medikamente entpacken Sie Zellen mit Trypsin-EDTA 0,25% (oder wie empfohlen). Trypsin wird durch Zugabe eines gleichen Volumens des vollständigen Kulturmediums neutralisiert und die Zellsuspension in ein steriles konisches Röhrchen überführt.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist für Suspensionszellen nicht erforderlich.
  3. Zählen Sie die Zellen mit der Standard-Hämazytometermethode und erfassen Sie Zellen / ml. Plattenzellen bei 1 × 10 3-10 × 103 Zellen/cm2 in Standard-6-Well-Kunststoffkulturschalen.
    HINWEIS: Die optimale Beschichtungsdichte hängt von der Proliferationsrate der Zellen ab und sollte vom Benutzer bestimmt werden. Die Zellen sollten sich zum Zeitpunkt der Behandlung (d.h. nach 18-24 h Inkubation nach der Beschichtung) in einem logarithmischen Phasenwachstum bei etwa 10%-20% Konfluenz befinden. Die Ausgangsdichte (Zellen/ml) von Suspensionszellen sollte vom Benutzer bestimmt werden. Sechs-Well-Platten liefern typischerweise genügend seneszente Zellen pro Vertiefung für eine Standard-Durchflusszytometrie-Analyseprobe. Bei der Durchflusssortierung sollte eine viel größere Oberfläche (z. B. mehrere P150-Platten) verwendet werden, um die Gewinnung einer ausreichenden Anzahl von seneszenten Zellen für nachgeschaltete Assays zu ermöglichen (≥1 × 106).
  4. Inkubieren Sie die plattierten Zellen über Nacht (18-24 h) in einem 37 °C Inkubator mit 5% CO2 und einer Feuchtepfanne.
  5. Behandeln Sie die plattierten Zellen mit Seneszenz-induzierenden Chemotherapeutika. Fügen Sie mindestens eine Positivkontrolle hinzu, z. B. Etoposid (ETO) oder Bleomycin (BLM). Bereiten Sie doppelte Brunnen pro Medikament vor. Fügen Sie einen Satz bei, der nur mit Fahrzeugsteuerung behandelt wird.
    HINWEIS: Eine Dosiskurve für jedes experimentelle Mittel sollte vom Anwender getestet werden, um die optimale Konzentration für die Seneszenzinduktion in der (den) verwendeten Zelllinie(n) zu bestimmen.
  6. Inkubieren Sie die Zellen für 4 Tage in einem 37 °C Inkubator mit 5% CO2 und einer Feuchtigkeitspfanne, um den Beginn der Seneszenz zu ermöglichen. Untersuchen Sie täglich mit einem Lichtmikroskop auf erwartete Veränderungen der Morphologie.
    HINWEIS: Inkubationszeiten von 3-5 Tagen können abhängig von der Rate des Seneszenzbeginns akzeptabel sein. Medien können gewechselt und das Mittel nach Wunsch erneut aufgetragen werden (oder nicht), um gesunde Wachstumsbedingungen zu fördern und gleichzeitig einen akzeptablen Prozentsatz an alternden Zellen zu erreichen.
  7. Nach Beginn der Seneszenz ernten Sie die Zellen durch Zugabe von Trypsin-EDTA 0,25% für 5 min bei 37 °C. Wenn Zellen in Suspension dissoziiert werden, neutralisieren Sie Trypsin mit einem gleichen Volumen des vollständigen Mediums.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist nicht erforderlich, wenn Zellen in Suspension wachsen. Wenn eine Oberflächenmarkerfärbung durchgeführt wird, vermeiden Sie die Verwendung von Trypsin-EDTA, da es Oberflächenantigene auf Zellen vorübergehend zerstören kann. Dissoziieren Sie die Monoschicht stattdessen vorsichtig mit einem sterilen Kunststoffzellschaber (oder einem alternativen Dissoziationsreagenz zur Erhaltung von Oberflächenantigenen).
  8. Zählen Sie die Zellen in jeder Probe mit einem Hämazytometer. Berechnen Sie die Zellen/ml für jede Probe.
    HINWEIS: Trypanblau kann hinzugefügt werden, um den Prozentsatz toter Zellen an dieser Stelle zu bewerten (dh aufgrund einer medikamentösen Behandlung), aber der Zelltod wird auch mit einem fluoreszierenden Lebensfähigkeitsfarbstoff während des DDAOG-Färbe-Workflows bestimmt.
  9. Aliquot ≥0,5 × 106 Zellen pro Probe in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Die Anzahl der Zellen pro Probe sollte über alle Proben standardisiert werden.
  10. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 min bei 1.000 × g in einer Mikrozentrifuge bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand.
    HINWEIS: Wenn keine gekühlte Mikrozentrifuge verfügbar ist, kann es akzeptabel sein, Zentrifugationen bei Umgebungstemperatur für bestimmte elastische Zelltypen durchzuführen.
  11. Fahren Sie mit DDAOG-Färbung in Abschnitt 4 fort.

3. Induktion der Seneszenz durch Chemotherapeutika in Tumoren, die bei Mäusen etabliert wurden

HINWEIS: Wenn Tumorzellen FACS-sortiert werden, stellen Sie die Sterilität bei jedem Schritt sicher, indem Sie in einer Biosicherheitswerkbank arbeiten und mit sterilen Instrumenten, Verfahren und Reagenzien arbeiten.

  1. Erstellen Sie Maustumormodelle durch subkutane Injektion von Krebszellen nach Standardmethoden (z. B. Appelbe et al.19).
    HINWEIS: Die Anzahl der zu injizierenden Krebszellen, die Injektionsstelle und der entsprechende Mausstamm sollten für jedes Protokoll optimiert werden. Hier wurden B16-F10-Zellen subkutan bei 1 × 106 Zellen in 0,1 ml Kochsalzlösung (1 × 107 Zellen/ml) injiziert.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Lebensfähigkeit von Zellen, die Trypanblau verwenden, >90% beträgt, bevor Sie Injektionen durchführen. Betäuben Sie die Mäuse mit Isofluran.
    2. Betäuben Sie 6-7 Wochen alte weibliche C57/BL6-Mäuse mit einer Mischung aus 3% Isofluran und Luft und halten Sie sie unter diesen Bedingungen in einer Induktionskammer in einer sterilen Biosicherheitswerkbank. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie den Fuß der Maus sanft kneifen. Tragen Sie sterile Veterinärsalbe auf beide Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut während des Eingriffs zu verhindern. Halten Sie während des Eingriffs die Körpertemperatur der Maus mit einer Heizlampe aufrecht.
    3. Entfernen Sie die Maus in einer sterilen Biosicherheitswerkbank aus der Induktionskammer und bringen Sie sie in Kontakt mit einem Nasenkegel, der eine Isofluranversorgung von 3% bietet. Rasieren Sie den Flankenbereich an der Injektionsstelle mit einem sauberen Elektrorasierer. Mischen Sie die vorbereitete Zellsuspension kurz, indem Sie das Röhrchen kurz vor der Injektion manuell umdrehen, und injizieren Sie die Zellsuspension subkutan in die rasierte Flanke(n) mit einer sterilen 0,5-ml-Spritze, die mit einer sterilen 27-G-Nadel ausgestattet ist. Nehmen Sie die Maus aus der Haube und bringen Sie sie in den Auffangkäfig.
    4. Überwachen Sie im Erholungskäfig kontinuierlich die Vitalfunktionen der Mäuse, bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt haben, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten, den aufrichtenden Reflex demonstrieren und sich sicher im Käfig bewegen können. Lassen Sie Mäuse nicht unbeaufsichtigt und geben Sie Tiere, die einer Tumorzellimpfung unterzogen wurden, nicht in Begleitung anderer Tiere zurück, bis sie vollständig genesen sind. Überwachen Sie alle geimpften Mäuse täglich auf Gewichtsverlust, verminderte Aktivität / Mobilität und neurologische Symptome; Euthanasieren Sie Mäuse, die schwere Symptome in jeder Kategorie zeigen. Bei Mäusen, die nach der Impfung Schmerzsymptome zeigen, einmal subkutan Buprenorphin (0,1-0,2 mg/kg) verabreichen.
      HINWEIS: Mäuse, die nach Buprenorphin anhaltende Schmerzen zeigen, sollten eingeschläfert werden.
  2. Beginnen Sie 5-7 Tage nach der Krebszellimpfung, messen Sie das Tumorwachstum mit Messschiebern alle 2-3 Tage. Beginnen Sie mit der Proseneszenzbehandlung, wenn der Tumor ein Volumen von 50 mm 3 ± 10 mm3 erreicht hat.
    HINWEIS: In dieser Arbeit wurden Dosen von Doxorubicinhydrochlorid (DOX) oder PEGyliertem liposomalem Doxorubicin (PLD) in 10 mg/kg in 0,9% Natriumchlorid-Injektion (USP) verabreicht. Medikamente wurden intraperitoneal 3x, einmal alle 5 Tage, injiziert, beginnend mit Tumoren erreichten 50 mm 3 ± 10 mm3. Mäuse erholten sich für 7 Tage nach der letzten Behandlung, um das Auftreten von TIS in Tumoren zu ermöglichen. Seneszenzinduktionsdosierungen und -bedingungen für andere Behandlungen und/oder Tumormodelle sollten optimiert werden.
  3. 7 Tage nach der abschließenden medikamentösen Behandlung opfern Sie die Mäuse durch CO2 -Überdosierung und Zervixluxation oder andere zugelassene Methoden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Arbeit von Labortieren. Entfernen Sie die Tumore und sammeln Sie sie in sterilen Röhrchen oder 6-Well-Platten, die mit sterilem RPMI-Wachstumsmedium gefüllt sind (um die Lebensfähigkeit während der Verarbeitung zu erhalten).
    HINWEIS: Bei einer histologischen Untersuchung (z. B. X-Gal oder Immunhistochemie) können Tumore hier halbiert werden, wobei eine Hälfte in O.C.T.-Einbettungsmedium eingefroren und mit Standardverfahren für die Frozen Tissue Histology kryosektioniert wird. Die verbleibende Tumorhälfte sollte reichlich Material für Dissoziation und DDAOG-Färbung liefern.
  4. Übertragen Sie einen Tumor in eine P100-Plastikschale, die 5 ml RPMI-Medium enthält. Zerkleinern Sie den Tumor mit einem Skalpell.
  5. 5 ml der Suspension von Tumorstücken, die suspendierte Zellen und Trümmer enthalten, in ein 15 ml konisches Röhrchen überführen. Verwenden Sie die breitere Spitze einer 25-ml-serologischen Pipette zum Übertragen dieser Suspension, wenn große Ablagerungen vorhanden sind. Spülen Sie die Schale mit einem zusätzlichen Volumen sterilen RPMI ab, um Materialien zu sammeln. Verschließen und das konische Rohr auf Eis legen.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 3.45-3.5 für die verbleibenden Tumoren. Verwenden Sie eine separate Platte und ein Skalpell für jeden Tumor, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, oder spülen Sie gut mit PBS zwischen den Tumoren. Verwenden Sie 5 ml frisches Medium, um jeden Tumor zu zerkleinern.
  7. Bereiten Sie die Tumordissoziationslösung vor: 20 μg/ml Liberase TL + 100 μg/ml DNAse I in RPMI-1640-Medien (ohne FBS).
    HINWEIS: Es gibt viele wirksame Formulierungen für Tumordissoziationslösungen, die eine Vielzahl von Enzymen und anderen Komponenten verschiedener Hersteller enthalten können. Optimale Konzentrationen von Komponenten können je nach Tumorart stark variieren. Wenn rote Blutkörperchen im Tumor stark vorhanden sind, kann zusätzlich eine Erythrozytenlyse durchgeführt werden; Wenn tote Zellen ein Problem darstellen, kann ein Kit zum Entfernen toter Zellen verwendet werden. Es wird dem Benutzer dringend empfohlen, unabhängig optimale Tumordissoziationsbedingungen zu bestimmen, die eine hohe Lebensfähigkeit und geringe Präsenz von kontaminierenden Zellen, Bindematerial und Trümmern bieten.
  8. Zentrifugieren Sie alle Tumorproben in konischen Röhrchen für 5 min bei 1.000 × g (4 °C). Entfernen Sie den Überstand.
  9. Fügen Sie jeder Tumorprobe 1-5 ml Tumordissoziationslösung hinzu, abhängig vom Volumen des Tumormaterials. Stellen Sie sicher, dass sich 1-2 ml mehr als das Tumormaterialpellet in der Röhre befinden. Wirbeln Sie mit mäßiger Geschwindigkeit zum Mischen.
  10. Legen Sie die Proben in einen 37 °C Inkubator mit schneller Rotation für 45 min. Wirbel kurz alle 15 min.
  11. Filtern Sie jede Probe durch ein 100-μm-Zellsieb in ein 50-ml-konisches Röhrchen. Wenn die Proben zu viskos sind, um den Filter zu passieren, fügen Sie 10 ml RPMI-1640-Medium hinzu, um sie zu verdünnen. Spülen Sie die Filter mit RPMI-Medium ab, um die Restzellen zu sammeln.
  12. Verwenden Sie ein Hämazytometer, um die Zellen / ml für jede Probe zu zählen.
  13. Aliquot zwei oder mehr Replikate von 5 × 106 Zellen pro Tumorprobe.
  14. 5 min bei 1.000 × g (4 °C) zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand.
  15. (Optional) Kryokonservierung der Tumorproben für eine spätere DDAOG-Färbung, falls gewünscht.
    1. Resuspendieren Sie das dissoziierte Tumorzellpellet in Kryokonservierungsmedium: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, hergestellt unter sterilen Bedingungen bei 5 × 106 Zellen/ml.
    2. Aliquot 1 ml Zellsuspension in jedes Kryovial.
    3. Die Kryoviale werden 24 h lang in einem Gefrierbehälter für Isopropanolzellen bei −80 °C eingefroren. Dann zur längerfristigen Lagerung (>1 Woche) in die Kryolagerung mit flüssigem Stickstoff überführen.
    4. Wenn eine Färbung gewünscht wird, tauen Sie die Kryoviale auf Eis auf und fahren Sie mit der DDAOG-Färbung in Abschnitt 4 fort.
      HINWEIS: Einige Tumoren bleiben durch Kryokonservierung möglicherweise nicht lebensfähig, und die Widerstandsfähigkeit gegenüber diesem Prozess sollte vom Benutzer für das interessierende Tumormodell bewertet werden.
  16. Fahren Sie mit Abschnitt 4 für die DDAOG-Färbung fort.

4. DDAOG-Färbung von SA-β-Gal in Zell- oder Tumorproben

  1. 1 mM Bafilomycin A1-Schaft bei 1:1.000x in DMEM-Medium (ohne FBS) für eine Endkonzentration von 1 μM verdünnen.
  2. Vorbereitete Baf-DMEM-Lösung zu den Zellpelletproben (aus Schritt 2.11 oder Schritt 3.16) für eine Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml geben.
    HINWEIS: Wenn Sie beispielsweise 0,5 × 106 Zellen pro Probe verwenden, fügen Sie 0,5 ml Baf-DMEM hinzu. Bei Tumoren können 5 × 106 Zellen in 5 ml Baf-DMEM gefärbt werden.
  3. Inkubieren Sie 30 min bei 37 °C (ohne CO2) auf einem Rotator/Shaker mit langsamer Geschwindigkeit.
    HINWEIS: Vermeiden Sie CO2-Inkubatoren für den Färbeprozess, die Lösungen ansäuern und dadurch die Baf- und DDAOG-Färbung stören können.
  4. Geben Sie ohne Waschen die DDAOG-Stammlösung (5 mg/ml) 1:500x (10 μg/ml endgültig) zu jeder Probe. Pipette zum Mischen. Rotator/Shaker bei 37 °C (ohne CO2) 60 min ersetzen. Vor direktem Licht schützen.
  5. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 min bei 1.000 x g bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand.
  6. Mit 1 ml eiskaltem 0,5% BSA pro Röhrchen und Pipette zum Mischen waschen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 min bei 1.000 x g bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x, um die Zellen gründlich zu waschen. Entfernen Sie den Überstand und fahren Sie fort.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Waschschritte in Schritt 4.6 durchzuführen, um ungespaltenes DDAOG zu entfernen, das eine unerwünschte Fluoreszenzemission (460/610 nm) aufweisen kann.
    HINWEIS: Wenn Sie eine Immunfärbung für Zelloberflächenmarker durchführen, fahren Sie mit Abschnitt 5 unten fort.
  7. (Optional) Fixierung und Lagerung von DDAOG gefärbten Zellen zur späteren Analyse
    1. 0,5 ml eiskaltes 4% Paraformaldehyd tropfenweise zu jeder gewaschenen Probe geben. Pipette zum Mischen.
    2. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Waschen Sie die Zellen 2x mit 1 ml PBS.
    4. Lagern Sie die Proben vor der Durchflusszytometrie-Analyse bis zu 1 Woche bei 4 °C.
      HINWEIS: Überspringen Sie bei korrigierten Stichproben Schritt 4.8.
  8. Verdünnen Sie Calcein Violet 450 AM Stock (1 mM) bei 1:1.000x in 1% BSA-PBS (1 μM final). Geben Sie 300 μL (für kultivierte Zellproben) oder 1.000 μL (für Tumorproben) zu den gewaschenen Zellpellets aus Schritt 4.6. 15 min auf Eis im Dunkeln ausbrüten.
  9. Fahren Sie mit der Einrichtung der Durchflusszytometrie fort (Abschnitt 6).

5. (Optional) Immunfärbung für Zelloberflächenmarker in Kombination mit DDAOG

HINWEIS: Wie bei jedem Durchflusszytometrie-Experiment sollten einfach gefärbte Kontrollproben nur mit DDAOG und nur fluoreszierenden Antikörpern vorbereitet werden, um Übersprechen (falls vorhanden) über Fluoreszenzkanäle zu bestimmen. Wenn ein Übersprechen beobachtet wird, sollte eine Standard-Durchflusszytometrie-Kompensation durchgeführt werden20.

  1. Resuspendieren Sie die in Schritt 4.6 erhaltenen Zellpellets in 100 μL Färbepuffer (1% BSA in 1x PBS).
  2. Fügen Sie das für die Zellspezies (Maus oder Mensch) geeignete Fc-Rezeptor-blockierende Reagenz bei der vom Hersteller empfohlenen Titration hinzu. 10 min bei 24 °C inkubieren.
  3. Fügen Sie fluorophorkonjugierte Antikörper bei der vom Hersteller empfohlenen (oder vom Benutzer bestimmten) Titration hinzu. 20 min auf Eis, vor Licht geschützt, inkubieren.
  4. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 min bei 1.000 × g bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand.
  5. Mit 1 mL eiskaltem Waschpuffer (0,5% BSA-PBS) pro Röhrchen und Pipette zum Mischen waschen. Die Röhrchen 5 min bei 1.000 × g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x, um die Zellen gründlich zu waschen.
  6. 1 mM Calcein Violet 450 AM bei 1:1.000x zu 1% BSA-PBS verdünnen. Geben Sie 300 μL zu den gewaschenen Zellpellets aus Schritt 5.5. 15 min auf Eis im Dunkeln ausbrüten.
  7. Fahren Sie mit der Durchflusszytometrie-Analyse fort (Abschnitte 6-7).

6. Einrichtung und Datenerfassung des Durchflusszytometers

  1. Die Zellproben werden in Röhrchen überführt, die mit dem Durchflusszytometriegerät kompatibel sind. Stellen Sie die Schläuche auf Eis und schützen Sie sie vor Licht.
    HINWEIS: Wenn Aggregate in den Zellsuspensionen beobachtet werden, passieren Sie die Suspension vor der Analyse durch 70-100 μm Zellsiebe. Verwenden Sie keine 40-μm-Siebe, da diese einige der größeren alternden Zellen ausschließen können.
  2. Öffnen Sie in der referenzierten Software (siehe Materialtabelle) die folgenden Diagramme: 1) FSC-A vs SSC-A Punktdiagramm, 2) Violettkanalhistogramm, 3) Fernrotkanal (z. B. APC-A) versus Grünkanal (z. B. FITC-A) Punktdiagramm.
    HINWEIS: Doublet-Ausschlussdiagramme und Einkanalhistogramme können ebenfalls verwendet werden, sind aber nicht unbedingt erforderlich.
  3. Initiieren Sie die Zytometer-Datenerfassung.
    1. Legen Sie die mit DDAOG angefärbte Fahrzeugkontrollprobe auf die Ansaugöffnung. Beginnen Sie bei einer niedrigen Aufnahmegeschwindigkeit mit der Erfassung von Probendaten.
    2. Passen Sie die FSC- und SSC-Spannungen so an, dass >90 % der Ereignisse im Diagramm enthalten sind. Wenn Zellen nicht gut in das Diagramm passen, verringern Sie die Einstellung für die Flächenskalierung auf 0,33-0,5 Einheiten.
    3. Entfernen Sie die reine Fahrzeugprobe, ohne Daten aufzuzeichnen.
    4. (Optional) Fügen Sie einen Tropfen Regenbogenkalibrierungsmikrosphären in ein Zytometerröhrchen mit 1 ml PBS hinzu. Setzen Sie das Röhrchen auf die Zytometer-Ansaugöffnung. Beginnen Sie mit der Erfassung von Beispieldaten.
    5. Stellen Sie die violetten, grünen und tiefroten Kanalspannungen so ein, dass der oberste Peak der Regenbogenmikrosphäre im Bereich von 104-10 5 Einheiten relativer Fluoreszenz in jedem Kanal liegt und alle Peaks in jedem Kanal gut getrennt sind. Rekord von 10.000 Ereignissen. Entfernen Sie den Schlauch.
  4. Legen Sie die mit DDAOG angefärbte Positivkontrollprobe (z. B. BLM, ETO) auf die Ansaugöffnung. Erfassen Sie bei niedriger Geschwindigkeit Beispieldaten. Beobachten Sie die Ereignisse in FSC-, SSC-, violetten, grünen und tiefroten Kanälen, um sicherzustellen, dass über 90% der Ereignisse in allen Diagrammen enthalten sind. Achten Sie auf eine Erhöhung des AF- und DDAOG-Signals im Vergleich zur reinen Fahrzeugsteuerung.
  5. Wenn Sie ein Sortierzytometer verwenden, starten Sie die Sortierung in diesem Schritt.
    1. Zeichnen Sie zu Aufzeichnungszwecken 10.000 Zellen für die Kontrollprobe und jede sortierte Probe auf.
    2. Sortieren Sie die gewünschte Menge an Zellen (≥1 × 106 ist typischerweise geeignet) in ein gerätegeeignetes Sammelröhrchen mit 3-5 ml Kulturmedium.
    3. Fahren Sie nach dem Sortieren mit der nachgelagerten Kultur oder Analyse fort.
    4. Fahren Sie mit Abschnitt 7 für die Routineanalyse sortierter Proben fort.
  6. Wenn Sie fluoreszierende Antikörper verwenden, optimieren Sie hier die Kanalspannungen mit den in Abschnitt 5 vorbereiteten ungefärbten, einfach gefärbten und doppelt gefärbten Proben.
    HINWEIS: Für das hier verwendete kalibrierte Durchflusszytometer lagen die optimalen Kanalspannungen typischerweise zwischen 250 und 600 (mittlerer Bereich), aber die optimalen Spannungen und Kanalspannungsbereiche variieren je nach Gerät. Vermeiden Sie die Verwendung von Spannungen in sehr niedrigen oder hohen Bereichen, die Signale unterdrücken oder Rauschen verstärken können.
  7. Nachdem Sie die Schritte 6.1-6.5 abgeschlossen und die Zytometereinstellungen bei Bedarf angepasst haben, zeichnen Sie die Daten für alle Proben auf. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen für alle Probenaufnahmen einheitlich bleiben. Aufzeichnung von ≥10.000 Ereignissen pro kultivierter Zellprobe oder ≥100.000 Ereignissen pro Tumorzellprobe.
    HINWEIS: Obwohl Gating und Analyse mit Datenerfassungssoftware (z. B. FACSDiva) durchgeführt werden können, wird in Abschnitt 7 unten ein vollständiger Gating- und Analyse-Workflow beschrieben, der nach der Erfassung mit separater Analysesoftware (FlowJo) durchgeführt wird. Die Analyse nach der Erfassung wird bevorzugt, um die Zeit am Zytometer-Arbeitsplatz zu reduzieren und zusätzliche Tools zu nutzen, die in der dedizierten Analysesoftware enthalten sind.
  8. Speichern Sie Beispieldaten im FCS-Dateiformat. Exportieren Sie die Dateien auf einen Arbeitsplatzrechner, der mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware (z. B. FlowJo) ausgestattet ist. Fahren Sie mit Abschnitt 7 fort.

7. Datenanalyse der Durchflusszytometrie

HINWEIS: Der vorgestellte Workflow verwendet die FlowJo-Software. Alternative Durchflusszytometrie-Datenanalysesoftware kann verwendet werden, wenn die in diesem Abschnitt beschriebenen Schlüsselschritte in ähnlicher Weise befolgt werden.

  1. Öffnen Sie mit der FlowJo-Software .fcs-Datendateien aus Schritt 6.7.
  2. Öffnen Sie das Layoutfenster.
  3. Ziehen Sie alle Beispiele per Drag & Drop in das Layoutfenster.
  4. Gate lebensfähige Zellen.
    1. Doppelklicken Sie zunächst auf die Beispieldaten für das reine Fahrzeugsteuerelement, um dessen Datenfenster zu öffnen.
    2. Visualisieren Sie die Daten als Violettkanalhistogramm. Identifizieren Sie die lebensfähigen Zellen, die mit CV450 gefärbt wurden, basierend auf ihrer helleren Fluoreszenz als die toten Zellen.
    3. Zeichnen Sie ein Tor mit dem Einzelgatter-Histogramm-Werkzeug, um nur lebensfähige Zellen einzubeziehen. Nennen Sie das Tor lebensfähig.
    4. Ziehen Sie dann aus dem Probenlayoutfenster das funktionsfähige Gate auf die anderen Zellproben, um das Gate gleichmäßig anzuwenden.
    5. Visualisieren Sie im Layoutfenster alle Proben als Violettkanalhistogramme (Lebensfähigkeit). Stellen Sie sicher, dass lebensfähiges Zellgating für alle Proben geeignet ist, bevor Sie fortfahren. Wenn nicht, nehmen Sie bei Bedarf Anpassungen vor.
      HINWEIS: Die Viabilitätsfärbung kann Unterschiede zwischen Behandlungen oder Tumoren aufweisen.
  5. Gate alternde Zellen.
    1. Doppelklicken Sie auf die Gated Viable Cell-Daten für die reine Fahrzeugsteuerung, um ihr Datenfenster zu öffnen.
    2. Visualisieren Sie die Daten als Punktdiagramm für den Fernroten Kanal (DDAOG) im Vergleich zum Grünkanal (AF).
    3. Zeichnen Sie ein Tor mit dem Rechteck-Gating-Tool, um <

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Ergebnisse

Mehrere Experimente wurden durchgeführt, um die Vergleichbarkeit von DDAOG mit X-Gal und C12-FDG für den Nachweis der Seneszenz durch SA-β-Gal zu demonstrieren. Zunächst wurde X-Gal verwendet, um seneszente B16-F10-Melanomzellen zu färben, die durch ETO induziert wurden (Abbildung 2A). Eine intensive blaue Farbe entwickelte sich in einer Untergruppe von ETO-behandelten Zellen, während andere Zellen eine weniger intensive blaue Färbung aufwiesen. Die Morphologie war in den meisten ...

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Diskussion

In den letzten zehn Jahren hat sich die Durchflusszytometrie aufgrund der zunehmenden Popularität der Tumorimmunologie, der Entwicklung kostengünstigerer Durchflusszytometer und der Verbesserung gemeinsamer Instrumentierungseinrichtungen an akademischen Einrichtungen zu einer immer häufigeren Assay-Plattform in der Krebsforschung entwickelt. Multicolor-Assays sind jetzt Standard, da die meisten neueren Instrumente mit violetten, blau-grünen und roten bis fernroten optischen Arrays ausgestattet sind. Daher ist dieses DDAO...

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Offenlegungen

Die Autoren haben für diese Studie keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Wir danken der Cytometry and Antibody Core Facility der University of Chicago für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Das Animal Research Center an der University of Chicago stellte Tierunterkünfte zur Verfügung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bafilomycin A1Research Products InternationalB40500
BleomycinsulfatCayman13877
Rinderserumalbumin (BSA)US BiologicalA1380
Calcein Violet 450 AM ViabilitätsfarbstoffThermoFisher Scientific65-0854-39eBioscience
DPP4 Antikörper, PE-KonjugatBiolegend137803Klon H194-112
Zelllinie: A549 menschliches LungenadenokarzinomAmerican Type Culture CollectionCCL-185
Zelllinie: B16-F10 MausmelanomAmerican Type Culture CollectionCRL-6475
ZellschaberCorning3008
Zellsiebe, 100 & Mikro; mFalcon352360
DDAO-GalactosidLife TechnologiesD6488
DMEM Medium 1xLife Technologies11960-069
DMSOSigmaD2438
DNAse ISigmaDN25
Doxorubicin, Hydrochlorid-Injektion (USP)PfizerNDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGyliertes liposomales (USP)Sun PharmaceuticalNDC 47335-049-40
EDTA 0,5 MLife Technologies15575-038
Etoposid Cayman12092
FBSOmega FB-11
Fc-Rezeptor-BlockierungsreagenzBiolegend101320Anti-Maus CD16/32
Durchflusszytometer (Zellanalysator)Becton Dickinson (BD)VerschiedenesLSRFortessa
Durchflusszytometer (Zellsortierer)Becton Dickinson (BD)VerschiedenesFACSAria
GlutaMax 100xLife Technologies35050061
HEPES 1 MLonzaBW17737
Liberase TLSigma5401020001Roche
Paraformaldehyd 16%ElektronenmikroskopieSciences 15710
Penicillin/Streptomycin 100xLife Technologies15140122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1xCorningMT21031CVDulbecco's PBS (ohne Calcium und Magnesium)
Regenbogen-Kalibrierpartikel, Ultra-KitSpheroTechUCRP-38-2K3.5-3.9 µ m, 2E6/mL
RPMI-1640 mittel 1xLife Technologies11875-119
Natriumchlorid 0,9% (USP)Baxter Healthcare Corporation2B1324
Software zur Erfassung von Zytometerdaten, "FACSDiva"Becton Dickinson (BD)n/aKontaktieren Sie BD für Lizenz
Software zur Analyse von Zytometerdaten, "FlowJo"TreeStarn/aKontaktieren Sie TreeStar für die Lizenz
Trypsin-EDTA 0.25%Life Technologies25200-114
:

Referenzen

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