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Methodenartikel

Abschätzung der thermischen Schädigung durch robotergebohrte Kraniotomie bei der kranialen Fensterchirurgie bei Mäusen

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DOI:

10.3791/64188

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11. November 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 2Advanced Platform Technology Center, Louis Stokes Cleveland VA Medical Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Schädelfenster sind zu einer allgegenwärtig eingesetzten Operationstechnik geworden, um eine intravitale Bildgebung bei transgenen Mäusen zu ermöglichen. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines chirurgischen Roboters, der halbautomatische Knochenbohrungen von Schädelfenstern durchführt und dazu beitragen kann, die Variabilität von Chirurg zu Chirurg zu verringern und die Schädigung der thermischen Blut-Hirn-Schranke teilweise zu mildern.

Zusammenfassung

Die Schädelfensterchirurgie ermöglicht die Bildgebung von Hirngewebe bei lebenden Mäusen unter Verwendung von Multiphotonen oder anderen intravitalen Bildgebungsverfahren. Bei der Durchführung einer Kraniotomie von Hand kommt es jedoch häufig zu einer thermischen Schädigung des Hirngewebes, die von Natur aus von Chirurgie zu Operation variiert und von der Technik des einzelnen Chirurgen abhängen kann. Die Implementierung eines chirurgischen Roboters kann die Chirurgie standardisieren und zu einer Verringerung der mit der Operation verbundenen thermischen Schäden führen. In dieser Studie wurden drei Methoden des Roboterbohrens getestet, um thermische Schäden zu bewerten: horizontal, Punkt für Punkt und gepulst Punkt für Punkt. Beim Horizontalbohren wird ein kontinuierliches Bohrschema verwendet, während bei Punkt-für-Punkt-Bohrungen mehrere Löcher gebohrt werden, die das Schädelfenster umfassen. Die gepulste Punkt-für-Punkt-Bohrung fügt ein Bohrschema "2 s an, 2 s aus" hinzu, um eine Abkühlung zwischen den Bohrungen zu ermöglichen. Die Fluoreszenzbildgebung des intravenös injizierten Farbstoffs Evans Blue (EB) misst die Schädigung des Hirngewebes, während ein Thermoelement, das unter der Bohrstelle platziert ist, die thermische Schädigung misst. Die Thermoelementergebnisse deuten auf eine signifikante Abnahme der Temperaturänderung in der gepulsten Punkt-für-Punkt-Gruppe (6,90 °C ± 1,35 °C) im Vergleich zu den horizontalen (16,66 °C ± 2,08 °C) und Punkt-für-Punkt-Gruppen (18,69 °C ± 1,75 °C) hin. In ähnlicher Weise zeigte auch die gepulste Punkt-für-Punkt-Gruppe nach der kranialen Fensterbohrung im Vergleich zur horizontalen Methode eine signifikant geringere EB-Präsenz, was auf eine geringere Schädigung der Blutgefäße im Gehirn hinweist. Daher scheint ein gepulstes Punkt-für-Punkt-Bohrverfahren das optimale Schema zur Reduzierung thermischer Schäden zu sein. Ein Roboterbohrer ist ein nützliches Werkzeug, um das Training und die Variabilität zu minimieren und thermische Schäden zu reduzieren. Mit dem zunehmenden Einsatz von Multiphotonen-Bildgebung in Forschungslaboren ist es wichtig, die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu verbessern. Die hier angesprochenen Methoden werden dazu beitragen, andere darüber zu informieren, wie diese chirurgischen Roboter besser eingesetzt werden können, um das Feld weiter voranzubringen.

Einleitung

Schädelfenster sind in den Neurowissenschaften, der Neurotechnik und der Biologie allgegenwärtig geworden, um eine direkte Visualisierung und Bildgebung des Kortex bei lebenden Tieren zu ermöglichen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Die leistungsstarke Kombination aus transgenen Mäusen und Multiphotonen-Bildgebung hat äußerst wertvolle Einblicke in die Schaltkreisaktivität und andere biologische Erkenntnisse im In-vivo-Gehirn geliefert 12,13,14,15,16,17,18. Miniaturmikroskope, die am Schädel montiert sind, haben diese Möglichkeiten weiter erweitert, um Aufnahmen bei wachen, sich frei bewegenden Tieren zu ermöglichen19. Der Prozess der Herstellung eines Schädelfensters erfordert ein Power-Drilling, um den Schädelknochen zu verdünnen oder vollständig zu entfernen, um Kraniotomien zu erzeugen, die groß genug sind, um ein transparentes Stück Glas über dem Kortex zu befestigen20. Polydimethylsiloxan (PDMS) und andere Polymere wurden ebenfalls als Schädelfenstermaterialien getestet 9,21. Letztendlich ist das ideale kraniale Fenster eines, das die normale endogene Aktivität darunter nicht verändert oder stört. Es ist jedoch allgemein anerkannt, dass das Bohren von Schädelfenstern das darunter liegende Gewebe verschlimmert, was zu einer Schädigung des Gehirns, einer Störung der Umgebung und einer Beeinträchtigung der Hirnhäute bis zu dem Punkt führt, an dem die Abbildungstiefe von Multiphotonen verdecktwird 22. Die daraus resultierende Neuroinflammation hat ein breites Spektrum an Auswirkungen, die von der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke (BHS) bis hin zur Aktivierung und Rekrutierung von Gliazellen um die Implantatstelle reichen23. Daher ist die Charakterisierung sichererer und reproduzierbarerer Schädelfensterbohrmethoden von entscheidender Bedeutung für eine gleichbleibende Bildqualität und die Reduzierung von Störfaktoren.

Während darauf geachtet wird, das Trauma des darunter liegenden Gewebes zu minimieren, hat das Bohren des Knochens das Potenzial, sowohl thermische als auch mechanische Störungen des Gehirns zu verursachen24,25. Ein mechanisches Trauma durch versehentliches Eindringen des Bohrers in die Dura kann darüber hinaus zu unterschiedlich starken kortikalen Verletzungen führen24. In einer Studie von Shoffstall et al.25 führte die Hitze des Knochenbohrens zu einer erhöhten BHS-Permeabilität, was durch das Vorhandensein des Farbstoffs Evans Blue (EB) im Hirnparenchymangezeigt wurde 25. Intravenös injizierter EB-Farbstoff bindet an zirkulierendes Albumin im Blutkreislauf und überquert daher normalerweise nicht in nennenswerten Konzentrationen eine gesunde BHS. Aus diesem Grund wird der EB-Farbstoff häufig als empfindlicher Marker für die BBB-Permeabilitätverwendet 26,27. Während ihre Studie den Einfluss der BHS-Permeabilität auf nachfolgende biologische Folgeerkrankungen nicht direkt gemessen hat, haben frühere Studien die BHS-Permeabilität mit einer erhöhten neuroinflammatorischen Reaktion auf chronisch implantierte Mikroelektroden und Veränderungen der motorischen Funktion korreliert28.

Abhängig von den Zielen der Studie kann das Ausmaß der thermischen und mechanischen Schädigung eine Quelle für experimentelle Fehler darstellen, die sich negativ auf die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Studie auswirken. Es gibt Dutzende von zitierten Methoden zur Herstellung von Schädelfenstern, die jeweils unterschiedliche Bohrgeräte, Geschwindigkeiten, Techniken und Benutzer verwenden 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 berichteten, dass die beobachtete Variation der Erwärmungsergebnisse auf die Variabilität der vom Bohrer ausgeübten Kraft, der Vorschubgeschwindigkeit und des Anwendungswinkels zurückgeführt wurde, neben anderen Aspekten, die beim Bohren von Hand nicht kontrolliert werden können 25. Es wird angenommen, dass automatisierte Bohrsysteme und andere stereotaktische Geräte die Reproduzierbarkeit und die Konsistenz der Ergebnisse verbessern können, aber veröffentlichte Methodenstudien haben die Temperatur oder die BHS-Permeabilität als eines der Ergebnisse nicht rigoros bewertet. Daher besteht ein Bedarf an reproduzierbareren und konsequent angewandten Methoden zur Herstellung von Schädelfenstern sowie an Methoden, die rigoros angewendet werden, um die Auswirkungen von Schädelfensterbohrungen auf das darunter liegende Nervengewebe zu bewerten.

Der Fokus dieser Studie liegt auf der Ermittlung und Entwicklung konsistenter und sicherer Bohrmethoden für Schädelfenster. Die Größe der Kraniotomie bei der Installation von Schädelfenstern ist deutlich größer als bei Standard-Kraniotomien für mikroelektroden, die dem Gehirn implantiert werden. Solche Kraniotomien können nicht mit einem einzigen Bohrloch durchgeführt werden, wenn Standardgeräte verwendet werden, was zu einer größeren Variabilität der Technik zwischen den Chirurgen führt, wenn sie von Hand durchgeführt werden20. Chirurgische Bohrroboter wurden in der Praxis eingeführt, aber nicht weit verbreitet 1,6,29. Die Automatisierung des Bohrens bietet Kontrolle über Variablen, die zur beobachteten Variation von Versuch zu Versuch beitragen, was darauf hindeutet, dass der Einsatz der Geräte inter- und intrachirurgische Effekte reduzieren kann. Dies ist von besonderem Interesse, wenn man bedenkt, dass die größere Kraniotomie, die für die Platzierung des Schädelfensters erforderlich ist, zusätzlich schwierig ist. Während man davon ausgehen könnte, dass die Steuerung durch die Automatisierung des Bohrens klare Vorteile mit sich bringt, wurde die Implementierung dieser Geräte bisher kaum bewertet. Obwohl keine sichtbaren Läsionen beobachtet wurden5, ist der Test mit höherer Sensitivität mit EB erwünscht.

Hier wird die BHS-Permeabilität mit einem handelsüblichen chirurgischen Bohrroboter mit entsprechender Software gemessen, die die Programmierung stereotaktischer Koordinaten, die Kraniotomieplanung/-kartierung und eine Auswahl von Bohrstilen ("Punkt-für-Punkt" vs. "horizontal") in Bezug auf den gerouteten Weg des Bohrmeißels ermöglicht. Zunächst werden acht "Seed"-Punkte gebohrt (Abbildung 1A), die das Schädelfenster umreißen. Von hier aus wird der Raum zwischen den Samen entweder mit der "Punkt-für-Punkt"- oder "horizontalen" Drillmethode ausgeschnitten. "Punkt-für-Punkt" führt vertikale Pilotlochschnitte durch (ähnlich wie bei einer CNC-Bohrmaschine), während "horizontal" horizontale Schnitte entlang des Umfangs des Schädelfensters ausführt, die das Loch umreißen (ähnlich wie bei einem CNC-Fräser). Das Ergebnis für beide Methoden ist ein Stück Schädel, das entfernt werden kann, um das Schädelfenster freizulegen. Um Schäden durch Bohrungen zu vermeiden, wird das Schädelfenster nicht physisch entfernt, um zusätzliche Schäden zu vermeiden. Eine Kombination aus EB-Farbstoff in Verbindung mit Fluoreszenzbildgebung wird verwendet, um die BHS-Permeabilität nach der Durchführung von Kraniotomien bei Mäusen zu messen, und ein eingesetztes Thermoelement wird verwendet, um die Temperatur der Gehirnoberfläche während des Bohrens direkt zu messen (Abbildung 1B, C). Frühere Beobachtungen deuteten darauf hin, dass das gepulste Ein- und Ausschalten des Bohrens mit Intervallen von 2 s ausreicht, um die Erwärmung des Bohrers25 zu verringern, und daher in den experimentellen Ansatz für den Operationsroboter einbezogen wird.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, Methoden zur Beurteilung thermischer Schäden durch Kraniotomiebohrungen zu demonstrieren. Während die Methoden im Kontext des automatisierten Bohrens vorgestellt werden, können solche Methoden auch auf manuelle Bohrschemata angewendet werden. Diese Methoden können verwendet werden, um die Verwendung von Geräten und/oder Bohrschemata zu validieren, bevor sie als Standardverfahren übernommen werden.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der experimentellen Pipeline. Schematische Darstellung des Prozesses, dem die Tiere nach dem kranialen Fensterverfahren zur EB-Quantifizierung unterzogen wurden. (A) Schematischer Aufbau der Maus mit dem stereotaktischen Rahmen und dem chirurgischen Roboterbohrer. Ein Beispiel für ein kraniales Fenster ist über dem motorischen Kortex mit Startpunkten (grün) und Kantenpunkten (blau) dargestellt. (B) Der Perfusionsaufbau umfasst die Injektion von 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in das gesamte Tier, um Blut zu entfernen, gefolgt von der Extraktion des Gehirns. (C) Das Gehirn wird dann in die Kammer des EB-Fluoreszenzbildgebungssystems gegeben, um eine Fluoreszenzbildgebung mit dem Farbstoff Evans Blue durchzuführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Protokoll

Alle Verfahren und Tierpflegepraktiken wurden vom Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee überprüft, genehmigt und durchgeführt.

1. Einrichtung der Hardware des Operationsroboters

  1. Befolgen Sie vor der Operation das Handbuch und die Anleitung des Operationsroboters (siehe Materialtabelle), um die Hardware und Software einzurichten. Führen Sie die Rahmenkalibrierung wie im Handbuch beschrieben durch. Wenn der Bohrer oder der Rahmen verschoben wird, wird empfohlen, den Bohrer neu zu kalibrieren, um die Genauigkeit zu gewährleisten.

2. Vorbereitung der Software

  1. Navigieren Sie zur chirurgischen Software (siehe Materialtabelle) und erstellen Sie ein neues Projekt, indem Sie Mit einem sauberen Projekt beginnen auswählen. Legen Sie das Motiv oben als Maus fest, um die zu verwendenden Bohrkoordinaten festzulegen.
  2. Wählen Sie Neues Projekt starten aus.
  3. Klicken Sie von hier aus in der unteren linken Ecke auf Planung , um zum Bildschirm für die Bohrkoordinatenplanung zu navigieren. Erstellen Sie das Bohrschema für die durchzuführende Schädelfenstertechnik.
    1. Klicken Sie dazu auf eine beliebige Stelle im stereotaktischen Atlas. Verwenden Sie Bregma als Referenz und geben Sie die folgenden Koordinaten für den motorischen Kortex ein: AP = 1,50, ML = 1,25, DV = 0,00. Drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur, um die ausgewählten Koordinaten zu aktualisieren.
      HINWEIS: Die dorsal-ventralen (DV) Koordinaten geben die Bohrtiefe an und benötigen daher hier keine Eingabe.
    2. Klicken Sie auf Ziel speichern, um diese Koordinaten zu speichern und einen geeigneten Namen einzugeben. Klicken Sie von hier aus auf die Schaltfläche Verschieben unten links, um zurück zum Hauptbohrbildschirm zu navigieren.
  4. Klicken Sie auf Extras > Projekt > Speichern unter , um dieses Vorlagenprojekt für spätere Projekte wiederzuverwenden. Dadurch werden die Bohrkoordinaten automatisch für die spätere Verwendung gespeichert.

3. Vorbereitung auf die Operation

  1. PrismPlus-Mäuse30,31 (siehe Materialtabelle) werden in einer Isoflurankammer anästhesiert (3,5 % in 1,5 l/minO2). Tragen Sie Augengleitmittel auf, um das Austrocknen der Augen zu verhindern, rasieren Sie den Kopf mit einer Haarschneidemaschine und schneiden Sie die Nägel, um zu verhindern, dass die Mäuse die Nähte herauskratzen.
    HINWEIS: PrismPlus-Mäuse sind eine Art transgener fluoreszierender Spezies, die in der Multiphotonen-Bildgebung verwendet wird. Den heterozygoten PrismPlus-Mäusen fehlen die fluoreszierenden Gene und sie wurden daher hier verwendet, um tierische Ausscheidungen aus anderen laufenden Studien zu reduzieren, da es in dieser Studie keine Multiphotonen-Bildgebung gibt. Es wird erwartet, dass Wildtyp-Mäuse ähnliche Ergebnisse zeigen.
  2. Verabreichen Sie den anästhesierten Mäusen subkutane Injektionen mit dem Antibiotikum Cefazolin (24 mg/kg), dem Analgetikum Carprofen (5 mg/kg) und Buprenorphin (0,05-0,10 mg/kg). Verabreichen Sie vor jedem Schnitt eine einzelne subkutane Injektion von Marcaine (0,25 %, 100 μl) unterhalb der Einschnittstelle (1 Zoll entlang der Mittellinie des Schädels, beginnend hinter den Augen).
    HINWEIS: Die hier verwendeten Medikamente folgen den zuvor festgelegten IACUC-Protokollen. Es wird jedoch empfohlen, EMLA-Creme als topisches Anästhetikum für eine multimodale Wirkung vor der Operation und der Schwanzveneninjektion sowie Meloxicam SR anstelle von Carprofen in Betracht zu ziehen. EMLA und Meloxicam SR können vor der Isofluran-Anästhesie verabreicht werden.
  3. Montieren Sie das Tier mit den mitgelieferten Ohrbügeln auf dem stereotaktischen Rahmen des Operationsroboters und halten Sie die Anästhesie mit 0,5%-2%igem Isofluran durch Inhalation durch einen Nasenkegel aufrecht.
  4. Stellen Sie sicher, dass die Anästhesietiefe von einem geschulten Tiertechniker oder -personal genau überwacht wird, basierend auf der Reaktionsfähigkeit der Maus, der Atmung (~55-65 Atemzüge/min), der Herzfrequenz (300-450 Schläge pro Minute) und der Farbe (rosa). Schnurrbart und regelmäßiges Zehenkneifen können auch als Maß verwendet werden, um die Narkosetiefe zu bestimmen. Die Werte der Vitalwerte werden durch die institutionellen Vorschriften der IACUC bestimmt.
  5. Halten Sie die Körpertemperatur des Tieres auf einem zirkulierenden Wasserkissen aufrecht und überwachen Sie die Vitalwerte mit einem Blutsauerstoff- und Herzfrequenzmesssystem.
  6. Schrubben Sie den Operationsbereich zur Sterilisation mit Chlorhexidingluconat (CHG) und 70% Isopropanol. Um die Sterilität während der Operation zu erhalten, legen Sie eine sterile Plastikfolie über die Maus und den stereotaktischen Rahmen.
    HINWEIS: Obwohl diese Protokolle für Überlebensoperationen entwickelt wurden, spiegeln die präsentierten Daten die Verwendung von Nicht-Überlebenstieren wider, da der Schwerpunkt darauf lag, die geeigneten Bohrprotokollmethoden zu testen und zu bestimmen.

4. Schädelpräparation

  1. Führen Sie mit einer Skalpellklinge einen 1-Zoll-Schnitt an der Mittellinie des Schädels durch, beginnend im hinteren Teil der Augen.
  2. Ziehen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen, und verwenden Sie (optional) Retraktoren, um das Operationsfenster zu erhalten. Entfernen Sie alle Gewebe- und Membranreste mit sterilen Applikatoren mit Wattespitze.
  3. Trocknen und reinigen Sie den Schädel mit 3%igem Wasserstoffperoxid mit Applikatoren mit Wattespitze.
    HINWEIS: Dadurch werden die Nähte des Schädels sichtbar. Bregma und Lambda sollten leicht zu erkennen sein. Wenn nicht, tragen Sie mehr Wasserstoffperoxid auf oder vergrößern Sie den Einschnitt.
  4. Ermöglichen Sie die "Auto-Stopp"-Funktion, indem Sie das Krokodilklemmenkabel vom Bohraufbau des Operationsroboters gemäß den Empfehlungen des Herstellers an die Maus anschließen. "Auto-Stop" funktioniert, indem es eine Impedanzänderung erkennt, d. h. sobald der Bohrer mit Liquor cerebrospinalis (CSF) anstelle von Knochen in Kontakt kommt, stoppt der Bohrer das Bohren und verhindert so Schäden am Gehirn.

5. Injektion der Evans Blue Schwanzvene

ACHTUNG: EB ist möglicherweise krebserregend. Verwenden Sie bei der Handhabung Handschuhe.

  1. Um den Schwanz für eine einfache Injektion vorzubereiten, wischen Sie ihn mit einem Alkoholtuch ab. Optional kann Wintergrünöl topisch aufgetragen werden, um die Venezu erweitern 35.
  2. Fassen Sie den Schwanz mit einer Hand, während Sie mit der anderen Hand die Spritze mit EB handhaben. Beugen Sie mit Daumen und Zeigefinger den Schwanz, um die Schwanzvene über der Schwanzbiegung freizulegen. Führen Sie die Spritze (1 oder 2 ml, 30 g Insulinspritze) parallel zur Vene ein und injizieren Sie langsam das Volumen EB. EB (4 Gew.-%) wird in einer Konzentration von 2 ml/kg Körpergewicht über eine Schwanzveneninjektion verabreicht.
    Anmerkungen: Wenn die Nadel richtig eingeführt ist, ist ein minimaler bis gar kein Widerstand beim Fließen von der Spritze in den Schwanz zu spüren. Wenn es einen Widerstand gibt oder EB-Farbstoff im Schwanz erscheint, bewegen Sie sich auf dem Schwanz nach unten und versuchen Sie es erneut.
  3. Warten Sie nach der Injektion 5 Minuten, damit EB in der Maus zirkulieren kann, bevor Sie mit dem Bohren beginnen. Die erfolgreiche Injektion wird sofort bestätigt, wenn sich die Extremitäten und das Operationsfenster der Maus blau färben.

6. Chirurgisches Roboterbohrverfahren

  1. Sobald der Schädel für das Bohren vorbereitet ist, navigieren Sie zurück zur chirurgischen Software. Öffnen Sie das in Schritt 2.4 definierte Vorlagenprojekt, in dem die Koordinaten für die Bohrung festgelegt wurden.
    1. Folgen Sie Tools > Projekt > neuer > Wählen Sie ein Vorlagenprojekt aus, und wählen Sie das Vorlagenprojekt aus, das in Schritt 2 (Softwarevorbereitung) festgelegt wurde.
    2. Wählen Sie Gleiche Protokollelemente > Planung (Zielpunkte) > Bohrparameter aus, um sie auf dieses neue Projekt zu übertragen.
    3. Klicken Sie auf Neues Projekt starten.
  2. Korrigieren Sie als Nächstes die Übung und den Rahmen, um die Neigung und Skalierung des Mausschädels des aktuellen Tieres zu berücksichtigen. Klicken Sie auf Extras und wählen Sie Korrigieren für Neigung und Skalierung... , um den Korrekturbildschirm zu öffnen. Stellen Sie am oberen Bildschirmrand sicher, dass der Bohrer aktiv ist (nicht die Spritze), indem Sie auf die hellrote Schaltfläche Bohren klicken.
    HINWEIS: Nach der Aktivierung wird die Drill-Taste dunkel-/hellrot. Der Spritzenknopf kann ignoriert werden, da dieser in diesem Protokoll nicht verwendet wird.
    1. Korrigieren Sie zunächst die Skala, die Tonhöhe und das Gieren, indem Sie festlegen, wo sich Bregma und Lambda auf dem aktuellen Tier befinden. Verwenden Sie entweder die Tastatursteuerung oder die Steuerelemente auf dem Bildschirm, um den Bohrer zu bewegen. Sobald sich der Bohrer über Bremma befindet, senken Sie ihn ab, bis er gerade den Schädel berührt, und klicken Sie auf Bregma einstellen. Wiederholen Sie dies für Lambda.
    2. Passen Sie als Nächstes die spezifische Rolle des Schädels an. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zum Mittelpunkt gehen , um den Bohrer automatisch an die Mitte des Schädels anzupassen. Klicken Sie 2 mm nach links und senken Sie dann den Bohrer langsam ab, bis Sie den Schädel berühren. Klicken Sie auf Linkspunkt setzen.
    3. Wiederholen Sie Schritt 6.2.2 für die rechte Gehirnhälfte. Jetzt ist das System für diesen speziellen Schädel eingerichtet.
      HINWEIS: Die Korrektur ist hier von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass die Bohrkoordinaten und die Bohrtiefe korrekt sind. Die Maus muss so gerade wie möglich montiert werden, um die Notwendigkeit einer Korrektur so weit wie möglich zu reduzieren. Wenn große Korrekturen erforderlich sind, kann dies zu einer schlechten Bohrgenauigkeit führen.
  3. Nachdem die Korrektur durchgeführt wurde, verlassen Sie das Korrekturfenster, indem Sie auf Schließen in der unteren Mitte des Bildschirms. Navigieren Sie zum Bohrbildschirm, indem Sie auf Werkzeuge und wählen Sie dann Bohrer... , um den Bohrvorgang zu starten.
    1. Stellen Sie sicher, dass Kraniotomie-Form aus dem Dropdown-Menü Bohren am oberen Bildschirmrand ausgewählt ist. Klicken Sie dann auf Bohrmittelpunkt und -form auswählen und wählen Sie das vordefinierte Ziel aus, das in Schritt 2.3.1 benannt wurde. Wählen Sie auf diesem Bildschirm Kreis als Form für das Ziel aus und geben Sie 2,60 mm als Durchmesser2 des Kreises ein. Klicken Sie auf Anzeigen.
      Anmerkungen: Der Durchmesser des kranialen Fensters wird mit der Mitte des Bohrers als Mittelpunkt der Ausgangspunkte erstellt. Ein kleiner Bohrer (Durchmesser = 0,6 mm oder die vom Hersteller empfohlene Bitgröße) wird verwendet, um den zusätzlichen Durchmesser zu minimieren, der durch die Verwendung eines größeren Bohrers entsteht. Speziell für den Operationsroboter kommen spezielle Bohrer zum Einsatz. Die acht Startpunkte und Kantenpunkte werden nun auf dem Schädel als grüne bzw. blaue Punkte angezeigt.
    2. Klicken Sie auf das Hauptfenster und verwenden Sie die Tastenkombination Strg + Umschalt + D , um das Menü " Bohrpunkte" auf der rechten Seite des Bildschirms aufzurufen. Dies ermöglicht die Anzeige bestimmter Bohrpunkttiefen und -status.
    3. Bevor Sie mit der Bohrung beginnen, passen Sie bei Bedarf die Auto-Stopp-Funktion an, indem Sie auf die Schaltfläche neben dem Kontrollkästchen Auto-Stop klicken. Diese Schaltfläche ist standardmäßig auf Mittel eingestellt, was der Empfindlichkeit für die Auto-Stopp-Funktion entspricht.
      HINWEIS: Dies kann vorher getestet werden, um die richtige Empfindlichkeit für die Tiere zu finden. Bei diesem Protokoll wurde die höchste Empfindlichkeit verwendet, um ein minimales Bohren durch das Gehirn zu gewährleisten.
    4. Sobald die Auto-Stop-Funktion aktiviert und angepasst ist, beginnen Sie mit dem Bohren des Startpunkts. Klicken Sie auf Automatischer Scan , damit die Bohrung automatisch bei Seed 1 beginnt. Sobald der Bohrer den Liquor berührt, erkennt die Auto-Stop-Funktion eine Impedanzänderung, was zu einem Stopp des Bohrens und einem Zurückziehen des Bohrers aus dem Schädel führt.
    5. Behalten Sie die Bohrung genau im Auge, falls der automatische Stopp keine Veränderungen erkennt. Die Escape-Taste kann gedrückt werden, um das Bohren manuell abzubrechen. Der rosafarbene Kreis am unteren Rand des Drill-Menüs und rechts neben den Impedanzwerten kann ebenfalls angeklickt werden, um das Drillen zu starten oder zu stoppen.
      HINWEIS: Der Bohrer bohrt automatisch bis zu einer Tiefe, die der geschätzten Schädeldicke entspricht (oder bis die Auto-Stop-Funktion aktiviert ist).
    6. Wenn der automatische Stopp nicht aktiviert ist, bevor die geschätzte Tiefe erreicht ist, wird ein Bildschirm angezeigt, in dem der Benutzer aufgefordert wird: 1) weiter zu bohren und # mm weiter abzusenken, 2) in der aktuellen Tiefe zu markieren und fortzufahren, 3) den aktuellen Punkt zu überspringen und fortzufahren oder 4) den Vorgang zu stoppen (kann später fortgesetzt werden). Wählen Sie eine der unten beschriebenen Optionen aus.
      1. Geben Sie für Weiter bohren und absenken # mm weiter einen Abstand ein, in dem der Bohrer vorrücken soll. Standardmäßig wird 0,1 mm verwendet. Ein kleinerer Abstand kann vorgeschlagen werden, um ein versehentliches Eindringen in das Gehirn zu verhindern.
      2. Wenn angenommen wird, dass die Dura auf diesem Bildschirm erreicht wurde, wählen Sie die Option In aktueller Tiefe markieren und fortfahren , damit das System die Dura in dieser Tiefe markiert und mit dem nächsten Startwert fortfährt.
      3. Verwenden Sie den aktuellen Punkt überspringen und fortfahren und den Vorgang stoppen (kann später fortgesetzt werden), um Fehler zu beheben oder den Bohrer zu reinigen und zurückzukehren, sobald der automatische Stopp wieder funktioniert.
    7. Wenn alle Saatpunkte gebohrt wurden und einige nicht mit der Auto-Stop-Funktion fertiggestellt wurden, überprüfen Sie die Tiefe des Lochs manuell mit einem Dura-Pick. Dadurch wird sichergestellt, dass die Bohrtiefe durch den Schädel gedrungen ist.
    8. Bevor Sie mit dem Kantenpunktbohren beginnen, entscheiden Sie, welche Art von "Kantenschnitt" gewünscht wird, indem Sie das Dropdown-Menü neben dem Text " Kantenschnitt " im Menü "Bohren" auswählen. Die beiden Optionen sind Punkt für Punkt und Horizontal.
      1. Wählen Sie Punkt für Punkt aus, um jeden Kantenpunkt einzeln und bis zu einer Tiefe zu bohren, die durch die Tiefe der benachbarten Startpunkte bestimmt wird. Passen Sie die Skalierung bei Bedarf über die Schaltfläche Kantenskalierung... unten an, obwohl die Standardeinstellung Keine Skalierung in der Regel ausreicht.
      2. Wählen Sie Horizontal, um mit dem Bohren an Kantenpunkt 1 zu beginnen, und verwenden Sie eine kontinuierliche Bohrbewegung , um den gesamten Umfang des Bohrkreises zu umrunden. Standardmäßig schneidet der horizontale Schnitt in 100-μm-Intervallen, wobei er den gesamten Umfang des Fensters umrundet, bevor er weitere 100 μm tiefer vorrückt. Ändern Sie bei Bedarf die Intervalltiefe und die Bohrgeschwindigkeit unter der Schaltfläche Schnittoptionen... unten.
      3. Verwenden Sie den automatischen Schnittversatz (unter dem Feld Kantenschnitt ), um die Tiefe des automatischen Schnitts anzupassen, indem Sie einen vordefinierten Versatz von den benachbarten Startpunkten nehmen. In diesem Protokoll wurde ein Auto-Cut-Offset von 20 μm verwendet. Weitere Tests können durchgeführt werden, um einen optimalen Ausgleich pro Tier zu bestimmen.
    9. Nachdem Sie die Einstellungen für den Kantenschnitt festgelegt haben, beginnen Sie mit dem Bohren von Kantenpunkten, indem Sie auf die Schaltfläche Automatischer Schnitt in der Mitte des Bohrmenüs klicken. Beim Punkt-für-Punkt-Bohren ist der Bohrvorgang beendet, sobald die letzte Kante gebohrt wurde. Fahren Sie beim horizontalen Bohren fort, bis genügend Schädel gebohrt wurde, um das Schädelfenster freizugeben.
      Anmerkungen: Obwohl so lange gebohrt wird, bis das Fenster gelöst werden kann, wird das Fenster hier nicht physisch freigegeben, um Schäden am darunter liegenden Gewebe zu vermeiden. Es ist wichtig, den Schaden, der nur durch das Bohren entsteht, zu isolieren, um verschiedene Bohrschemata zu bewerten.
      1. Sobald die horizontale Bohrung die Tiefe eines Startpunkts erreicht hat, klicken Sie im Menü Bohrpunkte mit der rechten Maustaste auf diesen Startpunkt (oder wählen Sie zuerst mehrere Punkte aus), und klicken Sie auf Tiefe sperren. Auf diese Weise kann der horizontale Schnitt fortgesetzt werden, ohne dass dieser Bereich tiefer geschnitten wird (wodurch ein Eindringen in das Gehirn vermieden wird).
        HINWEIS: Wenn es Saatpunkte mit unterschiedlichen Dura-Tiefen gibt, kann dies zu Unterschieden in der Tiefe führen, die für das horizontale Bohrverfahren benötigt wird.
    10. Wenn die Auto-Stop-Funktion nicht richtig funktioniert, stellen Sie sicher, dass der Bohrer vollständig frei von Schmutz oder potenziellem Blut, Kochsalzlösung usw. ist, da diese die Grundimpedanz des Bohrers beeinträchtigen können. Wählen Sie außerdem eine der unten beschriebenen manuellen Bohroptionen für den Fall, dass der automatische Stopp nicht konsistent funktioniert.
      1. Navigieren Sie im Menü "Drill" manuell zu den einzelnen Ausgangswerten, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den Startwert oder die Kante klicken und Gehe zu Eintrag auswählen. Es gibt auch Optionen zum Löschen der markierten Tiefen, zum Zurücksetzen des Lochs und andere Optionen, die den Bohrvorgang unterstützen können.
      2. Steuern Sie den Vorschub der Bohrtiefe manuell, indem Sie eine Tiefe aus der Dropdown-Liste auswählen, die sich neben dem Text Vortrieb: oben im Menü Bohren befindet. Klicken Sie direkt darunter auf die Schaltfläche Vorwärts, um die Übung um den eingestellten Abstand vorzurücken.
        HINWEIS: Diese Funktion kann in Verbindung mit den Schaltflächen "Dura einstellen" und "Oberfläche festlegen" unter der Schaltfläche "Advance" verwendet werden, um dem System manuell mitzuteilen, wo sich sowohl die Oberfläche des Schädels als auch die Oberfläche der Dura befinden. Verwenden Sie nach Möglichkeit die Auto-Stopp-Funktion, aber bei Bedarf reichen auch diese manuellen Optionen aus.
      3. Wenn Sie manuell bohren, seien Sie zwischen den einzelnen Bohrtiefenintervallen vorsichtiger, um sicherzustellen, dass der Bohrer die Dura nicht überschreitet. Überprüfen Sie das Bohrloch zwischen den Tiefenintervallen mit einem Dura-Pick, um zu bestätigen, ob die Dura erreicht wurde. Sobald alle manuellen Aussaaten abgeschlossen sind, setzen Sie den Kantenschnitt wie oben beschrieben normal fort.
    11. Pulse-Methode
      1. Um manuelles Impulsbohren durchzuführen, deaktivieren Sie die Auto-Stopp-Funktion, indem Sie das Kontrollkästchen neben der Option Auto-Stopp im Menü Bohren deaktivieren. Dies muss ausgeschaltet sein, um steuern zu können, wann der Bohrer für das Pulsieren ausgeschaltet ist.
        Anmerkungen: Das Impulsbohren folgt einem Muster von 2 s Bohren, gefolgt von 2 s ohne Bohren, damit der Schädel abkühlen kann.
      2. Wählen Sie im Menü Bohren 100 μm als Bohrtiefenvorschub aus, dies entspricht ~2 s Bohren nach unten.
      3. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Advance , um mit der Bohrung zu beginnen.
        Anmerkungen: Seien Sie bereit, den Bohrer schnell zu stoppen, sobald er um 100 μm vorgerückt ist, da sich der Bohrer in der Tiefe weiter dreht, bis der Austritt gedrückt wird (wodurch unnötige Wärme erzeugt wird).
      4. Sobald der Bohrer 100 μm vorgerückt ist, drücken Sie zweimal die Esc-Taste , um den Bohrer zu stoppen. Wiederholen Sie diesen Zyklus nach 2 s für die Tiefe des Schädels.
        HINWEIS: Aufgrund von Software- und mechanischen Einschränkungen kann nur die Punkt-für-Punkt-Methode mit der gepulsten Methode durchgeführt werden. Kontinuierliches Horizontalbohren kann auf diese Weise nicht durchgeführt werden.
      5. Bohren Sie alle Ausgangs- und Kantenpunkte mit der oben beschriebenen Methode. Stellen Sie sicher, dass Sie Dura über die Schaltfläche im Bohrer-Menü einstellen, sobald die Dura erreicht ist.

7. Perfusion und Gehirnextraktion

  1. Sobald das Bohren der Saat- und Kantenpunkte abgeschlossen ist, halten Sie das Tier für weitere 1 Stunde unter Isofluran-Narkose, damit der EB-Farbstoff zirkulieren und durch die beschädigte BHS extravasieren kann. Führen Sie eine kardiale Perfusion durch, um Blut oder Flüssigkeiten aus den Gefäßen zu entfernen, und entfernen Sie dann das Gehirn für die Bildgebung und Analyse, wie unten beschrieben.
    1. Nach der 1-stündigen EB-Zirkulationsperiode nach der Bildung des Schädelfensters wird dem Tier intraperitoneal ein Cocktail aus Ketamin (160 mg/kg) und Xylazin (20 mg/kg) injiziert. Wenn Sie nicht mehr ansprechen, führen Sie eine Herzperfusion durch.
    2. Schneiden Sie den Bauch der Maus mit einer Schere auf und legen Sie das Herz frei, indem Sie vertikal durch den Brustkorb und horizontal über das Zwerchfell schneiden. Ziehen Sie den Brustkorb zurück, um das Herz klar zu sehen. Führen Sie eine Schmetterlingsnadel in die linke Herzkammer ein und beginnen Sie, 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in den ganzen Körper zu infundieren. Schneiden Sie einen kleinen Teil des rechten Vorhofs des Herzens ab, um den Druckaufbau zu lösen.
    3. Nachdem 25 ml 1x PBS im ganzen Körper durchblutet wurden, stoppen Sie die Perfusion und enthaupten Sie die Maus als sekundäres Mittel der Euthanasie.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die institutionell anerkannte Methode der Euthanasie und/oder Endpunktperfusion durchführen, damit das Tier das Gehirn isolieren kann.
    4. Von hier aus entfernst du das Gehirn aus dem Schädel, indem du den Knochen und das Gewebe mit Rongeuren entfernst.
    5. Stellen Sie das extrahierte Gehirn mit einem fluoreszierenden Bildgebungssystem dar, um die Menge an EB zu beobachten, die sich im Gehirn um die Bohrstellen herum befindet.
      HINWEIS: EB bindet an zirkulierendes Albumin. Wenn eine Gefäßschädigung im Gehirn auftritt, tritt EB aus und bindet sich an das Hirngewebe, was zu einem klaren visuellen Indikator für Schäden führt.

8. Bildgebung und Analyse von Evans Blue

  1. Hardware-Initialisierung
    1. Schalten Sie den Computer ein, der an das EB-Fluoreszenzbildgebungssystem angeschlossen ist, und starten Sie die Bildgebungssoftware (siehe Materialtabelle), während andere Elemente vorbereitet werden. Schalten Sie die Lichtquelle, die Plattform und die Kamera in dieser Reihenfolge ein.
    2. Navigieren Sie zur Bildbearbeitungssoftware und klicken Sie in der Systemsteuerung für die Erfassung auf Initialisieren. Das System und die Kammer signalisieren von Rot auf Grün, sobald die Initialisierung abgeschlossen ist.
      Anmerkungen: Initialisieren Sie das EB-Fluoreszenz-Bildgebungssystem 30 Minuten vor jeder Bildgebung, damit die Temperatur der Lichtquelle optimale Werte erreicht.
  2. Bildgebung des Gehirns
    1. Legen Sie das explantierte Gehirn zur Bildgebung in eine durchsichtige Schale in der Mitte des Tisches.
    2. Passen Sie in der Systemsteuerung für die Aufnahme die Einstellungen für das Bild an. Wählen Sie die Belichtungszeit: 1 s; Binning: Mittel; Blende: F1; Anregung: 535 bis 675 nm; Emission: Cy 5,5; Lampenstand: Hoch; und Sichtfeld: 5 cm. Lassen Sie den Filter gesperrt und die Überlagerung von Fotografie und Fluoreszenz aktiviert. Diese Einstellungen basieren auf früheren Laborerfahrungen und anderen veröffentlichten Methoden zur Bildgebung von EB36.
  3. Laden Sie Bilder des EB-Fluoreszenzbildgebungssystems in eine frei zugängliche Bildverarbeitungssoftware (siehe Materialtabelle) und generieren Sie drei freihändige Regions of Interest (ROIs), um die Fluoreszenzintensität von EB zu ermitteln, indem Sie die mittlere Strahldichte über den Hintergrund, das gesamte Gehirn und das Schädelfenster messen.
    1. Normalisieren Sie die Messungen des Schädelfensters und des gesamten Gehirns im Vergleich zum entsprechenden Hintergrund-ROI.
    2. Jedes Gehirn wird unter verschiedenen Anregungsfiltern (535-675 nm) abgebildet, um die Wellenlänge mit dem höchsten Signal-Rausch-Verhältnis (605 nm wurde gewählt) zwischen den Versuchsgruppen und der Kochsalzkontrolle zu finden.
      1. Isolieren Sie die mittlere Strahldichte unter der entsprechenden Wellenlänge und den Mittelwert, um die durchschnittliche mittlere Strahldichte oder Fluoreszenzintensität für die ROIs des gesamten Gehirns und des Schädelfensters zu erhalten.
  4. Ermitteln und normalisieren Sie die durchschnittliche mittlere Strahldichte über die kraniale Fensterfläche für jede Gruppe im Vergleich zur Kochsalzkontrolle.

9. Bewertung des Thermoelements

  1. Messen Sie die Temperaturänderungen von Schädel und Gehirn mit einem Thermoelement (siehe Materialtabelle) in Kombination mit den drei verschiedenen Bohrschemata. Das Thermoelement ist mit einem Datenerfassungssystem (DAQ) verbunden, mit dem die Messung in MATLAB eingelesen werden kann.
  2. Montieren Sie eine Kadavermaus auf dem stereotaktischen Rahmen und dem Roboterbohrer-Setup. Bohren Sie manuell ein kleines Loch (gleiche Größe wie der Saatpunkt) ~2 mm von der Stelle entfernt, an der das Schädelfenster in die Seite des Schädelsgemacht wird 25. Dieses Loch ermöglicht es, das Thermoelement in die Position zu schieben, unter der das Schädelfenster gebohrt wird (Abbildung 2D).
    Anmerkungen: Kadavermäuse werden verwendet, da die Seite des Schädels aufgebohrt werden muss, um das Thermoelement über den Bohrbereich des Schädelfensters zu schieben. Bei dieser Kadavermaus handelt es sich um ein anderes Tier als dasjenige, das zuvor für die Evans-Blue-Analyse verwendet wurde.
  3. Beginnen Sie den Bohrvorgang für jedes der drei Schemata wie zuvor ausgeführt (Schritt 6). Wenn der Bohrer durch den Schädel geht, kommt es zu Temperaturspitzen, die auf eine Erwärmung in der Nähe des Gehirns hindeuten.
  4. Zeichnen Sie die Ergebnisse in MATLAB auf und zeichnen Sie sie auf, um die maximale Temperaturdifferenz zu berechnen. Dies sollte getrennt für die Saatsaat und die Kantenbohrung erfolgen, um die horizontale vs. Punkt-für-Punkt-Aussaat zusammen mit der gepulsten manuellen Bohrmethode zu bewerten.

10. Statistik

  1. Führen Sie statistische Analysen für Thermoelement- und EB-Fluoreszenzbildgebung in R unter Verwendung eines Kruskal-Wallis-Rangsummentests mit Benjamini-Hochberg-Korrektur durch, gefolgt von paarweisen Vergleichen mit dem Wilcoxon-Rangsummen-Exakttest25.

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Ergebnisse

Thermische Auswertung
Das Potenzial für thermische Schäden wurde bewertet, indem die Temperaturänderung gegenüber der Basislinie aufgrund von Bohrungen mit horizontalen (Abbildung 2A), Punkt-für-Punkt- (Abbildung 2B) und gepulsten Punkt-für-Punkt-Methoden (Abbildung 2C) gemessen wurde. Abbildung 2D zeigt den Versuchsaufbau zur Gewinnung thermischer Daten. Für die thermische Auswertun...

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Diskussion

Die Verwendung von EB-Farbstoff und Bildgebung ist einfach, schnell und nützlich, um Gefäßschäden im Gehirn für neue Methoden und Techniken zu bewerten. Unabhängig davon, ob ein chirurgischer Roboter verwendet wird oder um die Bestätigung von Methoden, die derzeit im Labor durchgeführt werden, ist es wichtig, chirurgische Methoden zu validieren, um die Auswirkungen experimenteller Behandlungen im Vergleich zu chirurgischen Auswirkungen zu isolieren und das Tierwohl zu verbessern. Ein Thermoelement-Setup ist auch nützlich...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu melden. Die Inhalte repräsentieren nicht die Ansichten des US-Ministeriums für Veteranenangelegenheiten, der National Institutes of Health oder der Regierung der Vereinigten Staaten.

Danksagungen

Diese Studie wurde zum Teil durch die Merit Review Awards GRANT12418820 (Capadona) und GRANTI01RX003420 (Shoffstall/Capadona) sowie den Research Career Scientist Award # GRANT12635707 (Capadona) des United States (US) Department of Veterans Affairs Rehabilitation Research and Development Service unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Arbeit teilweise auch vom National Institute of Health, dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke GRANT12635723 (Capadona) und dem National Institute for Biomedical Imaging and Bioengineering, T32EB004314, (Capadona/Kirsch) unterstützt. Dieses Material basiert auf Arbeiten, die durch das Graduiertenforschungsstipendium der National Science Foundation unter der Fördernummer GRANT12635723 unterstützt wurden. Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material geäußert werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
Typ: Reagenz		VWRMRGF-6235für Evans Blue Verdünnung
Aura Software
Typ: Werkzeug		Spectral Instruments ImagingOpen-Access-Bildgebungssoftware für Lumina-Bildgebungssysteme
Buprenorphin
Typ: Medikament		aus Tierhaltung
Hartmetallbohrer, 0,6 mm (Roboterbohrer)
Typ: Werkzeug		Stoelting58640-1
Carprofen
Typ: Arzneimittel		aus der Tierhaltung
Cefazolin
Typ: Arzneimittel		aus der Tierhaltung
Evans Blue Farbstoff
Typ: Reagenz		Millipore SigmaE2129Rekonstituiert in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung
Isofluran
Typ: Medikament		Bezogen aus der Tierhaltung
IVIS Lumina II
Typ: Werkzeug		Perkin ElmerCLS136334IVIS Lumina III derzeit anstelle von Lumina II auf dem Markt
Jenco Linearisierendes Thermometer
Typ: Werkzeug		Jenco765JFFür die Einrichtung von Thermoelementen
Ketamin
Typ: Medikament Bezogen		von der Tierhaltung
LivingImage
Typ: Werkzeug		Perkin ElmerSoftware für IVIS Lumina III
Marcain
Typ: Medikament		aus der Tierhaltung
Neurostar Software
Typ: Werkzeug		StoeltingKommt mit dem Kauf eines chirurgischen Roboters
Physiosuite mit MausSTAT® Pulsoximeter & Herzfrequenzmesser
Typ: Tool		Kent ScientificPS-03Zur Überwachung der Vitalwerte
PrismPlus Mäuse
Typ: Tier		Jackson Labortory031478, RRID:IMSR_JAX:031478, männlich, ~8 Monate altdie Studie verwendete Tiere
Stoelting Drill und Injektionsroboter für motorisierte stereotaktische Instrumente
Typ: Tool		Stoelting58640Hauptroboterbohrer mit stereotaktischem Rahmen
Thermoelement
Typ: Werkzeug		TC Direct206-557Für die Einrichtung von Thermoelementen
USB-6008 Multifunktions-I/O DAQ
Typ: Werkzeug		National InstrumentsUSB-6008Für die Einrichtung von Thermoelementen
Xylazin
Typ: Arzneimittel		aus Tierhaltung
Für

Referenzen

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