Summary
Wir stellen detaillierte Methoden zur Generierung von vier Gewebetypen aus humanen mesenchymalen Stammzellen vor, die zur Rekapitulation von Knorpel, Knochen, Fettpolster und Synovia im menschlichen Kniegelenk verwendet werden. Diese vier Gewebe werden in einen maßgeschneiderten Bioreaktor integriert und durch Mikrofluidik miteinander verbunden, so dass ein Kniegelenk-on-a-Chip entsteht.
Abstract
Die hohe Prävalenz von schwächenden Gelenkerkrankungen wie Arthrose (OA) stellt eine hohe sozioökonomische Belastung dar. Derzeit sind die verfügbaren Medikamente, die auf Gelenkerkrankungen abzielen, meist palliativ. Der ungedeckte Bedarf an wirksamen krankheitsmodifizierenden OA-Medikamenten (DMOADs) wurde in erster Linie durch das Fehlen geeigneter Modelle zur Untersuchung der Krankheitsmechanismen und zur Erprobung potenzieller DMOADs verursacht. In dieser Arbeit beschreiben wir die Etablierung eines mikrophysiologischen Miniatursystems (miniJoint), das aus fettigen, fibrösen und osteochondralen Gewebekomponenten besteht, die von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) abgeleitet sind. Um die dreidimensionalen (3D) Mikrogewebe zu erhalten, wurden MSCs vor oder nach der Differenzierung in photovernetzbare methacrylierte Gelatine eingekapselt. Die zellbeladenen Gewebekonstrukte wurden dann in einen 3D-gedruckten Bioreaktor integriert, wodurch das miniJoint entstand. Getrennte Ströme von osteogenen, fibrogenen und adipogenen Medien wurden eingeführt, um die jeweiligen Gewebephänotypen zu erhalten. Ein gemeinsam genutzter Strom wurde durch das Knorpel-, Synovial- und Fettgewebe perfundiert, um eine Gewebeübersprechung zu ermöglichen. Dieses Strömungsmuster ermöglicht die Induktion von Störungen in einer oder mehreren Gewebekomponenten für mechanistische Untersuchungen. Darüber hinaus können potenzielle DMOADs entweder durch "systemische Verabreichung" über alle Medienströme oder durch "intraartikuläre Verabreichung" getestet werden, indem die Medikamente nur dem gemeinsamen "Synovialflüssigkeit"-simulierenden Fluss zugesetzt werden. Damit kann das miniJoint als vielseitige In-vitro-Plattform dienen, um Krankheitsmechanismen effizient zu untersuchen und Medikamente in der personalisierten Medizin zu testen.
Introduction
Gelenkerkrankungen wie Arthrose (OA) sind weit verbreitet und schwächend und stellen weltweit eine der Hauptursachen für Behinderungendar 1. Es wird geschätzt, dass allein in den USA 27 Millionen Patienten von Arthrose betroffen sind und 12,1 % der Erwachsenen ab 60 Jahren auftreten2. Leider sind die meisten Medikamente, die derzeit zur Behandlung von Gelenkerkrankungen eingesetzt werden, palliativ, und es gibt keine wirksamen krankheitsmodifizierenden OA-Medikamente (DMOADs)3. Dieser ungedeckte medizinische Bedarf ergibt sich in erster Linie aus dem Fehlen eines wirksamen Modells zur Untersuchung der Krankheitsmechanismen und zur Entwicklung potenzieller DMOADs. Die konventionelle zweidimensionale (2D) Zellkultur spiegelt nicht die 3D-Natur von Gelenkgewebe wider, und die Kultur von Gewebeexplantaten wird oft durch einen signifikanten Zelltod behindert und repliziert in der Regel nicht die dynamischen Gewebeverbindungen4. Darüber hinaus verringern genetische und anatomische Unterschiede die physiologische Relevanz von Tiermodellenerheblich 4.
Organs-on-Chips (OoCs), also mikrophysiologische Systeme, sind ein vielversprechendes Forschungsfeld an der Schnittstelle von Ingenieurwissenschaften, Biologie und Medizin. Bei diesen In-vitro-Plattformen handelt es sich um minimalfunktionelle Einheiten, die definierte gesunde oder pathologische Merkmale ihrer In-vivo-Gegenstücke replizieren5. Darüber hinaus können diese miniaturisierten Systeme verschiedene Zellen und Matrizen beherbergen und die biophysikalischen und biochemischen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Geweben simulieren. Ein mikrophysiologisches System, das das native Synovialgelenk originalgetreu rekapitulieren kann, verspricht daher, eine effektive Plattform für die Modellierung von Gelenkerkrankungen und die Entwicklung potenzieller DMOADs zu bieten.
Humane mesenchymale Stammzellen (MSCs) können aus vielen Geweben im ganzen Körper isoliert und in osteogene, chondrogene und adipogene Linien differenziert werden6. MSCs wurden erfolgreich eingesetzt, um verschiedene Gewebe zu züchten, darunter Knochen, Knorpel und Fettgewebe6, was bedeutet, dass sie eine vielversprechende Zellquelle für die Entwicklung der Gewebekomponenten des Kniegelenks darstellen. Wir haben kürzlich ein mikrophysiologisches Miniatur-Gelenksystem namens miniJoint entwickelt, das aus MSC gewonnenes Knochen-, Knorpel-, Faser- und Fettgewebe umfasst7. Insbesondere ermöglicht das neuartige Design das Übersprechen von Gewebe durch mikrofluidische Strömung oder Permeation (Abbildung 1). Im Folgenden stellen wir die Protokolle für die Herstellung der Chipkomponenten, das Engineering der Gewebekomponenten, die Kultur der künstlich hergestellten Gewebe im Chip und die Entnahme von Geweben für nachgelagerte Analysen vor.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des miniJoint-Chips, die die Anordnung der verschiedenen Gewebekomponenten und Mediumflüsse zeigt. OC = osteochondrales Gewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Protocol
Das folgende Protokoll folgt den ethischen Richtlinien der University of Pittsburgh und der Ethikkommission für Humanforschung der University of Pittsburgh. Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Herstellung von 3D-gedruckten Bioreaktoren
- Verwenden Sie eine Computersoftware, um osteochondrale (Abbildung 2A) und miniJoint-Bioreaktoren (Abbildung 2B) zu entwerfen, die Kammern, Einsätze und Deckel enthalten. Die Bemaßungsinformationen für jedes Teil sind in Abbildung S1 dargestellt.
- Übertragen Sie das Design auf einen 3D-Drucker und drucken Sie es mit einer Photopolymertinte.
- Spülen Sie die 3D-gedruckten Teile (Abbildung 2C-F) dreimal mit 15 ml 95%igem Ethanol ab. Anschließend werden die gedruckten Teile 200 s lang in einem Taschenlampenpolymerisationsgerät vollständig vernetzt.
- Fügen Sie O-Ringe zu Einsätzen und Deckeln hinzu (Abbildung 2C, D) und testen Sie, ob die Teile passen (Abbildung 2G, H).
Abbildung 2: Herstellung der verschiedenen Komponenten zur Herstellung des miniJoint-Bioreaktors. (A,B), 3D-Modelle von Bioreaktoren zur Herstellung von (A) osteochondralen und (B) miniJoint-Chips. (C,D) 3D-gedruckte (C) Deckel und (D) Einsätze mit installiertem O-Ring. (E,F) 3D-gedruckte Kammern für (E) osteochondrale und (F) miniJoint-Gewebekulturen. (G,H) Zusammenbau von (G) osteochondralen und (H) miniJoint-Chips. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
2. Engineering der Gewebekomponenten
ANMERKUNG: Die Verfahren zur Herstellung von Lithium-Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) und methacrylierter Gelatine (GelMA) sind in früheren Studien beschrieben 8,9.
- Führen Sie die folgenden Schritte aus, um GelMA zu erstellen.
- 17 g Gelatine Typ B in 500 ml destilliertes Wasser geben und dann 30 Minuten bei 37 °C in einem Shaker mischen.
- Dann 13 ml Methacrylanhydrid hinzufügen, wieder auf den 37 °C heißen Shaker geben und über Nacht schütteln lassen.
- Am nächsten Tag aliquotieren Sie das GelMA in einzelne Dialysebeutel mit ~60 ml in jedem Beutel.
- Legen Sie alle Dialysebeutel mit einem Rührstab in destilliertes Wasser und lassen Sie die Dialyse 7 Tage lang warten. Wechseln Sie das Wasser mehrmals täglich und lassen Sie die Beutel über Nacht bei 4 °C.
- Frieren Sie das GelMA an Tag 7 bei −80 °C ein. Sobald es vollständig gefroren ist, fahren Sie mit der Gefriertrocknung fort.
- Legen Sie das GelMA in eine Schale in die Vakuumkammer eines Gefriertrockners und lassen Sie es gefriertrocknen. Stellen Sie sicher, dass das GelMA vollständig getrocknet ist, bevor Sie es aus dem Gefriertrockner entfernen.
- Lösen Sie das GelMA in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS mit Ca2+ und Mg2+) bei 15 % (w/v) auf. Um sicherzustellen, dass der pH-Wert bei 7,4 liegt, fügen Sie NaOH in kleinen Mengen hinzu, bis der pH-Wert 7,4 erreicht. Ergänzen Sie die Lösung mit 1x Antibiotikum-Antimykotikum und 0,15 % (w/v) LAP basierend auf dem erworbenen Volumen. Lagern Sie die 15%ige GelMA-Lösung bis zur Verwendung bei −20 °C und schützen Sie sie vor Licht.
- Legen Sie 3D-gedruckte Dual-Flow-Bioreaktorkammern, Deckel und Einsätze in Autoklavenbeutel und autoklavieren Sie sie bei 121 °C für 20 Minuten mit Dampf und dann für 20 Minuten mit trockener Hitze.
- Weichen Sie die Bioreaktorkammern, Deckel und Einsätze in der biologischen Sicherheitswerkbank über Nacht in 15 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung ein und lassen Sie sie anschließend trocknen.
- Isolieren Sie aus menschlichem Knochenmark gewonnene MSCs aus chirurgischen Abfällen der gesamten Gelenkendoprothetik mit IRB-Zulassung (University of Pittsburgh und University of Washington).
- Spülen Sie insbesondere das Knochenmark aus dem trabekulären Knochen des Oberschenkelhalses und -kopfes aus und resuspendieren Sie es in Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM).
- Filtrieren Sie die Suspension durch ein 40-μm-Sieb und zentrifugieren Sie den Durchfluss bei 300 x g für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Pellets mit Wachstumsmedium [DMEM, 10% fötales Kälberserum (FBS) und 1x Antibiotikum-Antimykotikum] und legen Sie es dann in Gewebekulturflaschen.
- Wechseln Sie das Nährmedium alle 3 Tage bis 4 Tage. Stellen Sie sicher, dass ein Zusammenfluss von 70 % bis 80 % erreicht ist, bevor Sie fortfahren.
- Trennen Sie die Zellen durch Inkubation mit Trypsin-EDTA für 2-3 Minuten und Passage in einem Verhältnis von 1 Million Zellen pro T150-Flasche.
- Erweitern Sie die Zellen auf P5. Nach der Trypsinisierung suspendieren Sie die Zellen, zählen Sie sie und pelletieren Sie sie dann, indem Sie sie 5 Minuten lang bei 300x g zentrifugieren.
- Mit einer 1.000-μl-Pipette resuspendieren Sie die Zellen bei 20 x 106 Zellen/ml in 15%iger GelMA-Lösung.
Anmerkungen: Schalten Sie das Licht der biologischen Sicherheitswerkbank aus. - Drücken Sie mit sterilen Handschuhen eine sterile, trockene Silikonform gegen eine Petrischale. Setzen Sie dann mit einer Pinzette einen Einsatz in jedes Loch der Silikonform ein, wobei die Lochseite des Einsatzes nach unten zeigt.
- Fügen Sie mit einer 200-μl-Pipette die Zellsuspension hinzu, um den Einsatz zu füllen (~50 μl pro Einsatz).
- Verwenden Sie eine UV-Taschenlampe (LED-Licht mit einer Wellenlänge von 395 nm), um die Oberseite des Gels/Einsatzes 1,5 Minuten lang zu vernetzen. Beleuchten Sie dann die andere Seite für 30 s. Die Vernetzung tritt auf, wenn der LAP-Photoinitiator UV-Licht ausgesetzt wird.
Anmerkungen: Die Zellsuspension kann während dieser Zeit im Inkubator aufbewahrt oder vor Licht geschützt werden. - Mit einer sterilen Pinzette werden die Einsätze sofort in 8 ml Wachstumsmedium in einer 6-Well-Platte (DMEM, ergänzt mit 10 % [v/v] FBS und 1x Antibiotikum-Antimykotikum) überführt, damit sich die Zellen über Nacht erholen können.
- Differenzieren Sie die Zellen in vier Linien.
- Um Fettgewebe (AT) zu erzeugen, überführen Sie die Einsätze in 8 ml adipogenes Medium (AM; Alpha-MEM, 10% FBS, 0,2 mM Indometacin, 1x Insulin-Transferrin-Selen (ITS), 0,45 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin, 0,1 μM Dexamethason und 1x Antibiotikum-Antimykotikum) zur Einleitung der Differenzierung. Im Idealfall werden vier Inserts mit 8 mL adipogenem Medium in eine einzige Vertiefung einer Nicht-Gewebekultur-Well-Platte gegeben. Kultur der Zellen in den Well-Platten für 28 Tage, wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wird.
- Um die osteochondralen Einheiten (OC) zu konstruieren, legen Sie die Einsätze in Dual-Flow-Bioreaktorkammern, verschließen Sie die Vertiefungen und infundieren Sie die beiden Ströme separat mit einer Flussrate von 5 μl/min mit 35 ml osteogenem Medium (OM; DMEM, 10 % FBS, 1x Antibiotikum-Antimykotikum, 0,1 μM Dexamethason, 0,01 M β-Glycerophosphat, 100 ng/ml knochenmorphogenes Protein 7 (BMP7), 50 μg/ml Ascorbinsäure und 10 nM Vitamin D3) und 35 ml chondrogenes Medium (CM; DMEM, 1x Antibiotikum-Antimykotikum, 1x ITS, 0,1 μM Dexamethason, 40 μg/ml Prolin, 50 μg/ml Ascorbinsäure und 10 ng/ml transformierender Wachstumsfaktor β3)10. Halten Sie die Zelldifferenzierung 28 Tage lang aufrecht, indem Sie alle zwei Wochen Mediumswechsel durchführen.
- Um die Fibroblasten abzuleiten, differenzieren Sie die MSCs in 2D-Kultur über 21 Tage in einem T150 cm 2-Gewebekulturkolben unter Verwendung von 20 ml fibrogenem Medium (FM; fortgeschrittenes DMEM, 5% FBS, 1x GlutaMAX, 1x Antibiotikum-Antimykotikum und 50 μg/ml Ascorbinsäure). Wechsle das Medium jede Woche. Verwenden Sie 4 ml Trypsin, um die Zellen abzulösen, und verkapseln Sie die 3D-Gele gemäß dem oben beschriebenen Protokoll in den Einsätzen, um synoviales faserähnliches Gewebe (OFS) zu erhalten.
ANMERKUNG: Die Zusammensetzungen aller Differenzierungsmedien sind in Tabelle 1 zu finden.
3. Etablierung des miniJoint-Chips
- Autoklavieren Sie die 3D-miniJoint-Bioreaktorkammern, Silikonschläuche mit einem Innendurchmesser von 0,062 Zoll und einem Außendurchmesser von 0,125 Zoll sowie F 1/16 Luer-Lock-Anschlüsse. Verbinden Sie den Silikonschlauch an einem Ende mit dem Widerhaken des miniJoint-Bioreaktors und am anderen Ende mit dem Luer-Verschluss.
- Bereiten Sie die in Schritt 2.11 erwähnten AM, OM (Entfernen von BMP7) und FMCM vor. Bereiten Sie zusätzlich das gemeinsame Medium (SM; phenolrotfreies DMEM, 1x Antibiotikum-Antimykotikum, 1x Na-Pyruvat, 1x ITS, 40 μg/ml Prolin, 50 μg/ml Ascorbinsäure und 0,5 ng/ml transformierender Wachstumsfaktor β3) für die miniJoint-Kultur vor. Füllen Sie 35 ml jedes Mediums in die Mediumreservoirs.
- Übertragen Sie die osteochondrale Einheit mit einer geraden Pinzette aus dem Dual-Flow-Bioreaktor in die rechte Vertiefung des miniJoint-Bioreaktors. Übertragen Sie den Fettgewebeeinsatz und den Fasergewebeeinsatz in die linke bzw. mittlere Vertiefung. Verschließen Sie alle Vertiefungen mit sterilisierten Deckeln.
- Verbinden Sie die Eingänge des miniJoint-Chips mit den Medienbehältern und die Auslässe mit Spritzen (Abbildung 3A-C).
- Montieren Sie die Spritzen auf eine Spritzenpumpe (Abbildung 3C) und geben Sie die Pumpe und die Chips in einen Inkubator. Die Mediumreservoirs werden außerhalb des Inkubators auf Eis gehalten.
- Betreiben Sie die Pumpe im Entnahmemodus und saugen Sie das Medium aus dem Mediumreservoir in die Kammer des miniJoint Bioreaktors. Dieser miniJoint-Kulturprozess dauert 28 Tage.
- Um Gelenkentzündungen und Knorpeldegeneration zu modellieren, wird dem fibrogenen Mediumstrom Interleukin 1β (IL-1β) mit 10 ng/ml zugesetzt. Ersetzen Sie die Spritzen am dritten Tag der IL-1β-Behandlung und geben Sie frisches IL-1β in das fibrogene Medium. Die Behandlung dauert 7 Tage.
- Verabreichen Sie das Medikament während des Drogentestschritts nach 3-tägiger IL-1β-Behandlung entweder im gemeinsam genutzten Medium, um eine "intraartikuläre Verabreichung" (Abbildung 3D) zu simulieren, wenn das Medikament lokal im Kniegelenk angewendet wird, oder in allen Medientypen, um eine "systemische Verabreichung" (Abbildung 3E) zu simulieren, wenn das Medikament über den Kreislauf auf das Kniegelenk wirkt.
- Entnahme einzelner Gewebe zur Analyse nach 7 Tagen IL-1β-Behandlung, unabhängig davon, ob die Proben in den letzten 4 Tagen einer medikamentösen Behandlung unterzogen wurden oder nicht.
Abbildung 3: Zusammenbau des miniJoints. (A,B) Gewebespezifische Medien werden aus den Einlässen 1-3 (I1-3) eingebracht und aus den Auslässen 1-3 (O1-3) ausgetragen. Das gemeinsam genutzte Medium wird von I4 bis O4 durchblutet. (C) Der vollständige Aufbau der miniJoint-Kultur. Medikamente (grüne, sonnenähnliche Formen) können entweder entweder nur in (D) das gemeinsam genutzte Medium oder (E) in alle Medien eingeführt werden, um jeweils eine "intraartikuläre Verabreichung" oder eine "systemische Verabreichung" zu simulieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
4. Individuelle Gewebeentnahme
- Verwenden Sie eine sterile, gebogene Pinzette, um die Einsätze zu entfernen.
- Schieben Sie einen Biopsienstanz durch die Mitte des Einsatzes, um das Gel zu entfernen, und legen Sie das Gel in PBS.
- Schneiden Sie die osteochondralen Gele bei der Beurteilung der Genexpression in zwei Hälften.
HINWEIS: Da das osteochondrale Gel aus zwei Gewebetypen besteht, ist es wichtig, die osteogenen und chondrogenen Zellen zu trennen. - Sammeln Sie die aufbereiteten Medien und Gewebe für verschiedene Experimente.
- Sammeln Sie etwa 1,5 ml aus jeder Medienquelle.
- Schockfrosten Sie das konditionierte Medium in flüssigem Stickstoff ein, nachdem Sie es 10 Minuten lang bei 14.000 x g zentrifugiert und das Sediment verworfen haben.
- Für die histologische Färbung und Immunfärbung fixieren Sie die OC- und SFT-Proben zunächst in 10%igem gepuffertem Formalin, dehydrieren sie in Ethanol aufsteigender Konzentrationen, klären sie in Xylol, betten sie in Paraffin ein und schneiden Sie sie schließlich in einer Dicke von 6 μm.
- Für die AT-Mikrogewebe fixieren Sie die Proben in 10% gepuffertem Formalin und färben sie direkt mit Oil Red O-Lösung oder BODIPY.
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Representative Results
Alle Gewebe des miniJoint wurden gesammelt, um ihre Phänotypen nach 28-tägiger Kultivierung im miniJoint zu analysieren (Abbildung 4A). Dies wurde in unserer vorherigen Publikation7 ausführlich beschrieben.
Durch den Einsatz von RT-qPCR, Immunfärbung und histologischer Färbung konnte bestätigt werden, dass die gewebespezifischen Phänotypen für die einzelnen Mikrogewebe gut erhalten blieben (Abbildung 4). Zum Beispiel exprimierte die knöcherne Komponente des OC-Mikrogewebes (OC-O), aber nicht die anderen Gewebebestandteile, hohe Konzentrationen von Osteocalcin (OCN). Im Gegensatz dazu wurden im Knorpelanteil des osteochondralen Gewebes (OC-C) Kollagen Typ II (COL2) und Aggrecan (ACAN) in signifikant höheren Konzentrationen exprimiert als in den anderen Geweben (Abbildung 4B). Die Expression von Adiponektin (ADIPOQ) und Leptin (LEP), zwei repräsentativen adipogenen Genen, war im AT deutlich höher als in den anderen Geweben. Die Ablagerung von Calciummineralien (Abbildung 4F,G) sowie alkalischer Phosphatase (ALP) und OCN-Proteinen (Abbildung 4D) wurde hauptsächlich im OC-O beobachtet, und das OC-C zeigte gut retinierte Glykosaminoglykane (GAG) (Abbildung 4C) und COL2 (Abbildung 4D). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Expression von zwei Knorpelozyten-Hypertrophie-assoziierten Markern, Kollagen Typ X (COL10) und Indian Hedgehog (IHH), die an Tag 28 im OC-C nachgewiesen wurden, nach 28-tägiger Kultur im miniJoint signifikant herunterreguliert war (Abbildung 4E).
Die Ergebnisse der RT-qPCR, der Immunfärbung und der Histologie bestätigten, dass die Phänotypen von AT und SFT nach 4 Wochen miniJoint-Kultur erfolgreich aufrechterhalten wurden (Abbildung 4B,H,I). Mit Hilfe der BODIPY-Färbung und der Ölrot-O-Färbung beobachteten wir eine reichliche Ablagerung von Lipidtröpfchen im AT (Abbildung 4H). Die Immunfluoreszenzfärbungsbilder in Abbildung 4I zeigen eine robuste Expression von Lubricin und Cadherin 11 (CDH11) durch die SFT nach 4 Wochen miniJoint-Kultur.
In Kombination deuten diese Ergebnisse auf die Erstellung eines funktionellen, mehrgewebigen Synovialgelenkmodells im miniJoint-System hin.
Abbildung 4: Aufrechterhaltung der einzelnen Gewebephänotypen der Mikrogewebe nach 4 Wochen Co-Kultur im miniJoint-Chip. (A) Zeitlicher Ablauf der Erzeugung eines normalen miniJoint-Chips unter Beibehaltung der gewebespezifischen Phänotypen. (B) RT-qPCR-Ergebnisse, die wichtige Markergene in allen Gewebekomponenten zeigen. Die OCN-Daten wurden auf die Werte im OC-O, die COL2- und ACAN-Daten auf die Werte im OC-C, die ADIPOQ- und LEP-Daten auf die Werte im AT und die TNC- und COL1-Daten auf die Werte im SFT normalisiert. Die Daten wurden mittels einfaktorieller ANOVA (N = 3 biologische Replikate) analysiert. * p < 0,05; ** p < 0,01; S. < 0,001; p < 0,0001. (C) Safranin O-Färbung der biphasischen OC-Einheit. Maßstabsbalken = 1 mm. (D) Histologische Färbe- und Immunfärbebilder, die das Vorhandensein knochen- und knorpelspezifischer Marker in den entsprechenden Komponenten der OC-Einheit bestätigen. Maßstabsbalken = 50 μm. (E) Die Immunfärbung zeigte eine deutlich geringere Expression von zwei Hypertrophiemarkern, COLX und IHH, im OC-C an Tag 56 als an Tag 28. Maßstabsbalken = 50 μm. (F) Alizarinrote Färbung der OC-Einheit, die das Vorhandensein von Kalkablagerungen vor allem im OC-O zeigt. Maßstabsbalken = 500 μm. (G) Vergrößerte Ansichten des Alizarinrot-Färbebildes in (F). Maßstabsbalken = 200 μm. (H) Ölrot-O- und BODIPY-Färbebilder, die die Retention von Lipidtröpfchen im AT zeigen. Maßstabsbalken = 50 μm. (I) Immunfärbungsbilder, die die Expression von Lubricin und CDH11 durch das synovialartige fibröse Gewebe (OFS) zeigen. Maßstabsbalken = 50 μm. Reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Li et al.7. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Um ein Krankheitsmodell zu erstellen, wurde Interleukin 1β (IL-1β) nach 28 Tagen Co-Kultur in den FM-Strom eingeführt (Abbildung 5A,B). Die Behandlung mit IL-1β führte zu Zellapoptose und erhöhten MMP-13-Spiegeln in der OFS (Abbildung 5C). Interessanterweise beobachteten wir einen Knorpelabbau in dem mit IL-1β behandelten MiniGelenk (Abbildung 5D), was auf das Auftreten von Übersprechen zwischen OC-C und SFT hindeutet.
Abbildung 5: Modellierung der Gelenkentzündung und -degeneration im miniJoint . (A) Schematische Darstellung der Induktion von "Synovitis" durch Herausfordern der SFT mit IL-1β. (B) Zeitplan für die Erstellung und Analyse des Krankheitsmodells. (C) TUNEL-Assay und MMP-13-Immunfärbung, die die pathologischen Veränderungen in der OFS zeigen. Die DNA-Fragmentierung wird durch die roten Pfeilspitzen angezeigt. Maßstabsbalken = 50 μm. (D) Safranin O-Färbung und MMP-13-Immunfärbungsbilder, die die Degeneration des OC-C zeigen. Maßstabsbalken = 50 μm. Reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Li et al.7. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Schließlich testeten wir die therapeutische Wirksamkeit von Naproxen (NPX) durch "systemische Verabreichung" (Abbildung 6A), die nachweislich den Knorpelabbau im IL-1β-behandelten miniJoint reduzierte (Abbildung 6B). Wir untersuchten auch vier weitere potenzielle DMOADs durch "intraartikuläre Verabreichung" (Abbildung 6A). Die Ergebnisse der real-time PCR zeigten, dass diese vier Verbindungen in der Lage waren, den Knorpelverlust teilweise rückgängig zu machen (Abbildung 6C).
Abbildung 6: Erprobung von Medikamenten über "systemische" und "intraartikuläre" Wege im etablierten Krankheitsmodell. (A) Schematische Darstellung der beiden verschiedenen Verabreichungswege, einschließlich der "systemischen Verabreichung" von Naproxen (NPX) und der "intraartikulären Verabreichung" von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 18 (FGF18), SM04690, Sclerostin (SOST) und IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1RN). (B) Safranin O- und MMP-13-Färbebilder, die eine gelinderte OC-C-Degeneration nach NPX-Behandlung zeigen. Maßstabsbalken = 50 μm. (C) Genexpression im OC-C nach der "intraartikulären Verabreichung" von vier verschiedenen Medikamenten. Die statistischen Unterschiede zwischen jeder medikamentös behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe werden durch * p < 0,05 angegeben; ** p < 0,01; S . < 0,001; und **** p < 0,0001. Die Daten wurden mit dem Student's t-Test (N = 4 biologische Replikate) analysiert. Reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Li et al.7. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll zur Herstellung eines Kniegelenk-on-a-Chip-Systems vor, bei dem Knochen, Knorpel, Fettgewebe und synoviumähnliches Gewebe aus MSCs gebildet und in einem maßgeschneiderten Bioreaktor kokultiviert werden. Dieses aus menschlichen Zellen bestehende Mehrkomponentensystem mit Plug-and-Play-Funktionen stellt ein neues Werkzeug für die Untersuchung der Pathogenese von Gelenkerkrankungen und die Entwicklung von Medikamenten dar.
Da unterschiedliche Gewebe bestimmte Nährmedien bevorzugen, ist es wichtig, für jedes Gewebe das jeweilige Medium bereitzustellen und den Austausch des freien Mediums zwischen den Strömen zu verhindern. Insbesondere bei der Bildung von biphasischem osteochondralem Gewebe wird das Schicksal naiver MSCs durch das Medium bestimmt, dem sie ausgesetzt sind. Im aktuellen Design verwenden wir ein Hydrogel auf Gelatinebasis als Gerüst, das eine Vorlage für das Zellwachstum bietet und den potenziellen Spalt zwischen dem Gewebe und den Wänden der Einsätze abdichtet. Daher ist es wichtig, das Gel in situ innerhalb der Einsätze zu photovernetzen. Darüber hinaus werden Wachstumsfaktoren wie BMP7 und TGFβ3 im osteogenen Medium bzw. im chondrogenen Medium ergänzt. Um ihre Bioaktivität mehrere Tage lang aufrechtzuerhalten, müssen die frischen Medien außerhalb des Inkubators aufbewahrt werden, bevor sie in die Chipkultur eingeführt werden. Daher müssen wir Spritzen verwenden, um das Medium aus den Reservoirs zu entnehmen, anstatt das Medium im Inkubator zu infundieren.
Ein weiterer kritischer Punkt beim Umgang mit dem Bioreaktor ist die Vermeidung von unnötigem Druck. Das Gewebe ist auf die physikalische Bindung an die Einsatzwand angewiesen, um in Position zu bleiben. Da sie den oberen und unteren Mediumströmen ausgesetzt sind, kann eine Phase des Flusses, die einen höheren Druck aufweist, das Gewebe aus den Einsätzen drücken, was zu Undichtigkeiten führt. Daher ist bei den Handhabungsprozessen, wie z. B. beim Entfernen von Blasen, ein sanfter Druck auf die Spritze entscheidend. Wenn das Hydrogel-Gerüst herausgedrückt wird, kann es wieder eingesetzt werden, zusätzliches nicht ausgehärtetes Hydrogel kann aufgetragen werden, um den Spalt zu füllen, und es kann ausgehärtet werden, was einen sicheren und festen Sitz des Gerüsts innerhalb des Einsatzes ermöglicht.
Aufgrund ihrer nachgewiesenen Biokompatibilität werden Gerüste auf Gelatinebasis verwendet, um alle vier Gewebe im aktuellen System herzustellen. Es ist zu beachten, dass Gelatine möglicherweise nicht das beste Material zur Unterstützung der Gewebebildung darstellt. Daher können bei Bedarf auch andere Gerüsttypen für den Einsatz angepasst werden. Zum Beispiel kann man ein poröses und steifes Gerüst verwenden und es mit Gelatine kombinieren, um die MSC-Osteogenese weiter zu verbessern11. In diesem Fall muss sichergestellt werden, dass es keinen freien Mediumwechsel zwischen dem oberen und dem unteren Durchfluss gibt. Wie oben besprochen, kann man biokompatible Hydrogele verwenden, um die potenziellen undichten Stellen abzudichten. Darüber hinaus werden MSCs im aktuellen Gewebechip verwendet. Aufgrund ihres nachgewiesenen Differenzierungspotenzials in muskuloskelettales Gewebe können induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) in Zukunft auch als Ersatz für MS-Zellen eingesetzt werden. Als ersten Schritt zu dieser Untersuchung haben wir kürzlich iPS-Zellen verwendet, um osteochondrales Gewebe zu erzeugen12.
Eine Synovialentzündung oder Synovitis ist ein Hauptmerkmal von Arthrose und vielen anderen Gelenkerkrankungen. Darüber hinaus fanden Atukorala et al. heraus, dass Synovitis ein starker Prädiktor für eine spätere röntgenologische OA ist13. Daher haben wir eine OFS-Entzündung durch IL-1β-Behandlung induziert, um OA-ähnliche Merkmale im miniJoint zu erzeugen. Wir sind uns jedoch bewusst, dass diese Methode der Krankheitsinduktion nicht alle Facetten der Arthrose erfassen kann. Daher werden wir in unserer zukünftigen Forschung alternative Ansätze zur Modellierung von Arthrose im miniJoint erforschen, indem wir beispielsweise hyperphysiologische Belastung nutzen, um eine mechanische Verletzung der Knorpelkomponente14 zu induzieren. Um eine mechanische Belastung aufzubringen, ist die Anpassung des miniJoint-Designs erforderlich. Beispielsweise kann die Unterseite des miniJoint-Chips potenziell modifiziert werden, um das Knorpelgewebe für die Impaktorspitze einer kundenspezifischen federbelasteten Schlagvorrichtung zugänglich zu machen, die in unserem Labor entwickelt wurde15.
Unseres Wissens nach ist das hier beschriebene Kniegelenk-on-a-Chip das erste In-vitro-Modell , das mehrere Gewebe in einem System vereint, um ein Synovialgelenk zu simulieren. Die neuartige Plug-and-Play-Fähigkeit ermöglicht es, die Rolle eines einzelnen Gewebes für das Fortschreiten der Krankheit und sein Ansprechen auf verschiedene Behandlungen zu untersuchen. Dieses System kann auch zur Modellierung anderer Gelenkerkrankungen als Arthrose eingesetzt werden. So können beispielsweise Bakterien und andere Krankheitserreger in das SM eingeschleust werden, um eine septische Arthritis zu modellieren16. Darüber hinaus ermöglicht das Design ein Echtzeit-Übersprechen zwischen den Geweben, wodurch die Einschränkungen bei der Verwendung des konditionierten Mediums überwunden werden. Insbesondere Fett-, Synovial- und Knorpelgewebe können über das gemeinsame Medium kommunizieren, und Knochen und Knorpel können durch direkte physische Bindung interagieren. Es gibt jedoch einige Einschränkungen für den aktuellen miniJoint. Zunächst werden aus Stammzellen gewonnene Gewebe verwendet, und ob ihr Phänotyp und ihre Funktion ihren Gegenstücken im nativen Kniegelenk ähneln, muss weiter untersucht werden. Zweitens sind Immunzellen wie Makrophagen, die eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von Arthrose spielen, nicht enthalten. Unsere frühere Studie hat gezeigt, dass es möglich ist, Makrophagen in Gelatinegerüsteeinzubinden 17. Schließlich ist ein physikalischer Belastungsmechanismus nicht enthalten, um die mechanische Belastung des Gewebes im nativen Kniegelenk zu simulieren. Kürzlich entwickelten Occhetta et al. ein Knorpel-on-a-Chip-Modell, bei dem dehnungskontrollierte Kompression angewendet wurde, um das künstlich hergestellte Knorpelgewebe zu stimulieren14. Eine ähnliche Methode kann angewendet werden, um eine mechanische Belastung im miniJoint zu ermöglichen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das miniJoint als einzigartige Plattform dienen kann, um die Pathogenese von Arthrose und verwandten Erkrankungen in vitro zu untersuchen und einen Mechanismus zur Erforschung potenzieller DMOADs und Interventionen für die personalisierte Medizin bereitzustellen. Das miniJoint-System kann auch in OoCs integriert werden, die andere Organe nachahmen, um Body-on-a-Chip-Systeme zu etablieren, mit denen die Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Organnachahmungen untersucht werden können.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde in erster Linie durch Mittel der National Institutes of Health (UG3/UH3TR002136, UG3/UH3TR003090) unterstützt. Darüber hinaus danken wir Dr. Paul Manner (University of Washington) für die Bereitstellung der menschlichen Gewebeproben und Dr. Jian Tan für ihre Hilfe bei der Isolierung der MSCs und der Erstellung des Zellpools.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma -Aldrich | I17018-1G | |
| 6 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351146 | |
| 24 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351147 | |
| 30 mL syringes | BD Syringe Luer Lock Cascade Health | 302832 | |
| Alcian blue stain | EK Industries | 1198 | 1% w/v, pH 1.0 |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491-015 | |
| αMEM | Gibco | 12571-063 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Biopsy punch | Integra Miltex | 12-460-407 | |
| BODIPY® fluorophore | Molecular Probes | ||
| Bone morphogenic protein 7 (BMP7) | Peprotech | ||
| Curved forceps | Fisher Brand | 16100110 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium |
| Dexmethasome | Sigma -Aldrich | 02-05-2002 | |
| E-Shell 450 photopolymer in | EnvisionTec | RES-01-4022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini-Bio Products | 900-208 | |
| GlutaMAX | Gibco | 3505-061 | |
| gelatin from bovine skin | Hyclone | 1003372809 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma -Aldrich | SH30588.02 | |
| indomethacin | Sigma -Aldrich | I7378-56 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS) | Gibco | 51500-056 | |
| interleukin 1β | Peprotech | 200-01B | |
| Leur-loc connectors | Cole-Parmer Instruments | 45508-50 | |
| L-proline | Sigma -Aldrich | 115388-93-7 | |
| β-glycerophosphate | Sigma -Aldrich | 1003129352 | |
| Medium bags | KiYATEC | FC045 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma -Aldrich | 102378580 | |
| Phosphate buffered Saline | Corning | 21-040-CM | |
| Pointed forceps | Fisher Brand | 12000122 | |
| Silicon mold | McMaster-Carr | RC00114P | |
| Silicon o-rings | McMaster-Carr | ZMCCs1X5 | 1mm x 5mm |
| SolidWorks | Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France | ||
| Surgical Blades | Integra Miltex | 4-122 | |
| Syringe pump | Lagato210P, KD Scientific | Z569631 | 10 syringe racks |
| T-182 tissue culture flasks | Fisher Brand | FB012939 | |
| Tissue Culture Dish 150 mm | Fisher Brand | FB012925 | |
| Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3) | Peprotech | 100-36E | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| UV Flashlight | KBS | KB70109 | 395 nm |
| Vida Desktop 3D Printer | EnvisionTec | ||
| Vitamin D3 | Sigma -Aldrich | 32222-06-3 | 1,25-dihydroxyvitamin D3 |
References
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