Summary
Kraniale vinduer har blitt en allestedsnærværende implementert kirurgisk teknikk for å tillate intravital avbildning i transgene mus. Denne protokollen beskriver bruken av en kirurgisk robot som utfører halvautomatisk beinboring av kraniale vinduer og kan bidra til å redusere variasjonen mellom kirurg og kirurg og delvis redusere termisk blod-hjernebarriereskade.
Abstract
Kranial vinduskirurgi muliggjør avbildning av hjernevev i levende mus ved bruk av multifoton eller andre intravitale bildebehandlingsteknikker. Men når du utfører kraniotomi for hånd, er det ofte termisk skade på hjernevev, som er iboende variabel kirurgi til kirurgi og kan være avhengig av individuell kirurgteknikk. Implementering av en kirurgisk robot kan standardisere kirurgi og føre til en reduksjon i termisk skade forbundet med kirurgi. I denne studien ble tre metoder for robotboring testet for å evaluere termisk skade: horisontal, punkt-for-punkt og pulserende punkt-for-punkt. Horisontal boring benytter et kontinuerlig boreskjema, mens punkt-for-punkt borer flere hull som omfatter kranialvinduet. Pulsert punkt-for-punkt legger til et "2 s på, 2 s av" boreskjema for å tillate avkjøling mellom boring. Fluorescerende avbildning av Evans Blue (EB) fargestoff injisert intravenøst måler skade på hjernevev, mens et termoelement plassert under borestedet måler termisk skade. Termoelementresultater indikerer en signifikant reduksjon i temperaturendring i gruppen pulserende punkt-for-punkt (6,90 °C ± 1,35 °C) sammenlignet med gruppen horisontal (16,66 °C ± 2,08 °C) og punkt-for-punkt (18,69 °C ± 1,75 °C). Tilsvarende viste den pulserende punkt-for-punkt-gruppen også signifikant mindre EB-tilstedeværelse etter kranial vindusboring sammenlignet med den horisontale metoden, noe som indikerer mindre skade på blodkar i hjernen. Dermed ser en pulserende punkt-for-punkt-boremetode ut til å være den optimale ordningen for å redusere termisk skade. En robotdrill er et nyttig verktøy for å minimere trening, variasjon og redusere termisk skade. Med den økende bruken av multifotonavbildning på tvers av forskningslaboratorier, er det viktig å forbedre strengheten og reproduserbarheten av resultatene. Metodene som tas opp her, vil bidra til å informere andre om hvordan man bedre kan bruke disse kirurgiske robotene for å fremme feltet ytterligere.
Introduction
Kranialvinduer har blitt allestedsnærværende brukt innen nevrovitenskap, nevralteknikk og biologi for å muliggjøre direkte visualisering og avbildning av cortex hos levende dyr 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Den kraftige kombinasjonen av transgene mus og multifotonavbildning har gitt ekstremt verdifull innsikt i kretsaktivitet og annen biologisk innsikt i in vivo-hjernen 12,13,14,15,16,17,18. Miniatyrmikroskoper montert på hodeskallen har ytterligere utvidet disse mulighetene for å muliggjøre opptak i våkne, fritt bevegelige dyr19. Prosessen med å lage et kranialvindu krever kraftboring for å tynne eller helt fjerne kranialbenet for å produsere store nok kraniotomier for å sikre et gjennomsiktig stykke glass over cortex20. Polydimetylsiloksan (PDMS) og andre polymerer har også blitt testet som kraniale vindusmaterialer 9,21. Til syvende og sist er det ideelle kranialvinduet et som ikke endrer eller forstyrrer normal endogen aktivitet under. Imidlertid er det allment akseptert at kranialvinduboring forverrer underliggende vev, noe som fører til skade på hjernen, forstyrrelse av miljøet og påvirker meninges til det punktet å okkludere multifoton bildedybde22. Den resulterende nevroinflammasjonen har et bredt spekter av effekter som spenner fra permeabilitet av blod-hjernebarrieren (BBB), til aktivering og rekruttering av gliaceller rundt implantatstedet23. Derfor er karakterisering av sikrere og mer reproduserbare kraniale vindusboremetoder avgjørende for konsistent bildekvalitet og reduksjon av forstyrrende faktorer.
Mens det tas hensyn til å minimere traumer til det underliggende vevet, har boringen av beinet potensial til å forårsake både termiske og mekaniske forstyrrelser i hjernen24,25. Mekanisk traume fra utilsiktet borepenetrasjon i dura kan ytterligere indusere varierende grad av kortikal skade24. I en studie av Shoffstall et al.25 resulterte varmen fra beinboring i økt BBB-permeabilitet, som indikert ved tilstedeværelsen av Evans Blue (EB) fargestoff i hjerneparenkymet 25. EB-fargestoff, injisert intravenøst, binder seg til sirkulerende albumin i blodet og krysser derfor normalt ikke en sunn BBB i nevneverdige konsentrasjoner. Som et resultat blir EB-fargestoff ofte brukt som en sensitiv markør for BBB-permeabilitet26,27. Selv om studien deres ikke direkte målte virkningen av BBB-permeabiliteten på påfølgende biologiske følger som ble studert, har tidligere studier korrelert BBB-permeabilitet til økt nevroinflammatorisk respons på kronisk implanterte mikroelektroder og endringer i motorisk funksjon28.
Avhengig av målene for studien, kan størrelsen på termisk og mekanisk skade bidra til en kilde til eksperimentell feil, som negativt påvirker studiens strenghet og reproduserbarhet. Det finnes dusinvis av siterte metoder for å produsere kraniale vinduer, hver med forskjellig boreutstyr, hastigheter, teknikker og brukere 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 rapporterte at den observerte variasjonen i oppvarmingsresultatene ble tilskrevet variabilitet i borets påførte kraft, matehastighet og påføringsvinkel, blant andre aspekter som ikke kan kontrolleres for ved boring for hånd 25. Det er en tro på at automatiserte boresystemer og annet stereotaktisk utstyr kan forbedre reproduserbarhet og utfallskonsistens, men publiserte metodestudier har ikke grundig evaluert temperatur eller BBB-permeabilitet som et av resultatene. Derfor er det behov for mer reproduserbare og konsekvent anvendte metoder for å produsere kraniale vinduer, samt metoder som brukes nøye for å vurdere virkningen av kranialvindusboring på underliggende nevralvev.
Fokus for denne studien er å bestemme og utvikle konsistente og sikre boremetoder for kraniale vinduer. Størrelsen på kraniotomi for kranialvinduinstallasjon er betydelig større enn standard kraniotomier for hjerneimplanterte mikroelektroder. Slike kraniotomier kan ikke kompletteres med et enkelt burrhull ved bruk av standardutstyr, og introduserer dermed mer variasjon i teknikken mellom kirurger når de utføres for hånd20. Kirurgiske boreroboter har blitt introdusert til feltet, men har ikke blitt utbredt 1,6,29. Automatisering av boring gir kontroll over variabler som bidrar til observert variasjon fra forsøk til forsøk, noe som tyder på at bruk av utstyret kan redusere inter- og intrakirurgeffekter. Dette er av spesiell interesse gitt den ekstra vanskeligheten med den større kraniotomien som trengs for kranialvindusplassering. Mens man kan anta at det er klare fordeler med kontrollen som automatiserer boringen gir, har det vært lite vurdering av implementeringen av dette utstyret. Selv om synlige lesjoner ikke er observert5, er man ønskelig med høyere sensitivitetstest med EB.
Her måles BBB-permeabilitet ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kirurgisk borerobot med tilhørende programvare, som muliggjør programmering av stereotaktiske koordinater, kraniotomiplanlegging/kartlegging og et utvalg av borestiler ("punkt-for-punkt" vs "horisontal"), med henvisning til borekronens rutede bane. I utgangspunktet bores åtte "frø" -punkter (figur 1A), som beskriver kranialvinduet. Herfra kuttes mellomrommet mellom frøene ut ved hjelp av enten "punkt-for-punkt" eller "horisontal" boremetode. "Punkt-for-punkt" utfører vertikale pilothullkutt (ligner på en CNC-borepresse), mens "horisontal" utfører horisontale kutt langs omkretsen av kranialvinduet som skisserer hullet (ligner på en CNC-ruter). Resultatet for begge metodene er et stykke hodeskalle som kan fjernes for å avsløre kranialvinduet. For å isolere skader fra boring, fjernes ikke kranialvinduet fysisk, for å unngå ytterligere skade. En kombinasjon av EB-fargestoff kombinert med fluorescerende avbildning brukes til å måle BBB-permeabilitet etter å ha utført kraniotomier hos mus, og et innsatt termoelement brukes til å måle temperaturen på hjerneoverflaten direkte under boring (figur 1B, C). Tidligere observasjoner indikerte at pulserende boring på/av med 2 s intervaller var tilstrekkelig til å redusere borevarme25, og er derfor innarbeidet i den eksperimentelle tilnærmingen for operasjonsroboten.
Hensikten med det presenterte arbeidet er å demonstrere metoder for å vurdere termisk skade fra kraniotomiboring. Mens metodene presenteres i sammenheng med automatisert boring, kan slike metoder også brukes på manuelle boreordninger. Disse metodene kan brukes til å validere bruken av utstyr og/eller boreskjemaer før de tas i bruk som standardprosedyre.
Figur 1: Skjematisk eksperimentell pipeline. Skjematisk demonstrering av prosessen dyr gjennomgikk for EB-kvantifisering etter kranialvindusprosedyre. (A) Skjematisk oppsett av musen med stereotaksisk ramme og kirurgisk robotbor. Et eksempel på kranievindu er vist over den motoriske hjernebarken med frøpunkter (grønn) og kantpunkter (blå). (B) Perfusjonsoppsettet inkluderer injeksjon av 1x fosfatbufret saltvann (PBS) i hele dyret for å fjerne blod, etterfulgt av ekstraksjon av hjernen. (C) Hjernen blir deretter satt inn i EB fluorescerende bildesystemkammer for å utføre fluorescerende avbildning på Evans Blue-fargestoffet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer og dyrepleiepraksis ble gjennomgått, godkjent av og utført i samsvar med Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Oppsett av kirurgisk robotmaskinvare
- Før operasjonen, følg den kirurgiske roboten (se Materialfortegnelse) håndbok og veiledning for å sette opp maskinvare og programvare. Utfør rammekalibrering som beskrevet i håndboken. Hvis boret eller rammen flyttes, anbefales det å kalibrere boret på nytt for å sikre nøyaktighet.
2. Forberedelse av programvare
- Naviger til den kirurgiske programvaren (se Materialfortegnelse) og opprett et nytt prosjekt ved å velge Start med et rent prosjekt. Sett motivet som Mus øverst for å angi borekoordinatene som skal brukes.
- Velg Start nytt prosjekt.
- Herfra klikker du på Planlegging nederst til venstre for å navigere til skjermbildet for planlegging av borekoordinater. Opprett boreskjemaet for kranialvindusteknikken som skal utføres.
- For å gjøre dette, klikk hvor som helst på det stereotaktiske atlaset. Bruk Bregma som referanse, og skriv inn følgende koordinater for den motoriske hjernebarken: AP = 1,50, ML = 1,25, DV = 0,00. Trykk Enter på tastaturet for å oppdatere de valgte koordinatene.
MERK: Dorsal-Ventral (DV) koordinatene angir boredybden og trenger derfor ikke inngang her. - Klikk Store mål for å lagre disse koordinatene og skrive inn et passende navn. Herfra klikker du på Flytt-knappen nederst til venstre for å navigere tilbake til hovedboreskjermen.
- For å gjøre dette, klikk hvor som helst på det stereotaktiske atlaset. Bruk Bregma som referanse, og skriv inn følgende koordinater for den motoriske hjernebarken: AP = 1,50, ML = 1,25, DV = 0,00. Trykk Enter på tastaturet for å oppdatere de valgte koordinatene.
- Klikk Verktøy > Project > Lagre som for å bruke dette malprosjektet på nytt for senere prosjekter. Dette vil automatisk beholde borekoordinatene for senere bruk.
3. Forberedelse til kirurgi
- Bedøv PrismPlus-mus30,31 (se materialfortegnelse) i et isofluran kammer (3,5 % i 1,5 l/mino2). Påfør øyesmøremiddel for å forhindre tørking av øynene, barbere hodet med klippere og trim neglene for å forhindre at musene skraper suturer ut.
MERK: PrismPlus-mus er en type transgene fluorescerende arter som brukes i multifotonavbildning. De heterozygote PrismPlus-musene mangler fluorescerende gener og ble derfor brukt her for å redusere animalsk avfall fra andre pågående studier, og siden det ikke er noen multifotonavbildning i denne studien. Villtypemus forventes å vise lignende resultater. - Administrer subkutane injeksjoner av antibiotika cefazolin (24 mg / kg), smertestillende karprofen (5 mg / kg) og buprenorfin (0,05-0,10 mg / kg) til bedøvede mus. Før et snitt, administrer en enkelt subkutan injeksjon av markain (0,25%, 100 μL) under snittstedet (1 tomme langs midtlinjen av skallen som starter bak øynene).
MERK: Medisiner som brukes her følger tidligere etablerte IACUC-protokoller. Det anbefales imidlertid å vurdere EMLA-krem som et aktuelt bedøvelsesmiddel for en multimodal effekt før kirurgi og haleveneinjeksjon samt Meloxicam SR i stedet for Carprofen. EMLA og Meloxicam SR kan gis før isoflurananestesi. - Monter dyret på den kirurgiske robotens stereotaktiske ramme, ved hjelp av medfølgende ørestenger, og oppretthold anestesi med 0,5% -2% isofluran via innånding gjennom en nesekjegle.
- Sørg for at bedøvelsesdybden overvåkes nøye av en utdannet veterinærtekniker eller personale, basert på musens respons, respirasjon (~ 55-65 pust / min), hjertefrekvens (300-450 bpm) og farge (rosa). Whisker og vanlig tåklemme kan også brukes som et tiltak for å bestemme dybden av anestesi. Verdiene av vitale er bestemt av institusjonelle IACUC-forskrifter.
- Oppretthold dyrets kroppstemperatur på en sirkulerende vannpute og overvåk vitaliteter ved hjelp av et blod-oksygen og hjertefrekvensmålingssystem.
- Skrubb operasjonsområdet med klorhexidinglukonat (CHG) og 70% isopropanol for sterilisering. For å opprettholde sterilitet under operasjonen, plasser en steril plastfolie over musen og stereotaktisk ramme.
MERK: Selv om disse protokollene ble utviklet for overlevelsesoperasjoner, gjenspeiler de presenterte dataene bruken av ikke-overlevelsesdyr, da fokuset var å teste og bestemme passende boreprotokollmetoder.
4. Forberedelse av hodeskallen
- Ved hjelp av et skalpellblad, utfør et 1 tommers snitt på midtlinjen av skallen, som starter på baksiden av øynene.
- Trekk huden tilbake for å eksponere skallen og (eventuelt) bruk tilbaketrekkere for å opprettholde operasjonsvinduet. Fjern eventuelt gjenværende vev og membran ved hjelp av sterile bomullstippede applikatorer.
- Tørk ut og rengjør skallen med 3% hydrogenperoksid med bomullstippede applikatorer.
MERK: Dette vil gjøre suturene på skallen synlige. Bregma og Lambda skal være lett å se. Hvis ikke, bruk mer hydrogenperoksid eller øk størrelsen på snittet. - Tillat "auto-stop" -funksjonalitet ved å feste alligatorklipskabelen fra det kirurgiske robotboreoppsettet til musen, i henhold til produsentens anbefalinger. "Auto-stop" virker ved å oppdage en endring i impedans, så når borekronen kommer i kontakt med cerebrospinalvæske (CSF) i stedet for bein, vil boret slutte å bore, og dermed forhindre skade på hjernen.
5. Evans blå hale vene injeksjon
FORSIKTIG: EB er et mulig kreftfremkallende stoff. Bruk hansker ved håndtering.
- For å forberede halen for enkel injeksjon, tørk av med en alkoholserviett. Eventuelt kan vintergrønn olje påføres lokalt for å utvide venen35.
- Ta tak i halen i den ene hånden mens du håndterer sprøyten med EB i den andre hånden. Bruk tommelen og pekefingeren, bøy halen for å eksponere halevenen på toppen av bøyningen av halen. Sett sprøyten (1 eller 2 ml, 30 G insulinsprøyte) parallelt med venen og injiser volumet av EB langsomt. EB (4 % w/v) administreres i en konsentrasjon på 2 ml/kg kroppsvekt via injeksjon i halevene.
MERK: Minimal eller ingen motstand mot strømning fra sprøyten til halen kan kjennes hvis nålen er riktig satt inn. Hvis det er motstand eller EB-fargestoff vises i halen, flytt deretter ned på halen og prøv igjen. - Når det er injisert, vent i 5 minutter slik at EB sirkulerer gjennom musen før boringen starter. Vellykket injeksjon blir umiddelbart verifisert når musens ekstremiteter og operasjonsvindu blir blått.
6. Kirurgisk robot boring prosedyre
- Når hodeskallen er klargjort for boring, naviger tilbake til den kirurgiske programvaren. Åpne malprosjektet som ble definert i trinn 2.4 der koordinatene for boring var angitt.
- Følg verktøy > Project > New > Velg et malprosjekt , og velg malprosjektet som ble angitt i trinn 2 (klargjøring av programvare).
- Velg Samme protokollelementer > Planlegging (målpunkter) > Drillparametere som skal overføres til dette nye prosjektet.
- Klikk Start nytt prosjekt.
- Deretter korrigerer du boret og rammen for å ta hensyn til tilt og skalering av museskallen til det aktuelle dyret. Klikk på Verktøy, og velg Korriger for vipping og skalering... for å åpne korrigeringsskjermen . Øverst på skjermen kontrollerer du at boret er aktivt (ikke sprøyten) ved å klikke på den lysrøde drillknappen .
MERK: Når den er aktivert, blir drillknappen mørk/lys rød. Sprøyteknappen kan ignoreres, da den ikke brukes i denne protokollen.- Korriger først skalaen, tonehøyden og gjespen ved å stille inn hvor Bregma og Lambda befinner seg på det aktuelle dyret. Bruk enten tastaturkontrollene eller kontrollene på skjermen for å flytte borekronen. Når borkronen er plassert over Bregma, senker du den til den akkurat berører skallen og klikker på Sett Bregma. Gjenta dette for Lambda.
- Deretter justerer du for den spesifikke rullen av skallen. Klikk på Go to Midpoint-knappen for å justere borekronen automatisk til midten av skallen. Klikk 2 mm til venstre og senk deretter borekronen sakte til du berører skallen. Klikk Angi venstre punkt.
- Gjenta trinn 6.2.2 for høyre side av hjernen. Nå er systemet satt opp for denne spesifikke skallen.
MERK: Korreksjon her er avgjørende for å sikre riktige borekoordinater og dybde. Musen må monteres så nær rett som mulig for å redusere behovet for korreksjon så mye som mulig. Hvis det er behov for store korreksjoner, kan det føre til dårlig nøyaktighet i boringen.
- Etter at korrigeringen er utført, går du ut av korreksjonsvinduet ved å klikke på Lukke nederst midt på skjermen. Naviger til boreskjermen ved å klikke på Redskapene og deretter velge Drill... for å starte boreprosedyren.
- Kontroller at kraniotomi-form er valgt fra rullegardinmenyen Drill øverst på skjermen. Klikk deretter Velg drillsenter &-figur , og velg det forhåndsdefinerte målet som ble navngitt i trinn 2.3.1. Under dette skjermbildet velger du Sirkel som form for målet og legger inn 2,60 mm som diameteren2 i sirkelen. Klikk Vis.
MERK: Diameteren på kranialvinduet opprettes ved hjelp av midten av borekronen som sentrum av frøpunktene. En liten borkrone (diameter = 0,6 mm eller anbefalt bitstørrelse levert av leverandøren) brukes til å minimere den ekstra diameteren som tilføres som følge av bruk av en større borekrone. Spesielle borekroner brukes spesielt til operasjonsroboten. De åtte frøpunktene og kantpunktene vil nå vises på skallen som henholdsvis grønne og blå prikker. - Klikk på hovedvinduet og bruk hurtigtasten Control + Shift + D for å få frem Drill Points-menyen på høyre side av skjermen. Dette gjør det mulig å vise bestemte borepunktdybder og statuser.
- Før boringen begynner, kan du tilpasse auto-stop-funksjonen om nødvendig ved å klikke på knappen ved siden av Auto-Stop-avkrysningsruten . Denne knappen har Middels som standard, noe som tilsvarer følsomheten for auto-stop-funksjonen.
MERK: Dette kan testes på forhånd for å finne riktig følsomhet for dyrene. I denne protokollen ble den høyeste følsomheten brukt for å sikre minimal boring gjennom hjernen. - Når auto-stop-funksjonen er aktivert og tilpasset, begynner du boringen av frøpunktet. Klikk Auto Scan slik at drillen automatisk begynner på Seed 1. Når borekronen berører CSF-en, vil auto-stop-funksjonen oppdage en endring i impedans, noe som fører til stopp i boringen og tilbaketrekking av borkronen fra skallen.
- Hold øye med boringen i tilfelle automatisk stopp ikke oppdager endringer. Esc-tasten kan trykkes for å avbryte boringen manuelt. Den rosa sirkelen nederst på Drill-menyen og til høyre for impedansverdiene kan også klikkes for å starte eller stoppe boringen.
MERK: Borkronen vil automatisk bore til en dybde som tilsvarer den estimerte skalletykkelsen (eller til auto-stop-funksjonen er aktivert). - Hvis automatisk stopp ikke aktiveres før den estimerte dybden er nådd, vil det dukke opp et skjermbilde som ber brukeren om å: 1) Fortsett å bore og synke # mm videre, 2) Merk på nåværende dybde og fortsett, 3) Hopp over gjeldende punkt og fortsett, eller 4) Stopp prosessen (kan fortsette senere). Velg ett av alternativene som beskrevet nedenfor.
- For Fortsett å bore og synke # mm lenger, angi en avstand som boret skal avansere. Som standard brukes 0,1 mm. En mindre avstand kan foreslås for å forhindre utilsiktet penetrasjon av hjernen.
- Hvis det antas at dura er nådd på dette skjermbildet, velger du alternativet Merk på nåværende dybde og fortsett for systemet for å merke dura på den dybden og gå videre til neste frø.
- Bruk Hopp over gjeldende punkt og fortsett og Stopp prosessen (kan fortsette senere) for å feilsøke eller rense av borekronen og gå tilbake når autostoppet fungerer igjen.
- Når alle frøpunktene er boret, hvis noen ikke var ferdige med auto-stop-funksjonen, sjekk dybden på hullet manuelt ved hjelp av en dura-hakke. Dette vil sikre at den borede dybden trengte gjennom skallen.
- Før du starter kantpunktboring, bestemmer du hvilken type kantkutt som ønskes, ved å velge rullegardinmenyen ved siden av kantkuttteksten på Drill-menyen . De to alternativene er punkt-for-punkt og horisontalt.
- Velg Punkt-for-punkt for å bore hvert kantpunkt enkeltvis og til en dybde som bestemmes av frøpunktdybden ved siden av. Juster skaleringen om nødvendig via Edge Scaling... -knappen nedenfor, selv om standardinnstillingen Ingen skalering vanligvis er tilstrekkelig.
- Velg Vannrett for å begynne boringen ved Kantpunkt 1 og bruk en kontinuerlig borebevegelse til å gå rundt hele omkretsen av boresirkelen. Som standard vil det horisontale kuttet kutte med 100 μm intervaller, gå hele veien rundt vinduets omkrets før det avanserer ytterligere 100 μm dypere. Endre om nødvendig intervalldybden og borehastigheten under knappen Klippealternativer... nedenfor.
- Bruk den automatisk kuttede forskyvningen (under Edge-Cut-boksen ) for å justere for den automatiske kuttdybden ved å ta en forhåndsbestemt forskyvning fra de tilstøtende frøpunktene. I denne protokollen ble det brukt en automatisk kuttet forskyvning på 20 μm. Ytterligere testing kan gjøres for å bestemme en optimal forskyvning per dyr.
- Når innstillingene for kantkutting er fastslått, starter du kantpunktboring ved å klikke Automatisk kutt-knappen midt på Drill-menyen. For punkt-for-punkt-boring, når den siste kanten er boret, er boreprosedyren ferdig. For horisontal boring, fortsett til nok hodeskalle er boret for å frigjøre kranialvinduet.
MERK: Selv om boring utføres til vinduet kan slippes, frigjøres ikke vinduet fysisk her for å forhindre skade på underliggende vev. Det er viktig å isolere skaden som følge av bare boring for å evaluere ulike boreskjemaer.- Når den horisontale boringen har nådd dybden av ett frøpunkt, høyreklikker du frøet (eller velger flere punkt først) i Drillpunkter-menyen og klikker Lås dybde. Dette vil tillate horisontal skjæring å fortsette uten å kutte dypere for det området (og dermed unngå å trenge inn i hjernen).
MERK: Hvis det er frøpunkter med ulik duradybde, kan dette føre til forskjeller i dybden som trengs for den horisontale boreprosedyren.
- Når den horisontale boringen har nådd dybden av ett frøpunkt, høyreklikker du frøet (eller velger flere punkt først) i Drillpunkter-menyen og klikker Lås dybde. Dette vil tillate horisontal skjæring å fortsette uten å kutte dypere for det området (og dermed unngå å trenge inn i hjernen).
- Hvis auto-stop-funksjonen ikke fungerer som den skal, må du sørge for at borekronen er helt ren for rusk eller potensielt blod, saltvann osv., da dette kan påvirke bunnimpedansen til borkronen. I tillegg kan du velge blant en av de flere manuelle borealternativene som er beskrevet nedenfor, i tilfelle automatisk stopp ikke fungerer konsekvent.
- I Drill-menyen navigerer du manuelt til hvert frø ved å høyreklikke på frøet eller kanten og velge Gå til oppføring. Det er også muligheter for å rydde dybdene som er merket, tilbakestille hullet og andre alternativer som kan hjelpe til med boreprosedyren.
- Kontroller fremdriften i boredybden manuelt ved å velge en dybde fra rullegardinlisten ved siden av Advance:-teksten nær toppen av Drill-menyen. Klikk på Advance-knappen rett nedenfor for å flytte drillen den angitte avstanden.
MERK: Denne funksjonen kan brukes sammen med knappene Set Dura og Set Surface under Advance-knappen for å manuelt fortelle systemet hvor både overflaten på skallen og dura er plassert. Bruk auto-stop-funksjonen der det er mulig, men om nødvendig er disse manuelle alternativene også tilstrekkelige. - Hvis du borer manuelt, må du være mer forsiktig mellom hvert boredybdeintervall for å sikre at boringen ikke overskrider duraen. Kontroller det borede hullet med en dura-hakking mellom dybdeintervallene for å bekrefte om duraen ble nådd. Når all manuell frøboring er ferdig, fortsett kantkuttprosedyren normalt som beskrevet ovenfor.
- Puls metode
- For å utføre manuell pulsboring, slå av auto-stop-funksjonen ved å fjerne merket i avmerkingsboksen ved siden av Auto-Stop-alternativet i Drill-menyen . Dette må være av for å tillate kontroll når boret er av for pulsering.
MERK: Pulsboring følger et mønster av 2 s boring etterfulgt av 2 s uten boring for å tillate skallen å kjøle seg ned. - I Drill-menyen, velg 100 μm som fremdrift i boredybden, dette vil tilsvare ~2 s nedoverboring.
- Når du er klar, klikker du Advance for å starte drillingen.
MERK: Vær klar til å stoppe boret raskt når det har avansert med 100 μm, da boret fortsetter å rotere på dybden til det slipper ut (genererer unødvendig varme). - Når boret har avansert 100 μm, trykk Escape to ganger for å stoppe boret. Etter 2 s, gjenta denne syklusen for dybden av skallen.
MERK: Bare punkt-for-punkt-metoden kan utføres ved hjelp av pulserende metode på grunn av programvare og mekaniske begrensninger. Kontinuerlig horisontal boring kan ikke utføres på denne måten. - Bor alle frø- og kantpunkter ved hjelp av denne metoden som er beskrevet ovenfor. Sørg for å stille inn Dura ved hjelp av knappen i drillmenyen når duraen er nådd.
- For å utføre manuell pulsboring, slå av auto-stop-funksjonen ved å fjerne merket i avmerkingsboksen ved siden av Auto-Stop-alternativet i Drill-menyen . Dette må være av for å tillate kontroll når boret er av for pulsering.
- Kontroller at kraniotomi-form er valgt fra rullegardinmenyen Drill øverst på skjermen. Klikk deretter Velg drillsenter &-figur , og velg det forhåndsdefinerte målet som ble navngitt i trinn 2.3.1. Under dette skjermbildet velger du Sirkel som form for målet og legger inn 2,60 mm som diameteren2 i sirkelen. Klikk Vis.
7. Perfusjon og hjerneutvinning
- Når boringen av frøet og kantpunktene er ferdig, hold dyret under isoflurananestesi i ytterligere 1 time for å tillate EB-fargestoffet å sirkulere og ekstravasere gjennom den skadede BBB. Utfør hjerteperfusjon for å fjerne blod eller væsker fra karene, og fjern deretter hjernen for avbildning og analyse som beskrevet nedenfor.
- Etter sirkulasjonsperioden på 1 time etter dannelsen av kranialvinduet, injiser en cocktail av ketamin (160 mg/kg) og xylazin (20 mg/kg) intraperitonealt i dyret. Når du ikke reagerer, utfør en hjerteperfusjon.
- Klipp opp magen på musen ved hjelp av saks og utsett hjertet ved å kutte vertikalt gjennom ribbeholderen og horisontalt over mellomgulvet. Trekk inn brystkassen for å se hjertet tydelig. Sett inn en sommerfuglnål i hjertets venstre ventrikkel og begynn å infisere 1x fosfatbufret saltvann (PBS) gjennom hele kroppen. Klipp en liten del av høyre atrium i hjertet for å frigjøre trykkoppbygging.
- Etter at 25 ml 1x PBS har perfusert gjennom hele kroppen, stopp perfusjonen og halshugg musen som et sekundært middel for eutanasi.
MERK: Sørg for å utføre den institusjonelt godkjente metoden for eutanasi og/eller endepunktperfusjon for dyret for å isolere hjernen. - Herfra trekker du hjernen ut av skallen ved å fjerne bein og vev med rongeurs.
- Avbilde den ekstraherte hjernen med et fluorescerende bildesystem for å observere mengden EB som ligger i hjernen rundt borestedene.
MERK: EB binder seg til sirkulerende albumin. Hvis vaskulær skade oppstår i hjernen, vil EB lekke ut og binde seg til hjernevevet, noe som fører til en klar visuell indikator på skade.
8. Evans Blå bildebehandling og analyse
- Initialisering av maskinvare
- Slå på datamaskinen som er koblet til EB-fluorescensavbildningssystemet, og start bildebehandlingsprogramvaren (se Materialfortegnelse) mens andre elementer forberedes. Slå på lyskilden, plattformen og kameraet i den rekkefølgen.
- Naviger til bildebehandlingsprogramvaren og klikk på Initialiser under Oppkjøpskontrollpanel. Systemet og kammeret vil signalisere fra rødt til grønt så snart initialiseringen er fullført.
MERK: Initialiser EB fluorescerende bildesystem 30 minutter før avbildning for å la temperaturen på lyskilden nå optimale nivåer.
- Avbildning av hjernen
- Plasser den eksplanterte hjernen i en klar tallerken i midten av scenen for avbildning.
- Under Oppkjøpskontrollpanel justerer du innstillingene for bildet. Velg eksponeringstid: 1 s; Binning: Middels; F / Stopp: F1; Eksitasjon: 535 til 675 nm; Utslipp: Cy 5,5; Lampenivå: Høy; og FOV: 5 cm. La filteret være låst og overlegget av fotografering og fluorescens kontrollert. Disse innstillingene er basert på tidligere laboratorieerfaring og andre publiserte metoder for avbildning av EB36.
- Last inn bilder av EB-fluorescerende bildesystemer i open access-programvare for bildebehandling (se materialfortegnelse) og generer tre frihåndsområder av interesse (ROI) for å finne den fluorescerende intensiteten til EB ved å måle den gjennomsnittlige utstrålingen over bakgrunnen, hele hjernen og kranialvinduet.
- Normaliser kranialvinduet og hele hjernemålinger mot tilsvarende bakgrunnsavkastning.
- Avbilde hver hjerne under forskjellige eksitasjonsfiltre (535-675 nm) for å finne bølgelengden med det høyeste signal-støyforholdet (605 nm ble valgt) mellom eksperimentgruppene til saltvannskontrollen.
- Isoler den gjennomsnittlige utstrålingen under riktig bølgelengde og gjennomsnitt for å oppnå gjennomsnittlig utstråling eller fluorescerende intensitet for hele hjernen og kraniale vindusavkastninger.
- Finn og normaliser gjennomsnittlig gjennomsnittlig utstråling over kranialvindusområdet for hver gruppe mot saltvannskontrollen.
9. Evaluering av termoelement
- Mål temperaturendringene i hodeskallen og hjernen ved hjelp av et termoelement (se materialtabell) i kombinasjon med de tre forskjellige boreskjemaene. Termoelementet er koblet til et datainnsamlingssystem (DAQ) som gjør det mulig å lese målingen inn i MATLAB.
- Monter en kadavermus på det stereotaktiske ramme- og robotboroppsettet. Bor manuelt et lite hull (samme størrelse som frøpunktet) ~ 2 mm vekk fra hvor kranialvinduet vil bli gjort til siden av skallen25. Dette hullet gjør det mulig å skyve termoelementet på plass under der boring av kranialvinduet skjer (figur 2D).
MERK: Kadavermus brukes fordi boring åpne siden av skallen er nødvendig for å skyve termoelementet over kranialvinduets boreområde. Denne kadavermusen er et annet dyr enn det som tidligere ble brukt til Evans Blue-analyse. - Start boreprosessen for hvert av de tre skjemaene som gjort tidligere (trinn 6). Når boret går gjennom skallen, vil det være pigger i temperaturendring, noe som indikerer oppvarming som skjer nær hjernen.
- Registrer og plott resultatene i MATLAB for å beregne maksimal temperaturforskjell. Dette bør gjøres separat for frøboring og kantboring for å evaluere horisontal vs. punkt-for-punkt-boring sammen med den pulserende manuelle boremetoden.
10. Statistikk
- Utfør statistisk analyse for termoelement og EB fluorescerende avbildning i R ved hjelp av en Kruskal-Wallis rangsumtest med Benjamini-Hochberg-korreksjon etterfulgt av parvise sammenligninger ved bruk av Wilcoxon rangsum eksakt test25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Termisk evaluering
Potensialet for termisk skade ble evaluert ved å måle temperaturendringen fra baseline på grunn av boring ved hjelp av horisontale (figur 2A), punkt-for-punkt (figur 2B) og pulserende punkt-for-punkt (figur 2C) metoder. Figur 2D viser det eksperimentelle oppsettet for innhenting av termiske data. En prøvestørrelse på N = 4 kraniale vinduer ble brukt til termisk evaluering. Horisontal og punkt-for-punkt bruker samme frøboringsskjema, men varierer etter hvordan kantpunktene kuttes. Pulsert punkt-for-punkt bruker en pulserende metode for både frø- og kantboringsdeler. For den horisontale metoden viste frøboring en maksimal temperaturendring på 16,66 °C ± 2,08 °C, mens kantboring viste 9,08 °C ± 0,37 °C. For punkt-for-punkt-metoden viste frøboring en maksimal temperaturendring på 18,69 °C ± 1,75 °C, mens kantboring viste 8,53 °C ± 0,36 °C. For pulserende punkt-for-punkt-metoden viste frøboring en maksimal temperaturendring på 6,90 °C ± 1,35 °C, mens kantboring viste 4,10 °C ± 0,51 °C. Både de horisontale og punkt-for-punkt-boreskjemaene viser ikke-signifikante forskjeller for termiske endringer. Endring til pulserende punkt-for-punkt-metode resulterte imidlertid i signifikant mindre oppvarming (p < 0,05) av hjernen enn både horisontal og punkt-for-punkt-boring (figur 2E,F). Varigheten av operasjonen ble også registrert, da det kan ha betydning for dyrs overlevelsesevne for levende operasjoner. For begge de automatiserte metodene tok frøboringen i gjennomsnitt 360 s. Horisontal kantboring tok 300 s, mens punkt-for-punkt kantboring tok 200 s. Den pulserende metoden tok lengst tid, med frø- og kantboring som tok omtrent 500 s hver. Likevel er disse forskjellene ikke store nok til å rettferdiggjøre noen vurdering, da operasjoner ofte kan vare over 2-3 timer.
Figur 2: Termisk evaluering. Potensialet for termisk skade ble vurdert ut fra maksimale temperaturendringer i hjernen som følge av boremetoder. (A) Horisontal boring og (B) punkt-for-punkt-boring genererte tilsvarende mengder varme, mens (C) en pulserende 2 s på, 2 s av punkt-for-punkt-metoden viste minimal oppvarming. (E) Frøboring og (F) kantboring resulterte i betydelig mindre termisk endring i den pulserende punkt-for-punkt-metoden for boring (p < 0,05, N = 4 per tilstand). (D) Termoelementet plasseres under skallen til musekadaveret der boringen utføres. Data innhentes gjennom en DAQ og mates inn i en datamaskin for analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Vaskulær skade
Figur 3 viser sammenhengen mellom boreskjema og vaskulær skade. Tabell 1 angir p-verdien for hvert boreskjema etter statistisk analyse som angitt i trinn 10. En prøvestørrelse på N = 4 per gruppe ble brukt til evaluering av EB-fargestoffer. Tilstedeværelsen av en høyere mengde EB er en direkte indikator på skade på BBB, hvorav punkt-for-punkt, horisontale og pulserende boremetoder er betydelig større enn kontrollen (alle med p = 0, 043; Tabell 1). Punkt-for-punkt-metoden viser ingen signifikant forskjell når det gjelder EB-tilstedeværelse sammenlignet med horisontalboringen (p = 0,411). Begge disse ordningene benyttet auto-stop-funksjonen for å forhindre boring i hjernen; Imidlertid klarte denne auto-stop-funksjonen ofte ikke å forhindre skade. Denne feilen i automatisk stopp i den delte frøboringsdelen kunne ha forårsaket ukjent overflødig skade, noe som kompliserte differensieringen mellom teknikkene. Derfor ble det utført en parvis sammenligning med en pulserende punkt-for-punkt-metode uten automatisk stopp for å evaluere de to andre metodene uten å inkludere auto-stop. Det var ingen signifikant forskjell når pulserende punkt-for-punkt ble sammenliknet med punkt-for-punkt (p = 0,486), mens pulserende punkt-for-punkt-metoden hadde signifikant mindre EB-tilstedeværelse enn den horisontale metoden (p = 0,043). Ikke-signifikans mellom pulserende punkt-for-punkt- og punkt-for-punkt-metoder kan tilskrives den store variasjonen i punkt-for-punkt-boring (figur 4).
Figur 3 viser representative bilder av både horisontal (figur 3C) og punkt-for-punkt (figur 3D) boring med riktige auto-stop-funksjoner. Visuelt, og gjennom fluorescerende avbildning av EB, så man at boring punkt for punkt og horisontal skjæring var skadelig for vaskulaturen i hjernen sammenlignet med kontrollgruppene (figur 3A, B). Den pulserende punkt-for-punkt-metoden (figur 3E) hadde mindre lokal skade ved frø og kantpunkt, men hadde fortsatt synlig EB-tilstedeværelse i kranialvinduet.
Figur 3: Vaskulær skade. EB-fluorescensbilder av eksplanterte hjerner (1) og tilsvarende ROI (2) brukt til å bestemme gjennomsnittlig utstråling av området påvirket av kranialvinduskraniotomi. (A) Musen ble injisert med EB uten kranial vinduskirurgi for å oppnå baseline bakgrunns EB-tilstedeværelse i hjernevaskulaturen. (B) Musen ble injisert med saltvann bare og en kranial vindu kraniotomi ble utført. Dette fastslo at den gjennomsnittlige utstrålingen som ble målt ble kreditert EB-akkumuleringen på grunn av lekkende blodkar og vaskulært traume nær kranialvinduet. (C) Musen ble injisert med EB og kranialvinduet ble opprettet ved den horisontale metoden for automatisk boring. (D) Musen ble injisert med EB og kranialvinduet ble opprettet ved punkt-for-punkt-metoden for automatisk boring. (E) To representative bilder av kranievindu produsert med punkt-for-punkt pulserende boremetode etter at musene (n = 2) ble injisert med EB. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Visuell inspeksjon av skade
Visuell inspeksjon av hjernen viser fysisk skade på hjerneoverflaten (figur 4). Panelene A-D demonstrerer EB-tilstedeværelsen av den horisontale boringen, panelene E-H punkt-for-punkt-metoden, og panelene I-L er den pulserende punkt-for-punkt-metoden. "Punkt-for-punkt" utfører vertikale pilothullkutt mens "horisontal" utfører horisontale kutt langs omkretsen av kranialvinduet som skisserer hullet. "Pulserende punkt-for-punkt" bruker de samme metodene som punkt-for-punkt uten bruk av auto-stop-funksjonen, og avhenger av at brukeren stopper boringen ved angitte dybdetrinn. Selv om det er funnet en metode som vil minimere mengden termisk skade på hjernen, er det fortsatt spørsmålet om mekanisk skade fra boret. Ideelt sett ville en auto-stop-funksjon som oppdager CSF og stopper boring før skadelig hjernevev fungere her, men så ikke ut til å fungere konsekvent. Selv med ekstrem forsiktighet ved pulserende manuell boring, var det fortsatt synsskade på hjernen. Dette kan være et resultat av to faktorer: 1) mangelen på kontroll og følelse som følger med håndboring og 2) separasjonsdybden mellom skallen og hjernen for et lite dyr som en mus. Håndboring kan tilby en mer kontrollert metode for å komme gjennom skallen uten å skade hjernen med nok øvelse og kompetanse. Imidlertid er det mye høyere ferdigheter og trening som trengs sammenlignet med en plug-and-play-robot, noe som vil tillate flere "kirurger" å bidra til samme studie - ikke en vanlig praksis i det intrakortikale mikroelektrodefeltet. Med mus er avstanden mellom hjernen og skallen ekstremt tynn, så selv den minste overboring på 10 μm kan føre til mekanisk skade på hjernen.
Figur 4: Visuell inspeksjon av skader. Digitale bilder av alle hjerner innhentet for visuell inspeksjon og representasjon for hver av de tre boremetodene. (AD) Horisontal viste konsekvent skader rundt kranialvinduet, enten fra mekanisk eller termisk skade. (E-H) Punkt-for-punkt viste betydelig variasjon i resultatene, noe som indikerer en mindre pålitelig metode for boring. (I-L) Pulserende punkt-for-punkt var mer konsistent og viste mindre visuell skade enn de andre metodene, som samsvarte med forskjellene i EB-fluorescerende analyse og termoelementresultater. Skala bar = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Horisontal | Punkt | Pulserende | Kontroll | |
| Horisontal | - | 0.411 | 0.043* | 0.043* |
| Punkt | 0.411 | - | 0.486 | 0.043* |
| Pulserende | 0.043* | 0.486 | - | 0.043* |
Tabell 1: Statistisk analyse av EB fluorescerende bilderesultater. Resultater fra EB fluorescerende avbildningssystem for ulike boreteknikker ble analysert med Kruskal-Wallis rangsumtest med Benjamin-Hochberg-korreksjon etterfulgt av parvise sammenligninger med Wilcoxon rank sum exact test (N = 4 per gruppe). Signifikante forskjeller mellom grupper er indikert med en stjerne *.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruk av EB-fargestoff og avbildning er enkelt, raskt og nyttig for å evaluere vaskulær skade i hjernen for nye metoder og teknikker. Enten du bruker en kirurgisk robot eller bekrefter metoder som for tiden gjøres i laboratoriet, er det viktig å validere kirurgiske metoder for å isolere effekten av eksperimentelle behandlinger vs. kirurgisk påvirkning og forbedre dyrevelferden. Et termoelementoppsett er også nyttig for å evaluere boremetoder for å sikre at det ikke oppstår oppvarming. Temperaturøkninger på grunn av beinboring har vært kjent for å forårsake vevskader, og selv en økning på 5 °C er nok til å forårsake stor vaskulær skade i hjernen 32,33,34,35,36. Det anbefales å bruke metodene som er beskrevet her for å forbedre laboratorie- og kirurgiske teknikker.
Selv om det er nyttig for evaluering, har termoelementevaluering noen begrensninger. Termoelementdata er anskaffet ved hjelp av kadavermus på grunn av nødvendigheten av å bore et hull i siden av skallen for å passe termoelementet inn i hjernen og mulig skade på hjernen som et resultat. Som et resultat måles temperaturforskjellen på tvers av boring i stedet for dyrets fysiologiske temperatur. I tillegg kan det være fysiologiske temperaturreguleringsfunksjoner som ikke er inkludert i analysen.
Flere trinn i protokollen er avgjørende for å sikre riktig boring. For det første vil kraniejustering, hvis det gjøres feil, føre til dårlig borenøyaktighet sammen med skade på hjernen (hvis automatisk stopp ikke virker). Sørg for at monteringen av dyret er så rett som mulig før hellingskorreksjon for å unngå dette problemet. Korriger eventuelle hellingsforskyvninger ved å følge hellingskorrigeringsprosessen sakte og sikkert. I noen få tilfeller under denne studien var vippingen av, noe som førte til at boresystemet trodde at det boret seg inn i skallen, selv om borekronen ikke engang hadde kommet i kontakt med skallen. I stor grad er dette et problem for nøyaktig registrering av skalletykkelse, og hvis det er skjerpende nok, kan det føre til unøyaktighet i borekoordinatene. I tillegg var auto-stop-funksjonen inkonsekvent og må brukes med forsiktighet. Ikke stol utelukkende på auto-stop-funksjonen for å forhindre skade på hjernen. Kontroller alltid borehullet for å sikre at overboring ikke forekommer.
Uavhengig av automatisk stopp, er det noen optimaliseringer som kan utføres for punkt-for-punkt og horisontale boremetoder. For å sikre at det ikke oppstår tilfeldige skader på hjernen, bruker punkt-for-punkt en boreforskyvning under kantskjæring, men brukeren må forhåndsbestemme denne innstillingen på forhånd gjennom testing. En lineær interpolasjonsmetode kan inkorporeres med det grunneste frøpunktet som grunnlag, slik at det ved tykkere frø rundt skallen ikke vil oppstå skade i hjernen. Om nødvendig kan brukeren alltid gå tilbake til et tykkere område av skallen og bore dypere. Det horisontale skjæringstrinnet bruker et dybdeskjæringsintervall (standard på 100 μm) for hver rotasjon rundt kantpunktene. Dette kan også bestemmes basert på skalletykkelse for å unngå å bore for dypt og skade hjernen.
Transgene mus er en kraftig eksperimentell modell for intravital multifotonavbildning. Mens bruken av en kirurgisk robot for kraniale vinduer i transgene mus er fremhevet i denne studien, er det viktig å merke seg bruken av en kirurgisk robot i andre kraniale operasjoner. Evnen til å kontrollere og standardisere boring gir fordeler for kraniotomier i større dyreforsøk over hele feltet. Selv om noen mekaniske skader ble observert visuelt, skyldes dette mest sannsynlig den ekstremt små separasjonen mellom hjernen og skallen hos mus. Større dyr, som rotter, har mer subaraknoid plass og tykkere dura, noe som gir mindre risiko for mekanisk skade på grunn av robotboring25. I kombinasjon med reduksjonen i termisk skade vist ved hjelp av pulserende metode her, har den kirurgiske roboten potensial til å redusere skader som oppstår ved boring på tvers av ulike dyremodeller.
Samlet sett viste den pulserende punkt-for-punkt-metoden minst skade, enten det var som følge av mindre oppvarming eller mindre mekanisk skade på hjernen. Boring for hånd kan være en mer kontrollert metode for å unngå skade, men det er viktig å fremheve fordelene med en kirurgisk robot. En robot trenger mindre opplæring, kan bidra til å redusere variasjonen mellom kirurg og kirurg, og når den er optimalisert fullt ut, kan den låne til en mer standardisert prosedyre på tvers av laboratorier. I tillegg er læringskurven for en kirurgisk robot mye lavere enn for kirurgi for hånd. Dette reduserer ikke bare tiden det tar å lære teknikken, men reduserer også antall dyr som brukes til treningsformål. Utbredelsen av kranialvindusboring har økt med innovasjonen av multifotonavbildning gjennom hjernen som sett i publiserte artikler 20,37. Bruk av karakteriseringsmetoder som termoelementer og EB-fargestoffavbildning vil bidra til å optimalisere boreteknikken, mens bruk av roboter vil gjøre vanskelige operasjoner mer tilgjengelige og utbredt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å rapportere om. Innholdet representerer ikke synspunktene til US Department of Veterans Affairs, National Institutes of Health eller USAs regjering.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet delvis av Merit Review Awards GRANT12418820 (Capadona) og GRANTI01RX003420 (Shoffstall / Capadona), og Research Career Scientist Award # GRANT12635707 (Capadona) fra USA (US) Department of Veterans Affairs Rehabilitation Research and Development Service. I tillegg ble dette arbeidet også delvis støttet av National Institute of Health, National Institute of Neurological Disorders and Stroke GRANT12635723 (Capadona), og National Institute for Biomedical Imaging and Bioengineering, T32EB004314, (Capadona / Kirsch). Dette materialet er basert på arbeid støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No. GRANT12635723. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette materialet er de av forfatterne (e) og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate Buffered Saline Type: Reagent |
VWR | MRGF-6235 | For Evans Blue dilution |
| Aura Software Type: Tool |
Spectral Instruments Imaging | Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems | |
| Buprenorphine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) Type: Tool |
Stoelting | 58640-1 | |
| Carprofen Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Cefazolin Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Evans Blue Dye Type: Reagent |
Millipore Sigma | E2129 | Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline |
| Isoflurane Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| IVIS Lumina II Type: Tool |
Perkin Elmer | CLS136334 | IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market |
| Jenco Linearizing Thermometer Type: Tool |
Jenco | 765JF | For Thermocouple setup |
| Ketamine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| LivingImage Type: Tool |
Perkin Elmer | Software for IVIS Lumina III | |
| Marcaine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Neurostar Software Type: Tool |
Stoelting | Comes with surgical robot purchase | |
| Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor Type: Tool |
Kent Scientific | PS-03 | Used to monitor vitals |
| PrismPlus mice Type: Animal |
Jackson Labortory | 031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old | Animals used for the study |
| Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Type: Tool |
Stoelting | 58640 | Main robotic drill with stereotaxic frame |
| Thermocouple Type: Tool |
TC Direct | 206-557 | For Thermocouple setup |
| USB-6008 Multifunction I/O DAQ Type: Tool |
National Instruments | USB-6008 | For Thermocouple setup |
| Xylazine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility |
References
- Kilic, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Frontiers in Physiology. 11, 612678 (2020).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Augustinaite, S., Kuhn, B. Intrinsic optical signal imaging and targeted injections through a chronic cranial window of a head-fixed mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100779 (2021).
- Wang, X., et al. A skull-removed chronic cranial window for ultrasound and photoacoustic imaging of the rodent brain. Frontiers in Neuroscience. 15, 673740 (2021).
- Wang, Y., Xi, L. Chronic cranial window for photoacoustic imaging: a mini review. Visual Computing for Industry, Biomedicine, and Art. 4 (1), 15 (2021).
- Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protocols. 1 (3), 100194 (2020).
- Kunori, N., Takashima, I. An implantable cranial window using a collagen membrane for chronic voltage-sensitive dye imaging. Micromachines. 10 (11), 789 (2019).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 694-701 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sundaram, G. S., et al. Characterization of a brain permeant fluorescent molecule and visualization of Abeta parenchymal plaques, using real-time multiphoton imaging in transgenic mice. Organic Letters. 16 (14), 3640-3643 (2014).
- Spires, T. L., et al. Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. Journal of Neuroscience. 25 (31), 7278-7287 (2005).
- Price, D. L., et al. High-resolution large-scale mosaic imaging using multiphoton microscopy to characterize transgenic mouse models of human neurological disorders. Neuroinformatics. 4 (1), 65-80 (2006).
- Kimchi, E. Y., Kajdasz, S., Bacskai, B. J., Hyman, B. T. Analysis of cerebral amyloid angiopathy in a transgenic mouse model of Alzheimer disease using in vivo multiphoton microscopy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 60 (3), 274-279 (2001).
- Hyman, B. T. The natural history of Alzheimer disease dissected through multiphoton imaging of transgenic mice. Alzheimer Disease and Associated Disorders. 20 (4), 206-209 (2006).
- Korzhova, V., et al. Long-term dynamics of aberrant neuronal activity in awake Alzheimer's disease transgenic mice. Communications Biology. 4 (1), 1368 (2021).
- Chawda, C., McMorrow, R., Gaspar, N., Zambito, G., Mezzanotte, L. Monitoring immune cell function through optical imaging: a review highlighting transgenic mouse models. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 250-263 (2022).
- Courtin, J., et al. A neuronal mechanism for motivational control of behavior. Science. 375 (6576), (2022).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
- Eles, J. R., Vazquez, A. L., Kozai, T. D. Y., Cui, X. T. Meningeal inflammatory response and fibrous tissue remodeling around intracortical implants: An in vivo two-photon imaging study. Biomaterials. 195, 111-123 (2019).
- Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
- Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
- Shoffstall, A. J., et al. Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy: implications for intracortical recording microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 034001 (2018).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
- Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Scientific Reports. 4, 6588 (2014).
- Goss-Varley, M., et al. Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: Implications on potential considerations to Brain Computer Interfacing and Human Augmentation. Scientific Reports. 7 (1), 15254 (2017).
- Oomoto, I., et al. Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection. STAR Protocols. 2 (4), 101007 (2021).
- Dougherty, J. D., Zhang, J., Feng, H., Gong, S., Heintz, N. Mouse transgenesis in a single locus with independent regulation for multiple fluorophores. PLoS One. 7 (7), 40511 (2012).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (3), 4106-4114 (2000).
- Kiyatkin, E. A., Sharma, H. S. Permeability of the blood-brain barrier depends on brain temperature. Neuroscience. 161 (3), 926-939 (2009).
- Eriksson, A. R., Albrektsson, T. Temperature threshold levels for heat-induced bone tissue injury: a vital-microscopic study in the rabbit. The Journal of Prosthetic Dentistry. 50 (1), 101-107 (1983).
- Bonfield, W., Li, C. H. The temperature dependence of the deformation of bone. Journal of Biomechanics. 1 (4), 323-329 (1968).
- Hrapkiewicz, K., Medina, L. Clinical Laboratory Animal Medicine, second ed. , Blackwell Publishing. Ames Iowa. (2007).
- McLean, R., Moritz, A. R., Roos, A. Studies of thermal Injury. VI. Hyperpotassemia caused by cutaneous exposure to excessive heat. Journal of Clinical Investigations. 26 (3), 497-504 (1947).
- Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments. (123), e52642 (2017).
