Summary
Proporcionamos métodos detallados para generar cuatro tipos de tejidos a partir de células madre mesenquimales humanas, que se utilizan para recapitular el cartílago, el hueso, la almohadilla de grasa y la membrana sinovial en la articulación de la rodilla humana. Estos cuatro tejidos se integran en un biorreactor personalizado y se conectan a través de microfluídica, generando así una articulación de rodilla en un chip.
Abstract
La alta prevalencia de enfermedades articulares debilitantes como la osteoartritis (OA) plantea una alta carga socioeconómica. Actualmente, los medicamentos disponibles que se dirigen a los trastornos articulares son en su mayoría paliativos. La necesidad insatisfecha de fármacos eficaces modificadores de la enfermedad (DMOAD) ha sido causada principalmente por la ausencia de modelos apropiados para estudiar los mecanismos de la enfermedad y probar los DMOAD potenciales. Aquí, describimos el establecimiento de un sistema microfisiológico en miniatura que imita la articulación sinovial (miniJoint) que comprende componentes de tejido adiposo, fibroso y osteocondral derivados de células madre mesenquimales humanas (MSC). Para obtener los microtejidos tridimensionales (3D), las MSC se encapsularon en gelatina metacrilatada fotoreticulable antes o después de la diferenciación. Las construcciones de tejido cargadas de células se integraron en un biorreactor impreso en 3D, formando el miniJoint. Se introdujeron flujos separados de medios osteogénicos, fibrogénicos y adipogénicos para mantener los fenotipos tisulares respectivos. Se perfundió una corriente comúnmente compartida a través del cartílago, los tejidos sinoviales y adiposos para permitir la diafonía del tejido. Este patrón de flujo permite la inducción de perturbaciones en uno o más de los componentes del tejido para estudios mecanicistas. Además, los DMOAD potenciales pueden probarse a través de la "administración sistémica" a través de todos los flujos del medio o la "administración intraarticular" agregando los medicamentos solo al flujo compartido de simulación de "líquido sinovial". Por lo tanto, el miniJoint puede servir como una plataforma in vitro versátil para estudiar de manera eficiente los mecanismos de la enfermedad y probar medicamentos en medicina personalizada.
Introduction
Las enfermedades articulares como la osteoartritis (OA) son altamente prevalentes y debilitantes y representan una de las principales causas de discapacidad en todo el mundo1. Se estima que solo en los Estados Unidos, la OA afecta a 27 millones de pacientes y ocurre en el 12.1% de los adultos de 60 años o más de2. Desafortunadamente, la mayoría de los medicamentos utilizados actualmente para controlar las enfermedades articulares son paliativos, y no hay medicamentos eficaces modificadores de la enfermedad (DMOA) disponibles3. Esta necesidad médica no satisfecha se deriva principalmente de la ausencia de un modelo eficaz para estudiar los mecanismos de la enfermedad y desarrollar posibles DMOAD. El cultivo celular bidimensional convencional (2D) no refleja la naturaleza 3D de los tejidos articulares, y el cultivo de explantes tisulares a menudo se ve obstaculizado por una muerte celular significativa y generalmente no logra replicar las interconexiones tisulares dinámicas4. Además, las diferencias genéticas y anatómicas reducen significativamente la relevancia fisiológica de los modelos animales4.
Los órganos en chips (OoC), o sistemas microfisiológicos, son un campo de investigación prometedor en la interfaz de la ingeniería, la biología y la medicina. Estas plataformas in vitro son unidades funcionales mínimas que replican características sanas o patológicas definidas de sus contrapartes in vivo 5. Además, estos sistemas miniaturizados pueden albergar diversas células y matrices y simular las interacciones biofísicas y bioquímicas entre diferentes tejidos. Por lo tanto, un sistema microfisiológico que pueda recapitular fielmente la articulación sinovial nativa promete ofrecer una plataforma efectiva para modelar enfermedades articulares y desarrollar posibles DMOAD.
Las células madre mesenquimales humanas (MSC) pueden aislarse de muchos tejidos en todo el cuerpo y diferenciarse en linajes osteogénicos, condrogénicos y adipogénicos6. Las MSC se han utilizado con éxito para diseñar diversos tejidos, incluidos el hueso, el cartílago y el tejido adiposo6, lo que significa que representan una fuente celular prometedora para la ingeniería de los componentes tisulares de la articulación de la rodilla. Recientemente desarrollamos un sistema microfisiológico en miniatura que imita las articulaciones, llamado miniJoint, que comprende hueso, cartílago, fibroso y tejido adiposo derivado de MSC7. En particular, el novedoso diseño permite la diafonía del tejido por flujo microfluídico o permeación (Figura 1). Aquí, presentamos los protocolos para la fabricación de los componentes del chip, la ingeniería de los componentes del tejido, el cultivo de los tejidos diseñados en el chip y la colección de tejidos para análisis posteriores.
Figura 1: Esquema del chip miniJoint que muestra la disposición de los diferentes componentes tisulares y flujos del medio. OC = tejido osteocondral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
El siguiente protocolo sigue las pautas éticas de la Universidad de Pittsburgh y el comité de ética de investigación humana de la Universidad de Pittsburgh. La información sobre los materiales utilizados en este estudio se enumera en la Tabla de materiales.
1. Fabricación de biorreactores impresos en 3D
- Utilice un software informático para diseñar biorreactores osteocondrales (Figura 2A) y miniJoint (Figura 2B) que incluyan cámaras, insertos y tapas. La información de dimensión de cada pieza se muestra en la figura S1.
- Transfiera el diseño a una impresora 3D e imprima con una tinta de fotopolímero.
- Enjuague las piezas impresas en 3D (Figura 2C-F) con 15 ml de etanol al 95% tres veces. Luego, entrecruza completamente las piezas impresas durante 200 s en un dispositivo de polimerización de linterna.
- Agregue juntas tóricas a los insertos y tapas (Figura 2C, D) y compruebe si las piezas encajan (Figura 2G, H).
Figura 2: Fabricación de los diferentes componentes para hacer el biorreactor miniJoint. (A,B), modelos 3D de biorreactores para crear chips (A) osteocondrales y (B) miniJoint. (C,D) tapas (C) impresas en 3D (C) e insertos (D) con la junta tórica instalada. (E,F) cámaras impresas en 3D para (E) cultivo de tejido osteocondral y (F) minijoint. (G,H) Montaje de chips (G) osteocondrales y (H) miniJoint chips. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Ingeniería de los componentes del tejido
NOTA: Los procesos para la fabricación de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilofinato de litio (LAP) y gelatina metacrilada (GelMA) están descritos en estudios previos 8,9.
- Para crear GelMA, siga los pasos a continuación.
- Añadir 17 g de gelatina tipo B a 500 ml de agua destilada, y luego mezclar en una coctelera durante 30 minutos a 37 °C.
- A continuación, añadir 13 ml de anhídrido metacrílico, colocar de nuevo en el agitador a 37 °C y dejar agitar durante la noche.
- Al día siguiente, alícuota el GelMA en bolsas de diálisis individuales, con ~60 ml en cada bolsa.
- Coloque todas las bolsas de diálisis en agua destilada con una barra de agitación y espere 7 días de diálisis. Cambie el agua varias veces al día y deje las bolsas a 4 °C durante la noche.
- El día 7, congelar el GelMA a -80 °C. Una vez completamente congelado, proceder a la liofilización.
- Coloque el GelMA en un plato en la cámara de vacío de un liofilizador y permita la liofilización. Asegúrese de que el GelMA esté completamente seco antes de retirarlo del liofilizador.
- Disuelva el GelMA en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS con Ca 2+ y Mg2+) al 15% (p/v). Para asegurarse de que el pH esté en 7.4, agregue NaOH en pequeñas cantidades hasta que el pH alcance 7.4. Complementar la solución con 1x antibiótico-antimicótico y LAP al 0,15% (p/v) en función del volumen adquirido. Guarde la solución de GelMA al 15% a -20 °C hasta su uso y protéjala de la luz.
- Coloque las cámaras, tapas e inserciones de biorreactores de doble flujo impresas en 3D en bolsas de autoclave, y autoclave a 121 °C durante 20 min con vapor y luego durante 20 min con calor seco.
- Dentro del gabinete de seguridad biológica, remoje las cámaras, tapas e insertos del biorreactor en 15 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato durante la noche, después de lo cual deje que se sequen.
- Aislar las MSC derivadas de la médula ósea humana de los desechos quirúrgicos totales de artroplastia articular con la aprobación del IRB (Universidad de Pittsburgh y Universidad de Washington).
- Específicamente, elimine la médula ósea del hueso trabecular del cuello y la cabeza femoral, y vuelva a suspenderla en el Medio de Águila Modificada de Dulbecco (DMEM).
- Filtrar la suspensión a través de un filtro de 40 μm y centrifugar el flujo a 300 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante, resuspenda los gránulos utilizando un medio de crecimiento [DMEM, suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1x antibiótico-antimicótico], y luego colóquelos en matraces de cultivo de tejidos.
- Cambie el medio de cultivo cada 3 días a 4 días. Asegúrese de que se alcance una confluencia del 70% al 80% antes de continuar.
- Separar las células incubando con tripsina-EDTA durante 2-3 min, y pasar en una proporción de 1 millón de células por matraz T150.
- Expanda las celdas a P5. Después de la tripsinización, suspender las células, contarlas y luego granular centrifugando a 300x g durante 5 min.
- Con una pipeta de 1.000 μL, resuspender las células a 20 x 106 células/ml en una solución de GelMA al 15%.
NOTA: Apague la luz del armario de seguridad biológica. - Con guantes estériles, presione un molde de silicona estéril y seco contra una placa de Petri. Luego, coloque un inserto en cada orificio del molde de silicona con pinzas, con el lado del orificio del inserto hacia abajo.
- Con una pipeta de 200 μL, agregue la suspensión celular para llenar el inserto (~ 50 μL por inserto).
- Utilice una linterna UV (luz LED con una longitud de onda de 395 nm) para entrecruzar la parte superior del gel/inserto durante 1,5 min. Luego, ilumine el otro lado durante 30 s. La reticulación ocurre cuando el fotoiniciador LAP se expone a la luz UV.
NOTA: La suspensión celular puede mantenerse en la incubadora durante este período o protegida de la luz. - Con fórceps estériles, transfiera inmediatamente los insertos a 8 ml de medio de crecimiento en una placa de 6 pocillos sin cultivo tisular (DMEM suplementado con 10% [v / v] FBS y 1x antibiótico-antimicótico) para permitir que las células se recuperen durante la noche.
- Diferenciar las células hacia cuatro linajes.
- Para diseñar tejido adiposo (AT), transfiera los insertos a 8 mL de medio adipogénico (AM; Alfa-MEM, 10% FBS, 0,2 mM de indometacina, 1x insulina-transferrina-selenio (ITS), 0,45 mM 3-isobutil-1-metilxantina, 0,1 μM dexametasona y 1x antibiótico-antimicótico) para iniciar la diferenciación. Idealmente, se colocan cuatro insertos en un solo pocillo de una placa de pozo de cultivo no tisular con 8 mL de medio adipogénico. Cultive las células en las placas del pozo durante 28 días, con cambios medios cada dos días.
- Para diseñar las unidades osteocondrales (OC), coloque los insertos en cámaras de biorreactores de doble flujo, tape los pocillos e infunda las dos corrientes por separado a un caudal de 5 μL / min con 35 ml de medio osteogénico (OM; DMEM, 10% FBS, 1x antibiótico-antimicótico, 0.1 μM dexametasona, 0.01 M β-glicerofosfato, 100 ng/mL proteína morfogénica ósea 7 (BMP7), 50 μg/mL de ácido ascórbico y 10 nM vitamina D3) y 35 mL de medio condrogénico (CM; DMEM, 1x antibiótico-antimicótico, 1x ITS, 0,1 μM dexametasona, 40 μg/ml de prolina, 50 μg/ml de ácido ascórbico y 10 ng/ml de factor de crecimiento transformante β3)10. Mantener la diferenciación celular durante 28 días realizando cambios quincenales de medio.
- Para derivar los fibroblastos, diferenciar las MSC en cultivo 2D durante 21 días en un matraz de cultivo tisular T150 cm2 utilizando 20 mL de medio fibrogénico (FM; DMEM avanzado, 5% FBS, 1x GlutaMAX, 1x antibiótico-antimicótico y 50 μg/mL de ácido ascórbico). Cambia el medio cada semana. Use 4 ml de tripsina para separar las células y encapsule los geles 3D dentro de los insertos, siguiendo el protocolo descrito anteriormente, para obtener tejido fibroso similar sinovial (SFT).
NOTA: Las composiciones de todos los medios de diferenciación se pueden encontrar en la Tabla 1.
3. Establecimiento del chip miniJoint
- Autoclave las cámaras de biorreactor 3D miniJoint, tubos de silicona con un diámetro interior de 0.062 pulgadas y un diámetro exterior de 0.125 pulgadas, y conectores Luer-lock F 1/16. Conecte el tubo de silicona a la púa del biorreactor miniJoint en un extremo y conecte el bloqueo Luer en el otro extremo.
- Prepare el AM, OM (eliminando BMP7) y FMCM mencionados en el paso 2.11. Además, prepare el medio común compartido (SM; DMEM libre de rojo de fenol, 1x antibiótico-antimicótico, 1x Na-piruvato, 1x ITS, 40 μg/ml de prolina, 50 μg/ml de ácido ascórbico y 0,5 ng/ml de factor de crecimiento transformante β3) que se utilizará para el cultivo de miniJoint. Cargue 35 mL de cada medio en los reservorios medianos.
- Utilice pinzas rectas para transferir la unidad osteocondral del biorreactor de doble flujo al pocillo derecho del biorreactor miniJoint. Transfiera el inserto de tejido adiposo y el inserto de tejido fibroso a los pocillos izquierdo y medio, respectivamente. Tapa todos los pozos con tapas esterilizadas.
- Conecte las entradas del chip miniJoint a los depósitos medianos y las salidas a las jeringas (Figura 3A-C).
- Monte las jeringas en una bomba de jeringa (Figura 3C) y transfiera la bomba y los chips a una incubadora. Los depósitos medianos se mantienen en hielo fuera de la incubadora.
- Opere la bomba en el modo de extracción, extrayendo el medio del depósito del medio a la cámara del biorreactor miniJoint. Este proceso de cultivo miniJoint dura 28 días.
- Para modelar la inflamación articular y la degeneración del cartílago, agregue interleucina 1β (IL-1β) a la corriente del medio fibrogénico a 10 ng / ml. Reemplace las jeringas al tercer día de tratamiento con IL-1β y proporcione IL-1β fresca al medio fibrogénico. El tratamiento dura 7 días.
- Durante la etapa de prueba de drogas, después de 3 días de tratamiento con IL-1β, administrar el medicamento en el medio compartido, simulando una "administración intraarticular" (Figura 3D) cuando el medicamento se usa localmente en la articulación de la rodilla, o en todos los tipos de medios, simulando una "administración sistémica" (Figura 3E) cuando el medicamento actúa sobre la articulación de la rodilla a través de la circulación.
- Recolectar tejidos individuales para su análisis después de 7 días de tratamiento con IL-1β, independientemente de si las muestras se sometieron o no a tratamiento farmacológico durante los 4 días anteriores.
Figura 3: Montaje de la miniJoint. (A,B) Los medios específicos de tejido se introducen desde las entradas 1-3 (I1-3) y se mueven desde las salidas 1-3 (O1-3). El medio compartido se perfunde de I4 a O4. (C) La configuración completa de la cultura miniJoint. Los fármacos (formas verdes parecidas al sol) pueden introducirse en (D) el medio compartido solamente o (E) todos los medios para simular respectivamente "administración intraarticular" o "administración sistémica". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Recolección individual de tejidos
- Use pinzas curvas estériles para retirar los insertos.
- Empuje un punzón de biopsia a través del centro del inserto para extraer el gel y coloque el gel en PBS.
- Cortar los geles osteocondrales por la mitad al evaluar la expresión génica.
NOTA: Dado que el gel osteocondral consta de dos tipos de tejidos, es importante separar las células osteogénicas y condrogénicas. - Recolectar los medios y tejidos acondicionados para varios experimentos.
- Recoja alrededor de 1,5 ml de cada fuente mediana.
- Congelar rápidamente el medio acondicionado en nitrógeno líquido después de centrifugar a 14.000 x g durante 10 minutos y desechar el sedimento.
- Para la tinción histológica y la inmunotinción, primero fijar las muestras de AO y SFT en formalina tamponada al 10%, deshidratarlas en etanol de concentraciones ascendentes, limpiarlas en xileno, incrustarlas en parafina y, finalmente, seccionarlas a un espesor de 6 μm.
- Para los microtejidos AT, fijar las muestras en formalina tamponada al 10% y teñirlas directamente con solución Oil Red O o BODIPY.
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Representative Results
Todos los tejidos de la miniJoint fueron recolectados para analizar sus fenotipos después de 28 días de cultivo en la miniJoint (Figura 4A). Esto se ha detallado en nuestra publicación anterior7.
Mediante el uso de RT-qPCR, inmunotinción y tinción histológica, se confirmó que los fenotipos específicos de tejido estaban bien mantenidos para los microtejidos individuales (Figura 4). Por ejemplo, el componente óseo de los microtejidos OC (OC-O), pero no los otros componentes tisulares, expresaron altos niveles de osteocalcina (OCN). Por el contrario, en la porción de cartílago de los tejidos osteocondrales (OC-C), el colágeno tipo II (COL2) y el agrecano (ACAN) se expresaron a niveles significativamente más altos que en los otros tejidos (Figura 4B). Los niveles de expresión de adiponectina (ADIPOQ) y leptina (LEP), dos genes adipogénicos representativos, fueron mucho más altos en el AT que en los otros tejidos. La deposición de minerales de calcio (Figura 4F, G), así como fosfatasa alcalina (ALP) y proteínas OCN (Figura 4D) se observó principalmente en el OC-O, y el OC-C mostró glicosaminoglicanos (GAG) bien retenidos (Figura 4C) y COL2 (Figura 4D). Además, se encontró que la expresión de dos marcadores asociados a la hipertrofia de condrocitos, colágeno tipo X (COL10) y erizo indio (IHH), que se detectaron en el OC-C el día 28, estaba significativamente regulada a la baja después de 28 días de cultivo en la miniarticulación (Figura 4E).
Los resultados de RT-qPCR, inmunotinción e histología confirmaron que los fenotipos de TA y SFT se mantuvieron con éxito después de 4 semanas de minicultivo conjunto (Figura 4B, H, I). Usando la tinción BODIPY y la tinción Oil Red O, observamos abundante deposición de gotas lipídicas en el AT (Figura 4H). Las imágenes de tinción de inmunofluorescencia en la Figura 4I muestran una expresión robusta de lubricina y cadherina 11 (CDH11) por el SFT después de 4 semanas de cultivo miniJoint.
En combinación, estos resultados indican la creación de un modelo funcional de articulación sinovial multitisular en el sistema miniJoint.
Figura 4: Mantenimiento de los fenotipos tisulares individuales de los microtejidos después de 4 semanas de cocultivo en el chip miniJoint. (A) Línea de tiempo de generación de un chip miniJoint normal con los fenotipos específicos de tejido mantenidos. (B) Resultados de RT-qPCR que muestran genes marcadores clave en todos los componentes del tejido. Los datos OCN se normalizaron a los valores en el OC-O, los datos COL2 y ACAN a los valores en el OC-C, los datos ADIPOQ y LEP a los valores en el AT, y los datos TNC y COL1 a los valores en el SFT. Los datos fueron analizados por ANOVA unidireccional (N = 3 réplicas biológicas). * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. (C) Tinción Safranin O de la unidad bifásica OC. Barra de escala = 1 mm. (D) Imágenes histológicas de tinción e inmunotinción que confirman la presencia de marcadores específicos del hueso y del cartílago en los componentes correspondientes de la unidad de AO. Barra de escala = 50 μm. (E) Inmunotinción que muestra una expresión mucho menor de dos marcadores de hipertrofia, COLX e IHH, en el OC-C el día 56 que en el día 28. Barra de escala = 50 μm. (F) Tinción de rojo alizarina de la unidad OC que muestra la presencia de depósitos de calcio principalmente en el OC-O. Barra de escala = 500 μm. (G) Vistas ampliadas de la imagen de tinción de Alizarin Red en (F). Barra de escala = 200 μm. (H) Imágenes de tinción Oil Red O y BODIPY que muestran la retención de gotas de lípidos en el AT. Barra de escala = 50 μm. (I) Imágenes de inmunotinción que muestran la expresión de lubricina y CDH11 por el tejido fibroso de tipo sinovial (SFT). Barra de escala = 50 μm. Reproducido con permiso de Li et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para crear un modelo de enfermedad, la interleucina 1β (IL-1β) se introdujo en la corriente FM después de 28 días de cocultivo (Figura 5A, B). El tratamiento con IL-1β dio lugar a apoptosis celular y niveles elevados de MMP-13 en el SFT (Figura 5C). Curiosamente, observamos degradación del cartílago en la miniJoint tratada con IL-1β (Figura 5D), lo que sugiere la aparición de diafonía entre el OC-C y el SFT.
Figura 5: Modelado de la inflamación y degeneración articular en la miniarticulación . (A) Esquema que muestra la inducción de "sinovitis" mediante la impugnación de la SFT con IL-1β. (B) Cronograma de establecimiento y análisis del modelo de enfermedad. (C) ensayo TUNEL e inmunotinción MMP-13 que muestre los cambios patológicos en el SFT. La fragmentación del ADN está indicada por las puntas de flecha rojas. Barra de escala = 50 μm. (D) Imágenes de tinción de Safranin O e inmunotinción MMP-13 que muestran la degeneración del OC-C. Barra de escala = 50 μm. Reproducido con permiso de Li et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Por último, probamos la eficacia terapéutica del naproxeno (NPX) a través de la "administración sistémica" (Figura 6A), que demostró reducir la degradación del cartílago en la miniarticulación tratada con IL-1β (Figura 6B). También examinamos otros cuatro DMOAD potenciales a través de la "administración intraarticular" (Figura 6A). Los resultados de la PCR en tiempo real indicaron que estos cuatro compuestos fueron capaces de revertir parcialmente la pérdida de cartílago (Figura 6C).
Figura 6: Prueba de fármacos por vía "sistémica" e "intraarticular" en el modelo de enfermedad establecido. (A) Esquema que muestra las dos vías diferentes de administración de fármacos, incluida la "administración sistémica" de naproxeno (NPX) y la "administración intraarticular" del factor de crecimiento de fibroblastos 18 (FGF18), SM04690, esclerostina (SOST) y antagonista del receptor de IL-1 (IL-1RN). (B) Imágenes de tinción de Safranin O y MMP-13 que muestran la degeneración de OC-C aliviada después del tratamiento con NPX. Barra de escala = 50 μm. (C) Expresión génica en el OC-C después de la "administración intraarticular" de cuatro fármacos diferentes. Las diferencias estadísticas entre cada grupo tratado con fármaco y el grupo control se indican mediante * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; y **** p < 0.0001. Los datos fueron analizados por la prueba t de Student (N = 4 réplicas biológicas). Reproducido con permiso de Li et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este artículo, presentamos un protocolo para crear un sistema de articulación de rodilla en un chip, en el que el hueso, el cartílago, el tejido adiposo y los tejidos similares a la membrana sinovial se forman a partir de MSC y se cocultivan dentro de un biorreactor personalizado. Este sistema multicomponente derivado de células humanas con características plug-and-play representa una nueva herramienta para estudiar la patogénesis de las enfermedades articulares y desarrollar fármacos.
Dado que los diferentes tejidos favorecen medios de cultivo específicos, es fundamental proporcionar el medio respectivo para cada tejido y evitar el intercambio de medio libre entre flujos. En particular, durante la generación de tejidos osteocondrales bifásicos, el destino de las MSC ingenuas está determinado por el medio al que están expuestas. En el diseño actual, utilizamos un hidrogel a base de gelatina como andamio, que proporciona una plantilla para el crecimiento celular y sella la brecha potencial entre los tejidos y las paredes de los insertos. Por lo tanto, es fundamental fotocruzar in situ el gel dentro de los insertos. Además, los factores de crecimiento como BMP7 y TGFβ3 se complementan en el medio osteogénico y el medio condrogénico, respectivamente. Para mantener sus bioactividades durante varios días, los medios frescos deben mantenerse fuera de la incubadora antes de ser introducidos en el cultivo de chips. Por lo tanto, necesitamos usar jeringas para retirar los medios de los depósitos en lugar de infundir los medios en la incubadora.
Otro punto crítico al manejar el biorreactor es evitar la presión innecesaria. Los tejidos dependen de la unión física a la pared de inserción para permanecer en posición. Dado que están expuestos a los flujos medios superior e inferior, si una fase del flujo tiene una presión más alta, puede empujar los tejidos fuera de los insertos, lo que resulta en fugas. Por lo tanto, durante los procesos de manipulación, como cuando se eliminan las burbujas, es fundamental un suave empuje de la jeringa. Si el andamio de hidrogel se empuja hacia afuera, se puede volver a colocar, se puede aplicar hidrogel sin curar adicional para llenar el espacio y se puede curar, lo que permite un ajuste seguro y firme del andamio dentro del inserto.
Dada su probada biocompatibilidad, se utilizan andamios a base de gelatina para crear los cuatro tejidos en el sistema actual. Cabe señalar que la gelatina puede no representar el mejor material para apoyar la formación de tejidos. Por lo tanto, si es necesario, se pueden adaptar otros tipos de andamios para su uso. Por ejemplo, se puede usar un andamio poroso y rígido y combinarlo con gelatina para mejorar aún más la osteogénesis MSC11. En este caso, uno debe asegurarse de que no haya un cambio de medio libre entre los flujos superior e inferior. Como se mencionó anteriormente, se pueden usar hidrogeles biocompatibles para sellar los posibles puntos de fuga. Además, las MSC se utilizan en el chip de tejido actual. Dado su potencial de diferenciación demostrado en tejidos musculoesqueléticos, las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) también se pueden usar en el futuro para reemplazar las MSC. Como primer paso hacia esta investigación, recientemente hemos utilizado iPSCs para crear tejidos osteocondrales12.
La inflamación de la membrana sinovial, o sinovitis, es una característica clave de la OA y muchas otras enfermedades articulares. Además, Atukorala et al. encontraron que la sinovitis es un fuerte predictor de OA radiográfica posterior13. Por lo tanto, indujimos la inflamación SFT mediante el tratamiento con IL-1β para generar características similares a la OA en la miniJoint. Sin embargo, somos conscientes de que este método de inducción de la enfermedad no puede capturar todas las facetas de la OA. Por lo tanto, en nuestra investigación futura, exploraremos enfoques alternativos para modelar la OA en la miniarticulación, por ejemplo, utilizando carga hiperfisiológica para inducir lesiones mecánicas del componente del cartílago14. Para aplicar la carga mecánica, será necesaria la adaptación del diseño miniJoint. Por ejemplo, la parte inferior del chip miniJoint puede modificarse potencialmente para que el tejido del cartílago sea accesible a la punta del impactador de un dispositivo de impacto personalizado con resorte desarrollado en nuestro laboratorio15.
Hasta donde sabemos, la articulación de rodilla en un chip descrita aquí es el primer modelo in vitro que incluye múltiples tejidos dentro de un sistema para simular una articulación sinovial. La novedosa capacidad plug-and-play permite investigar el papel de un solo tejido en la progresión de la enfermedad y su respuesta a diversos tratamientos. Este sistema también se puede emplear para modelar enfermedades articulares distintas de la OA. Por ejemplo, las bacterias y otros patógenos pueden ser introducidos en el SM para modelar la artritis séptica16. Además, el diseño permite la diafonía en tiempo real entre los tejidos, superando así la limitación de utilizar el medio acondicionado. Específicamente, los tejidos adiposos, sinoviales y cartilaginosos pueden comunicarse a través del medio compartido, y el hueso y el cartílago pueden interactuar a través de la unión física directa. Sin embargo, existen algunas limitaciones para el miniJoint actual. En primer lugar, se utilizan tejidos derivados de células madre, y si su fenotipo y función se parecen a sus homólogos en la articulación nativa de la rodilla necesita más investigación. En segundo lugar, las células inmunes como los macrófagos, que desempeñan un papel crítico en la patogénesis de la OA, no están incluidas. Nuestro estudio previo ha demostrado la viabilidad de incluir macrófagos en andamios de gelatina17. Por último, no se incluye un mecanismo habilitado para el estrés físico para simular la carga mecánica en los tejidos de la articulación nativa de la rodilla. Recientemente, Occhetta et al. desarrollaron un modelo de cartílago en un chip, en el que se aplicó compresión controlada por tensión para estimular el tejido cartilaginoso diseñado14. Se puede adoptar un método similar para permitir la carga mecánica en el miniJoint.
En resumen, la miniJoint puede servir como una plataforma única para investigar la patogénesis de la OA y las condiciones relacionadas in vitro y proporcionar un mecanismo para explorar posibles DMOAD e intervenciones para la medicina personalizada. El sistema miniJoint también se puede integrar con OoCs que imitan otros órganos para establecer sistemas body-on-a-chip que se pueden usar para estudiar las interacciones entre varios imitadores de órganos.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada principalmente por fondos de los Institutos Nacionales de Salud (UG3 / UH3TR002136, UG3 / UH3TR003090). Además, agradecemos al Dr. Paul Manner (Universidad de Washington) por proporcionar las muestras de tejido humano y al Dr. Jian Tan por su ayuda para aislar las MSC y crear el grupo celular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma -Aldrich | I17018-1G | |
| 6 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351146 | |
| 24 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351147 | |
| 30 mL syringes | BD Syringe Luer Lock Cascade Health | 302832 | |
| Alcian blue stain | EK Industries | 1198 | 1% w/v, pH 1.0 |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491-015 | |
| αMEM | Gibco | 12571-063 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Biopsy punch | Integra Miltex | 12-460-407 | |
| BODIPY® fluorophore | Molecular Probes | ||
| Bone morphogenic protein 7 (BMP7) | Peprotech | ||
| Curved forceps | Fisher Brand | 16100110 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium |
| Dexmethasome | Sigma -Aldrich | 02-05-2002 | |
| E-Shell 450 photopolymer in | EnvisionTec | RES-01-4022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini-Bio Products | 900-208 | |
| GlutaMAX | Gibco | 3505-061 | |
| gelatin from bovine skin | Hyclone | 1003372809 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma -Aldrich | SH30588.02 | |
| indomethacin | Sigma -Aldrich | I7378-56 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS) | Gibco | 51500-056 | |
| interleukin 1β | Peprotech | 200-01B | |
| Leur-loc connectors | Cole-Parmer Instruments | 45508-50 | |
| L-proline | Sigma -Aldrich | 115388-93-7 | |
| β-glycerophosphate | Sigma -Aldrich | 1003129352 | |
| Medium bags | KiYATEC | FC045 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma -Aldrich | 102378580 | |
| Phosphate buffered Saline | Corning | 21-040-CM | |
| Pointed forceps | Fisher Brand | 12000122 | |
| Silicon mold | McMaster-Carr | RC00114P | |
| Silicon o-rings | McMaster-Carr | ZMCCs1X5 | 1mm x 5mm |
| SolidWorks | Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France | ||
| Surgical Blades | Integra Miltex | 4-122 | |
| Syringe pump | Lagato210P, KD Scientific | Z569631 | 10 syringe racks |
| T-182 tissue culture flasks | Fisher Brand | FB012939 | |
| Tissue Culture Dish 150 mm | Fisher Brand | FB012925 | |
| Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3) | Peprotech | 100-36E | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| UV Flashlight | KBS | KB70109 | 395 nm |
| Vida Desktop 3D Printer | EnvisionTec | ||
| Vitamin D3 | Sigma -Aldrich | 32222-06-3 | 1,25-dihydroxyvitamin D3 |
References
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