Methodenartikel

Untersuchung der Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 mittels Western Blotting

DOI:

10.3791/64179

⸱

9. Dezember 2022

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das vorliegende Protokoll hebt die Anwendung der Western-Blotting-Technik hervor, um die Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt die Untersuchung der KCC2-Phosphorylierung an Kinase-regulatorischen Stellen Thr906/1007 mittels Western Blotting. Außerdem werden zusätzliche Methoden zur Bestätigung der KCC2-Aktivität in diesem Text kurz hervorgehoben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaliumchlorid-Cotransporter 2 (KCC2) sind ein Mitglied der gelösten Trägerfamilie 12 (SLC12) von Kation-Chlorid-Cotransportern (CCCs), die ausschließlich im Neuron vorkommen und für das reibungslose Funktionieren der Cl-Homöostase und folglich für die funktionelle GABAerge Hemmung unerlässlich sind. Das Versagen bei der richtigen Regulierung von KCC2 ist schädlich und wurde mit der Prävalenz mehrerer neurologischer Erkrankungen, einschließlich Epilepsie, in Verbindung gebracht. Es wurden beträchtliche Fortschritte beim Verständnis der Mechanismen erzielt, die an der Regulierung von KCC2 beteiligt sind, die für die Entwicklung von Techniken verantwortlich sind, die es Forschern ermöglichen, seine Funktionen und Aktivitäten zu untersuchen; entweder durch direkte (Beurteilung der Phosphorylierung von Kinase-regulatorischen Stellen) oder indirekte (Beobachtung und Überwachung der GABA-Aktivität) Untersuchungen. Hier zeigt das Protokoll, wie die KCC2-Phosphorylierung an Kinase-regulatorischen Stellen - Thr906 und Thr1007 - mit der Western-Blotting-Technik untersucht werden kann. Es gibt andere klassische Methoden, die verwendet werden, um die KCC2-Aktivität direkt zu messen, wie Rubidium-Ionen- und Thallium-Ionen-Aufnahme-Assay. Weitere Techniken wie Patch-Clamp-Elektrophysiologie werden zur Messung der GABA-Aktivität eingesetzt; Daher indirekt reflektiert aktiviertes und/oder inaktiviertes KCC2, wie durch die Beurteilung der intrazellulären Chloridionenhomöostase informiert. Einige dieser zusätzlichen Techniken werden in diesem Manuskript kurz diskutiert.

Einleitung

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Kaliumchlorid-Cotransporter 2 (KCC2) ist ein Mitglied der gelösten Trägerfamilie 12 (SLC12) von Kation-Chlorid-Cotransportern (CCCs), die ausschließlich im Neuron vorkommen und für das reibungslose Funktionieren der Cl-Homöostase und folglich für die funktionelle GABAerge Hemmung 1,2,3,4 unerlässlich sind. Die Aufrechterhaltung einer niedrigen intraneuronalen Cl-Konzentration ([Cl-]i) bei 4-6 mM durch KCC2 erleichtert die Hyperpolarisation von γ-Aminobuttersäure (GABA)/Glycin und die synaptische Hemmung im Gehirn und Rückenmark 5. Das Versagen bei der richtigen Regulation von KCC2 wurde mit der Prävalenz mehrerer neurologischer Erkrankungen, einschließlich Epilepsie4, in Verbindung gebracht. Darüber hinaus wurden verminderte KCC2-vermittelte Cl−-Extrusion und gestörte hyperpolarisierendeGABA-A- und/oder Glycinrezeptor-vermittelte Ströme mit Epilepsie, neuropathischen Schmerzen und Spastik in Verbindung gebracht 6,7. Neuronales KCC2 wird durch Phosphorylierung wichtiger regulatorischer Reste innerhalb seiner C-terminalen intrazellulären Domäne durch den mit No-Lysin (WNK)-STE20/SPS1-verwandten Prolin/Alanin-reichen (SPAK)/Oxidative Stress-responsive (OSR) Kinase-Signalkomplex1 negativ moduliert, was die Aufrechterhaltung der depolarisierten GABA-Aktivität in unreifen Neuronen erleichtert 2,8,9 . Der WNK-SPAK/OSR1 phosphoryliert die Threoninreste 906 und 1007 (Thr906/Thr1007) und reguliert anschließend die mRNA-Genexpression von KCC2 herunter, was zu einer Verschlechterung seiner physiologischen Funktion führt 8,10. Noch wichtiger ist jedoch, dass es bereits eine Tatsache ist, dass der WNK-SPAK/OSR1-Kinase-Komplex dafür bekannt ist, die KCC2-Expression 1,2,4,11,12 zu phosphorylieren und zu hemmen, und dass die Hemmung der Kinase-Komplex-Signalwege zum Phosphorylat Thr906/Thr1007 mit der erhöhten Expression des KCC2-mRNA-Gens in Verbindung gebracht wurde13,14,15 . Es ist wichtig zu beachten, dass die Regulation der neuronalen KCC2- und Na+-K+-2Cl-Cotransporter 1 (NKCC1) Expression über Proteinphosphorylierung gleichzeitig und in umgekehrten Mustern 1,4,16 funktioniert.

Es wurden beständige und beträchtliche Fortschritte beim Verständnis der Mechanismen erzielt, die an der Regulierung von KCC2 beteiligt sind, die der Entwicklung von Techniken zugeschrieben wurden, die es Forschern ermöglichen, seine Funktionen und Aktivitäten zu untersuchen; entweder durch direkte (Beurteilung der Phosphorylierung von Kinase-regulatorischen Stellen) oder indirekte (Beobachtung und Überwachung der GABA-Aktivität) Untersuchungen. Das hier vorgestellte Protokoll hebt die Anwendung von Western-Blotting-Techniken hervor, um die Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K+-Cl-Co-Transporters KCC2 zu untersuchen, indem die Phosphorylierung des Cotransporters an Kinase-regulatorischen Stellen Thr906/1007 untersucht wird.

Western Blot ist eine Methode, um bestimmte Proteine von Interesse aus einer Gewebe- oder Zellprobe nachzuweisen. Diese Methode trennt die Proteine zunächst durch Elektrophorese nach Größe. Die Proteine werden dann elektrophoretisch auf einen festen Träger (meist eine Membran) übertragen, bevor das Zielprotein mit einem spezifischen Antikörper markiert wird. Die Antikörper werden an verschiedene Tags oder fluorophorkonjugierte Antikörper konjugiert, die entweder kolorimetrische, Chemilumineszenz- oder Fluoreszenzmethoden nachgewiesen werden. Dadurch kann ein spezifisches Zielprotein aus einer Mischung von Proteinen nachgewiesen werden. Diese Technik wurde verwendet, um phosphospezifische Stellen von KCCs1 zu charakterisieren und Kinase-Inhibitoren zu identifizieren, die die KCC3 Thr991/Thr1048-Phosphorylierunghemmen 17. Durch die Befolgung dieses Protokolls kann man spezifisch Gesamt- und phosphoryliertes KCC2 aus Zell- / Gewebelysaten nachweisen. Prinzipiell ist der Nachweis von proteinkonjugierten Antikörpern durch diese Technik sehr hilfreich, da er dazu beiträgt, das Verständnis kooperativer Aktivitäten an den Phospho-Stellen von KCC2 zu verbessern, was Aufschluss über die molekularen Mechanismen gibt, die an ihrer physiologischen Regulation beteiligt sind. Die quantitative Analyse der Gesamtproteinexpression ist repräsentativ für die Funktion und Aktivität von KCC2. Es gibt andere klassische Methoden zur direkten Messung der KCC2-Aktivität, wie Rubidiumionen- und Thalliumionenaufnahme-Assay. Weitere Techniken wie Patch-Clamp-Elektrophysiologie werden zur Messung der GABA-Aktivität eingesetzt; Daher indirekt reflektiert aktiviertes und/oder inaktiviertes KCC2, wie durch die Beurteilung der intrazellulären Chloridionenhomöostase informiert.

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Protokoll

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HINWEIS: Das Protokoll beschreibt die Western-Blotting-Methode, um bestimmte Proteine von Interesse zu erkennen.

1. Zellkultur und Transfektion

  1. Erwärmen Sie alle Reagenzien vor dem Zellkulturvorgang im Kugelbad (37 °C). Bereiten Sie das Kulturmedium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) vor, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, jeweils 1% 2mM L-Glutamin, 100x nicht-essentieller Aminosäure, 100 mM Natriumpyruvat und 100 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin.
  2. Ratte KCC2b humane embryonale Niere 293 Zellen (HEK293rnKCC2b)18 stabil im Perlenbad (37 °C) auftauen. Die Zellen werden aus dem Kryoröhrchen in ein Zentrifugenröhrchen mit 5 ml frischem Medium überführt. Drehen Sie die Zelle bei 1200 ×g für 3-5 min.
  3. Verwenden Sie eine Aspiratorpipette (befestigt an einer Vakuumpumpe), um den Überstand abzusaugen, und fügen Sie 10 ml frisches Medium hinzu, um die Zellen wieder zu suspendieren. Die Zellsuspension auf eine 10 cm lange Tellerplatte geben.
  4. Stellen Sie die Schale in den Inkubator und lassen Sie sie 48 h bei 37 ° C in einer befeuchteten 5%CO2-Atmosphäre wachsen. Überwachen Sie die Inkubationszeit, um ein gesundes Zellwachstum zu gewährleisten. Weitere Spaltung der Zellen, wenn sie nach der Inkubationszeit eine Konfluenz von über 90% erreicht haben.
  5. Saugen Sie die alten Medien aus der Zellschale ab und spülen Sie die Zellen vorsichtig mit 2 ml Phosphatpuffersalzlösung (PBS) ab. Fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie für ca. 1-2 min bei Raumtemperatur.
  6. Verwenden Sie 2 ml komplettes Medium, um die trypsinisierten Zellen in der Schale vorsichtig zu waschen. Fügen Sie 9 ml frische Medien zu neuen Gerichten hinzu und fügen Sie 1 ml Lösung aus dem alten Gericht zu jedem der neuen hinzu. Die gespaltenen Zellschalen für 48 h zurück in den Inkubator geben, um ≥ 90% Konfluenz zu erreichen.
  7. Behandeln Sie die Zellen entweder mit Dimethylsulfoxid (DMSO) als Kontrolle, 8 μM Staurosporin oder 0,5 mM N-Ethylmaleimid (NEM) für 15 Minuten, bevor Sie die Zellen im Lysepuffer ernten.

2. Vorbereitung von Zelllysaten und Beladung von Proben

  1. Absaugen der Medien auf der Kulturschale (aus Transfektionsverfahren). Die Zellkultur auf Eis legen und die Zellen mit eiskaltem PBS waschen.
  2. Das PBS wird abgesaugt, dann 1,0 ml eiskalter Lysepuffer mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-Tetraessigsäure (EGTA), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 50 mM Natriumfluorid, 5 mM Natriumpyrophosphat, 10 mM Natrium-β-glycerophosphat, 1 mM Natriumorthovanadat, 1% (w/v) Triton X-100, 0,27 M Saccharose, 1 mM Benzamin, 0,1% (v/v) 2-Mercaptoethanol und 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) in die Schale.
    HINWEIS: Das Volumen des Lysepuffers während der Zellernte variiert mit der Schalengröße, zum Beispiel ist 1 ml Lysepuffer pro 1 x 107 Zellen / 100 mm Schale / 150 cm 2 Kolben geeignet, während 0,5 ml pro 5 x 106 Zellen / 60 mm Schale / 75 cm2 Kolben geeignet ist.
  3. Verwenden Sie einen kalten Kunststoffzellenschaber, um die Zellen vom Boden der Schale abzukratzen, und verwenden Sie dann vorsichtig eine Pipette, um die Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen, das bereits auf Eis liegt. Rühren Sie das Rohr 30 min lang konstant bei 4 °C.
  4. Die Zelllysate in einer Kaltzentrifuge (4 °C) bei 16.000 x g für 20 min schleudern, das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge nehmen und auf Eis legen. Sammeln Sie den Überstand in ein vorgekühltes frisches Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet.
    HINWEIS: Je nach Zelltyp kann es notwendig sein, die Zentrifugationskraft und -zeit zu variieren. Allgemeine Richtlinien empfehlen jedoch die Zentrifugation bei 16.000 x g für 20 Minuten. Dies muss jedoch für jedes Experiment ermittelt werden. Zum Beispiel benötigen empfindliche Zellen wie Leukozyten eine sehr leichte Zentrifugationsgeschwindigkeit.

3. Herstellung von Immunpräzipitantien aus Zelllysaten

  1. 300 μL Protein-G-Sepharose werden in ein Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert. Die Lösung bei 500 x g für 2 min drehen und den Überstand verwerfen.
  2. Fügen Sie 500 μL PBS hinzu und wirbeln Sie die Lösung gut durch. Die Lösung bei 500 x g für 2 min drehen und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
  3. Mischen Sie 1 mg Anti-KCC2 Thr906 und Anti-KCC2 Thr1007 Antikörper mit 200 μL Protein-G-Sepharose-Perlen und bilden Sie das Volumen auf 500 μL mit PBS. Auf einer vibrierenden Plattform oder einem rotierenden Rad 2 h bei 4 °C schütteln. 2x mit PBS waschen.
  4. Führen Sie eine Proteinquantifizierung an den Ganzzelllysaten durch und fügen Sie 1 mg des Zelllysats zu den gewaschenen Perlen hinzu. In einem End-to-End-Rotator 2 h bei 4 °C vorsichtig inkubieren. Die Perlen herunterdrehen und 3x mit PBS waschen, das 150 mM Natriumchlorid (NaCl) enthält.
  5. Immunpräzipitanten (Perlen) 3x mit 200 μL PBS waschen. Resuspendieren Sie das endgültige Pellet in 100 μL 1x Lithiumdodecylsulfat (LDS) Probenpuffer.
  6. Die Röhrchen in einem Rotorschüttler bei Raumtemperatur 5 min schütteln und in einem Heizblock bei 75 °C 10 min inkubieren. Zentrifugieren Sie die Beladungsprobe bei 11.000 x g für 2 min und verwenden Sie den Überstand zum Beladen des Gels.

4. Durchführung des Western Blots

  1. Gießen Sie die Gießvorrichtung zusammen und gießen Sie frisch zubereitetes 8% Trenngel (siehe Tabelle 1 für Rezept/Zubereitung), um das Gel zu gießen, so dass etwa 2 cm Platz von der Oberseite des Gießglases bleibt. 200 μL absolutes Isopropanol in den Aufbau geben und 60 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
    HINWEIS: Das Polyacrylamid-Gelrezept für die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) hängt von der Größe des interessierenden Proteins ab (Tabelle 2). Notieren Sie sich daher die Proteingröße, bevor Sie den gewünschten Gelprozentsatz bestimmen.
  2. Verwenden Sie eine Pipette, um das Isopropanol zu entfernen und spülen Sie das Gel vorsichtig mit etwa 200 μL destilliertem Wasser ab. Fügen Sie frisch zubereitetes 6%iges Stapelgel hinzu (siehe Tabelle 1 für Rezept/Zubereitung), um den ca. 2 cm großen Raum auf dem Gießaufbau aufzufüllen. Vorsichtig in den Brunnenkamm einlegen und 30 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
  3. Fixieren Sie das gegossene Gel in den Elektrophoresetank.
  4. Lösen Sie 30,3 g Tris-Base, 144,1 g Glycin und 10 g SDS in 1000 ml destilliertem Wasser, um 10x Transferpuffer herzustellen. Bereiten Sie 1x Laufpuffer vor, indem Sie 10 mL 10% SDS und 100 mL 10x Transferpuffer zu 890 mL destilliertem Wasser hinzufügen.
  5. Gießen Sie 1x Laufpuffer in den Tank. Laden Sie 5 μL Molekulargewichtsmarker in die erste Vertiefung und eine gleiche Menge Protein in jede Vertiefung des SDS-PAGE-Gels (zwischen 18-30 μL, abhängig von der verwendeten Kammgröße). Leere Vertiefungen mit 1x LDS auffüllen und das Gel ca. 90-120 min bei 120 V laufen lassen.
  6. 58,2 g Tris-Base und 29,3 g Glycin werden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst, um einen 10-fachen Transferpuffer herzustellen. Aktivieren Sie die Nitrocellulosemembran mit 1x Transferpuffer, der 20% Methanol enthält. Spülen Sie das Gel und die Membran mit dem Transferpuffer ab und verteilen Sie sie vorsichtig auf dem Vorbereitungsstapel.
    HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, den pH-Wert der Lauf- und Transferpuffer anzupassen, da sie den optimalen pH-Wert aufweisen sollten. Außerdem ist es ratsam, diese Puffer vorzubereiten und vor dem Experiment bei Raumtemperatur zu lagern, um Zeit zu sparen.
  7. Ordnen Sie das zu übertragende Sandwich in dieser Reihenfolge an: negative Elektrode (schwarzer Rahmen/Ende) - Sandwichschaum - Filterpapier - gespültes SDS-PAGE Gel - gespülte Nitrozellulosemembran - Filterpapier - Sandwichschaum - positive Elektrode (roter Rahmen). Stapeln Sie das montierte Sandwich in den Transfertank und laufen Sie mit 90 V für 90 min oder 30 V für 360 min.

5. Antikörperfärbung und Bildentwicklung

  1. Entfernen Sie die Membran und lassen Sie sie trocknen. Blockieren Sie die Membran für 1 h bei Raumtemperatur mit einem Blockpuffer aus 5% Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
  2. Die Membranen werden mit geeigneten Verdünnungen des primären Antikörpers 8,15,19 und des Beta-Aktins (Belastungskontrolle) in Blockierpuffer für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Waschen Sie die Membran in drei Waschgängen von je 1x TBS-T für jeweils 5 min.
    HINWEIS: Die Inkubation der separaten Membran mit Belastungskontrollen wie Beta-Aktin, Alpha-Tubulin oder Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Antikörpern dient dazu, die anderen westlichen Blotting-Ergebnisse während der nachfolgenden Quantifizierung zu normalisieren. Die empfohlene Verdünnung für jeden primären Antikörper ist im Handbuch des Herstellers verfügbar.
  3. Inkubieren Sie die gewaschene Membran mit sekundären Antikörpern, die 5000-fach in Blockierpuffer verdünnt sind, für 60 min bei Raumtemperatur. Auch hier waschen Sie die Membran 3x in 1x TBS-T für jeweils 5 min.
    HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, dass der sekundäre Antikörper gegen die Spezies erhöht wird, bei der der primäre Antikörper erhöht wird. Wenn beispielsweise der primäre Antikörper des Gesamt-KCC2 Maus-Anti-KCC2 ist, muss der sekundäre Antikörper für Anti-Maus verwendet werden.
  4. Legen Sie die gewaschene Membran auf die Bildplatine. Mischen Sie gleiche Volumina jedes Reagenzes für verbesserte Chemilumineszenz (ECL) und verteilen Sie die gemischte Lösung vorsichtig auf der Membran, um Signale zu entwickeln.

6. Bildaufnahme mit einem Bildgebungssystem und Datenquantifizierung

  1. Bringen Sie die Bildkarte für die Bildgebung in das entsprechende Fach des Bildgebungssystems. Öffnen Sie die Imaging-Software auf dem Computer für die Bildverarbeitung.
  2. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Neues Protokoll und wählen Sie Single Channel (Einzelner Kanal). Klicken Sie im Dialogfeld Gelbildgebung/Anwendung auf Auswählen, scrollen Sie zu Blot und wählen Sie entweder Chemi Hi Sensitivity (Chemi Hi Sensitivität) oder Chemi Hi Resolution (Chemi Hi Sensitivität) oder Chemi Hi Resolution (Chemi Hi Resolution). Klicken Sie dann auf Signal Accumulation Setup, um die Dauer und Anzahl der aufzunehmenden Bilder festzulegen.
  3. Klicken Sie unter Protokolleinstellungen auf Gel positionieren und passen Sie das Gel ggf. im Bildgebungssystem an. Klicken Sie auf Protokoll ausführen , um die Bilder abzurufen.
  4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eines der erfassten Bilder im Feld Imaging-Katalog, um die Bilder auf dem Computer zu speichern. Navigieren Sie zum gewünschten Bild und klicken Sie im Dialogfeld Ausführen auf Bild auswählen und fortfahren .
  5. Klicken Sie auf das Symbol Bildtransformation , um den Kontrast und die Pixelsättigung des Bildes anzupassen. Klicken Sie auf das Screenshot-Symbol in der allgemeinen Symbolleiste, um das Bild je nach gewünschtem Bildformat auf dem Computer zu speichern.
  6. Messen Sie die Banddichten mit der ImageJ-Software und analysieren Sie sie mit geeigneten statistischen Tools.

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Ergebnisse

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Hier untersuchte das repräsentative Ergebnis in Abbildung 1 den Einfluss von Staurosporin und NEM auf die WNK-SPAK/OSR1-vermittelte Phosphorylierung von KCC2 und NKCC1 in HEK293-Zelllinien, die KCC2b (HEKrnKCC2b)18 stabil exprimieren, unter Verwendung der Western Blotting-Technik. Umfassende Details zu den repräsentativen Ergebnissen werden in Zhang et al.15 diskutiert. Ähnlich wie NEM ist Staurosporin ein breiter Kinase-Inh...

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Diskussion

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Viele Methoden wurden verwendet, um die Aktivitäten von SLC12 von CCCs zu messen, die in den Neuronen exprimiert werden, einschließlich KCC2. Viele dieser Techniken haben sich als wissenschaftliche Erkenntnisse über die Analyse der funktionellen Relevanz dieser Transporter und ihrer Struktur-Funktionsmuster bei verschiedenen krankheitsbedingten Mutationen erwiesen. Entscheidend ist, dass die verschiedenen Methoden Vorteile und Vorbehalte haben21. Das oben erläuterte Protokoll beschreibt jedoch, wi...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Royal Society UK (Grant no. IEC\NSFC\201094) und einem Commonwealth Ph.D. Stipendium unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
40%Acrylamid Sigma-AldrichA2917Wird zur Herstellung von Trenn- und Stapelgel für SDS-PAGE verwendet 
Ammonium pro SulfatSigma-Aldrich248614Wird zur Herstellung von Trenn- und Stapelgel für SDS-PAGE verwendet.
anti pSPAKDundeeUniversity S670BWird als primärer Antikörper für Western Blotting
anti-KCC2Dundee UniversityS700CWird als primärer Antikörper für Western Blotting
anti-KCC2 pSer940Thermo Fisher ScientificPA5-95678verwendet wird als primärer Antikörper für Western Blotting
anti-KCC2 pThr1007Dundee UniversityS961CWird als Primärantikörper für Western-Blotting-Anti-KCC2
pThr906DundeeUniversity S959CVerwendet als Primärantikörper für Western-Blotting-Anti-Maus-Zellsignaltechnologie
66002Wird als Sekundärantikörper für Western-Blotting-Anti-NKCC1 verwendet
DundeeUniversity S841BWird als Primärantikörper für Western-Blotting-Anti-NKCC1
pThr203/207/212Dundee UniversityS763BWird als Primärantikörper für Western-Blotting
verwendet Anti-Kaninchen-ZellsignaltechnologieC29F4Wird als Sekundärantikörper für Western-Blotting
Anti-Schafeabcamab6900Wird als Sekundärantikörper für Western-Blotting
Anti-SPAKDundee UniversityS669DWird als Primärantikörper für Western-Blotting verwendet
anti-β-Tubulin IIISigma-AldrichT8578Wird als Primärantikörper für Western Blotting
verwendet BenzamineMerck UK135828Wird als Bestandteil des Lysepuffers
verwendet Beta-MercaptoethanolSigma-AldrichM3148Wird als Bestandteil des Ladepuffers und des Lysepuffers
verwendet Bradford CoomasieThermo Scientific1856209Wird für die Quantifizierung von Lysatproteinen verwendet
GießapparatAtto WSE-1165WZur Ausführung der SDS-Seiten-Elektrophorese
ZentrifugeEppendorf5804Zur Lysevorbereitung
ZentrifugeVWRMicroStar 17RZur
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100MLZur Herstellung von Zellkulturexperimenten
Getrocknete MagermilchMarvelN/AZur Herstellung von Blockierungen Puffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - hoher GlukosegehaltSigma-AldrichD6429für Zellkulturen
verwendet Perkin ElmerORTT755/2655Wird verwendet, um ein Bild für Western Blotting
zu entwickeln EDTAFisher ScientificD/0700/53Wird als Bestandteil des Lysepuffers
verwendet EGTASigma-Aldriche4378Wird als Bestandteil der Lyse verwendet Puffer
Elektrophorese NetzteilBioRadPowerPAC HCZur Stromversorgung für den Betrieb von SDS-Seitenelektrophorese
EthanolThermoFisherE/0650DF/17Wird zur Vorbereitung sterilisierter Geräte und Umgebungen verwendet
Fötales Rinderserum -  hitzeinaktiviertMerck Life Sciences UKF9665Wird für Zellkulturen
verwendet FumehoodWalkerA7277Wird für die Zellkultur verwendet
Gel-Blotting - WhatmanGE Healthcare 10426981Wird beim Western Blotting verwendet, um ein Transfersandwich
herzustellen GlycinSigma-Aldrich15527Wird zur Herstellung von Puffern
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software, Inc., USAVersion 6.0Wird zum Plotten von Diagrammen und zur Analyse von Daten für das Western Blotting
verwendet HClAcros Organics10647282Wird verwendet, um Trenn- und Stapelgel für SDS-PAGE herzustellen.
HeizblockGrantQBT1Wird zum Erhitzen von WB-Ladeproben
verwendet HEK293-ZellenMerck UK12022001-1VLZelllinie für Kulturexperiment
ImageJ SoftwareWayne Rasband und Mitwirkende; NIH, USA ImageJ 1.53eZur Messung der Bandenintensität von Western-Blotting-Bildern
BildgebungssystemBioRadChemiDoc MPZur Aufnahme von Western-Blotting-Bildern
InkubatorLEECLEEC precision 190DZur Zellkultur
IsopropanolHoneywell24137Zur Verwendung im Gießgel für die Elektrophorese
L-Glutamin-LösungSigma-AldrichG7513Zur Verwendung für die Zellkultur
Lithiumdodecylsulfat (LDS)NovexNP0008Zur Verwendung als Ladepuffer für Western Blotting
MEM Nicht-essentielle Aminosäure Merck Life Sciences UKM7145Wird für die Zellkultur
verwendet MikrozentrifugeEppendorf5418Wird zur Vorbereitung von Lysaten für WB
Microplate ReaderBioRadiMarkWird für die Anzeige der Lysatproteinkonzentration
verwendet Microsoft PowerpointMicrosoft, USAPowerPoint2016Wird verwendet, um Western-Blotting-Bilder zu bearbeiten
MolekulargewichtsmarkerBioRad1610373Wird für Western Blotting
verwendet N-EthylmaleimidThermo Fisher Scientific23030Wird für Zellkulturexperimente
verwendet NitrocellulosemembranFisher Scientific45004091Wird für Western Blotting
verwendet Penicillin-StreptomycinGibco15140122Wird für Zellkulturen
verwendet pH-MessgerätMettler ToledoSeven compact s210Zur Überwachung des pH-Werts von Pufferlösungen
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)Sigma-AldrichP7626Wird als Bestandteil des Lysepuffers verwendet
Phosphatpuffer KochsalzlösungSigma-AldrichD8537Wird für Zellkulturen
verwendet PKCδ pThr505Zellsignaltechnologie9374Wird als Primärantikörper für Western Blotting
verwendet Sepharose Protein GGeneronPG50-00-0002Wird zur Immunpräzipitation
NatriumchloridSigma-AldrichS7653Wird als Bestandteil des Waschpuffers
verwendet NatriumchloridSigma-AldrichS7653Wird zur Herstellung von TBS-T-Puffer
NatriumdodecylsulfatSigma-AldrichL5750Wird verwendet, um Trenn- und Stapelgel für SDS-PAGE herzustellen
NatriumorthovanadatSigma-AldrichS6508Wird als Bestandteil des Lysepuffers
verwendet NatriumpyruvatSigma-AldrichS8636Wird für Zellkulturen
Natrium-Β-Glycerophosphatverwendet Merck UKG9422Wird als Bestandteil des Lysepuffers
verwendet Staurosporin (aus Streptomyces sp.)Wissenschaftlicher Laborbedarf, UKS4400-1MGWird für Zellkulturexperimente
verwendet SaccharoseScientifc LaborbedarfS0389Wird als Bestandteil des Lysepuffers
TEMEDSigma-AldrichT7024verwendet zur Herstellung von Trenn- und Stapelgel für SDS-PAGE 
TransferkammerBioRad1658005EDUWird beim Western Blotting verwendet, um Protein auf die Membran zu übertragen
TrisSigma-AldrichT6066Wird verwendet, um Trenn- und Stapelgel für SDS-PAGE herzustellen.
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Wird als Bestandteil des Lysepuffers
Trypsin-EDTA SolutionMerck Life Sciences UKT4049Wird für die Zellkultur
verwendet Tween-20Sigma-AldrichP3179Wird als Hersteller TBS-T Puffer
verwendetVakuumpumpe CharlesAusten Dymax 5Wird für Zellkulturen
verwendet VortexScientific IndustriesK-550-GEWird in der Probenvorbereitung
verwendet Vortex-MischerScientific Industries LtdVortex-Genie  K-550-GEWird zum Mischen von
aufgelösten Proben verwendet WasserbadGrant Instruments Ltd. (JB Academy)JBA5Wird zum Inkubieren von Lösungen
verwendet verwendet verwendet Rotation von Proben Wird für das ECL-Reagenz verwendet verwendet verwendet verwendet

Referenzen

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