Methodenartikel

Protokolle für CRISPR/Cas9-Mutagenese der Orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis

DOI:

10.3791/64195

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28. September 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Sustainable Forest Ecosystem Management - Ministry of Education, Northeast Forestry University, 2Shenzhen Branch, Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Genome Analysis Laboratory of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel stellt die Schritt-für-Schritt-Protokolle für die CRISPR/Cas9-Mutagenese der orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis vor. Detaillierte Schritte, die von diesem standardisierten Protokoll bereitgestellt werden, werden als nützlicher Leitfaden für die Erzeugung mutierter Fliegen für funktionelle Genstudien in B. dorsalis dienen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die orientalische Fruchtfliege, Bactrocera dorsalis, ist eine hochinvasive und anpassungsfähige Schädlingsart, die Zitrusfrüchte und über 150 andere Obstkulturen weltweit schädigt. Da erwachsene Fruchtfliegen eine große Flugkapazität haben und Weibchen ihre Eier unter die Schalen von Früchten legen, schneiden Insektizide, die direkten Kontakt mit dem Schädling erfordern, auf dem Feld normalerweise schlecht ab. Mit der Entwicklung molekularbiologischer Werkzeuge und Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie versuchen viele Wissenschaftler, umweltfreundliche Schädlingsbekämpfungsstrategien zu entwickeln. Dazu gehören RNAi- oder Gen-Editing-basierte Pestizide, die Gene (molekulare Ziele), wie olfaktorische Gene, die am Suchverhalten beteiligt sind, in verschiedenen Insektenschädlingen herunterregulieren oder zum Schweigen bringen. Um diese Strategien für die Bekämpfung orientalischer Fruchtfliegen anzupassen, sind effektive Methoden zur funktionellen Genforschung erforderlich. Gene mit kritischen Funktionen beim Überleben und der Fortpflanzung von B. dorsalis dienen als gute molekulare Ziele für Gen-Knockdown und/oder Silencing. Das CRISPR/Cas9-System ist eine zuverlässige Technik zur Genbearbeitung, insbesondere bei Insekten. Dieser Artikel stellt eine systematische Methode für die CRISPR/Cas9-Mutagenese von B. dorsalis vor, einschließlich des Designs und der Synthese von Guide-RNAs, der Entnahme von Embryonen, der Embryoinjektion, der Insektenaufzucht und des Mutantenscreenings. Diese Protokolle dienen als nützlicher Leitfaden für die Erzeugung mutierter Fliegen für Forscher, die an funktionellen Genstudien in B. dorsalis interessiert sind.

Einleitung

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Die orientalische Fruchtfliege, Bactrocera dorsalis , ist eine kosmopolitische Insektenschädlingsart, die Schäden an über 150 Arten von Obstkulturen verursacht, darunter Guave, Mango, Eugenia spp., Surinam-Kirsche, Zitrusfrüchte, Mispel und Papaya1. Der Schaden allein in der Provinz Guangdong (China) wird auf über 200 Millionen Yuan geschätzt. Erwachsene Weibchen legen ihre Eier unter die Haut reifender oder gereifter Früchte, was zu Verfall und Zerfall der Frucht führt, was die Fruchtqualität und den Gesamtertrag der Ernte verringert2. Da erwachsene Fruchtfliegen eine große Flugkapazität haben und sich ihre Larven in die Fruchthaut bohren, schneiden Insektizide, die direkten Kontakt mit dem Schädling erfordern, auf dem Feld schlecht ab. Darüber hinaus hat der umfangreiche Einsatz von Insektiziden die Resistenz von B. dorsalis gegen verschiedene landwirtschaftliche Chemikalien erhöht, was die Bekämpfung dieser schädlichen Schädlinge noch schwieriger macht3. Daher ist die Entwicklung effektiver und umweltfreundlicher Schädlingsbekämpfungsstrategien dringend erforderlich.

In jüngster Zeit versuchen Wissenschaftler mit der Entwicklung molekularbiologischer Werkzeuge und Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien, umweltfreundliche Schädlingsbekämpfungsstrategien wie RNAi zu entwickeln, die auf die Funktionalität wichtiger Gene (molekulare Ziele) verschiedener Schadinsekten abzielen. Gene, die für das Überleben und die Vermehrung des Schädlings entscheidend sind, können durch funktionelle Genstudien identifiziert werden und dienen weiterhin als potenzielle molekulare Ziele für die Verbesserung spezifischer und umweltfreundlicher Schädlingsbekämpfungsinstrumente4. Um solche Strategien an die Bekämpfung orientalischer Fruchtfliegen anzupassen, sind effektive Methoden zur funktionellen Genforschung erforderlich.

Das CRISPR/Cas-Endonuklease-System (Clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-assoziiert) wurde zunächst in Bakterien und Archaeen entdeckt und erwies sich als adaptiver Mechanismus, der an der Erkennung und dem Abbau von intrazellulärer Fremd-DNA beteiligt ist, wie sie durch die Infektion von Bakteriophagen eingeführt wird5. Im Typ-II-CRISPR-System wird die Cas9-Endonuklease von kleinen assoziierten RNAs (crRNA und tracrRNA) geleitet, um die eindringende DNA 6,7,8 zu spalten und ist zu einem der am häufigsten verwendeten Werkzeuge für die Gen-Editierung geworden 9,10,11,12. Da das CRISPR/Cas9-System mehrere Vorteile hat, wie z.B. eine hohe Effizienz der Gen-Silencing und niedrige Kosten, wurde es bereits für die Gen-Editierung bei verschiedenen Insektenarten eingesetzt, darunter Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 und Bombyx mori16. Bei B. dorsalis wurden Gene, die mit Körperfarbe, Flügeldimorphismus und Geschlechtsbestimmung zusammenhängen, erfolgreich mit CRISPR/Cas917,18,19 ausgeschaltet. Die detaillierten Verfahren zur Anwendung von CRISPR/Cas9 bei diesem Insekt sind jedoch noch unvollständig. Darüber hinaus sind einige Schritte, die von Forschern für die Genbearbeitung von B. dorsalis bereitgestellt wurden, ebenfalls vielfältig und bedürfen einer Standardisierung. Zum Beispiel waren die Formen von Cas9 in den veröffentlichten Referenzen17,18,19 unterschiedlich.

Dieser Artikel bietet eine systematische Methode für die Mutagenese von B. dorsalis unter Verwendung des CRISPR / Cas9-Systems, einschließlich des Designs und der Synthese von Guide-RNAs, der Sammlung von Embryonen, der Embryoinjektion, der Insektenaufzucht und des Mutantenscreenings. Dieses Protokoll wird Forschern, die an den funktionellen Genstudien an B. dorsalis interessiert sind, als nützlicher Leitfaden für die Erzeugung mutierter Fliegen dienen.

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Protokoll

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1. Target-Design und in vitro Synthese von sgRNA

  1. Vorhersage der Struktur von Zielgenen von Interesse und Bestimmung der Grenzen zwischen Exons und Introns durch bioinformatische Analyse des B. dorsalis-Genoms (hier verwendete Softwareanwendungen sind in der Materialtabelle aufgeführt).
    HINWEIS: BLAT20 wurde verwendet, um potenzielle Genorte im Genom zu suchen. Die hochwertigen RNA-seq-Lesevorgänge (Transkriptom) wurden mit Hisat221 an die erworbenen Genloci angepasst. Samtools22 wurde verwendet, um die sortierten BAM-Dateien zu generieren. Die sortierten BAM-Dateien wurden in Stringtie223 eingegeben, um die Assemblierungstranskripte bereitzustellen. Die zusammengesetzten Transkripte und Genloci Informationen wurden von Transdecoder24 kombiniert. Die mit Transdecoder gewonnenen Ergebnisse wurden in IGV-Werkzeugen25 visualisiert und die Grenzen zwischen Exons und Introns konnten bestimmt werden.
  2. Identifizieren Sie die geeigneten Zielregionen innerhalb der Zielgenstelle des Kandidaten. Die Gesamtlänge muss für eine bequemere Sequenzierung weniger als 750 bp betragen (Abbildung 1B). Design spezifischer Primer zur Amplifikation des Zielgebiets aus Wildtyp-genomischer DNA mittels PCR (Abbildung 1B) (Primer: F-Primer: AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, R-Primer: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Klonen Sie die PCR-Produkte in einen stumpfen Endvektor 26 und wählen Sie20 einzelne Bakterienkolonien für die Sequenzierung aus, um zu bestimmen, wie konserviert die Zielregion in den Laborinsektenpopulationen ist.
  3. Eine typische Zielstelle enthält ein Drei-Nukleotid-Sequenzmotiv (NGG oder CCN) und eine 20-bp-Sequenz neben den NGG- oder CCN-Motiven (20 bp-NGG oder CCN-20 bp). Sprengen Sie die Kandidatenzielstellen gegen das B. dorsalis-Genom und stellen Sie sicher, dass die vorhergesagte Effizienz hoch genug und die Off-Targeting-Rate niedrig ist; Mehrere Open-Source-Softwareprogramme können dies automatisch vorhersagen. In diesem Protokoll wird sgRNAcas9-AI27 verwendet, um die optimalen Ziele auszuwählen und zu bewerten. Details zur Verwendung finden Sie im Handbuch für diese Software.
    HINWEIS: Mögliche Zielstellen in der Nähe der 5' UTR des Zielgens und 1-2 Gs zu Beginn der 20 bp Sequenz werden bevorzugt. Um eine große Deletion zu erreichen, die durch PCR gefolgt von Agarosegelelektrophorese identifiziert wird, wird empfohlen, zwei Targets28 zu entwerfen, die durch über 100 bp getrennt sind (Abbildung 1C).
  4. Verwenden Sie das kommerziell erhältliche gRNA-Synthesekit, um die entworfene sgRNA zu erzeugen. Führen Sie jeden Schritt gemäß dem Benutzerhandbuch aus. Resuspendieren Sie das gRNA-Produkt in nukleasefreiem Wasser, quantifizieren Sie die Konzentration mit einem UV-Vis-Spektralphotometer und lagern Sie es vor der Verwendung bei -80 °C (die Konzentration der erfolgreich synthetisierten einzelnen gRNA [10 μL] mit dem hier verwendeten Kit beträgt etwa 4000-6000 ng/μL oder sogar noch höher).
    HINWEIS: Obwohl die Erzeugung der mutierten Fliegen der erste Schritt für jeden Forscher ist, ist die geeignete Negativkontrolle für nachgeschaltete Experimente / Analysen von entscheidender Bedeutung. Die Generierung dieser Kontrollen zusammen mit den Mutanten spart Forschern Zeit und Mühe. Stellen Sie beispielsweise verschlüsselte sgRNA als Negativkontrolle ein.

2. Embryonenentnahme und -vorbereitung

  1. B. dorsalis pupae in Plastikkäfige geben. Geben Sie eine Mischung aus Zucker und Hefe (1:1) als Nahrung zusammen mit einer Wasserquelle an, nachdem die Erwachsenen geschlossen haben (Abbildung 2A, B). Die Aufzuchtbedingungen sind 55% relative Luftfeuchtigkeit (rF), 26,5 °C und ein 14:10 L/D-Zyklus (Licht an um sechs Uhr morgens, Licht aus um acht Uhr abends).
  2. Die meisten Erwachsenen erreichen die Geschlechtsreife 10 Tage nach dem Auftauchen. Stellen Sie eine geeignete Umgebung bereit, um erwachsenen Fliegen zu helfen, sich so weit wie möglich zu paaren. Verwenden Sie idealerweise einen Lichtständer mit einem Licht von 30-50 Lux. Dies kann die Fruchtbarkeit der Weibchen verbessern und somit die Effizienz der Embryonensammlung verbessern.
    HINWEIS: Wenn Sie die Erwachsenen (im Alter von 5-6 Tagen nach dem Schlüpfen) in eine schwach beleuchtete Umgebung (<100 Lux) bringen, kann dies die Paarung fördern. Im Allgemeinen findet der Höhepunkt der Eiablage um 15:00 Uhr statt (14:10/L:D, Licht um 06:00 Uhr, Licht aus um 20:00 Uhr); Um genügend Embryonen zu erhalten, wird empfohlen, Eiablagekammern 30 Minuten vor 15:00 Uhr in die Käfige zu legen.
  3. Legen Sie eine 200-mesh-Gaze in die Eiablagekammer, 1-2 mm vom Kammerdeckel entfernt. Dies wird dazu beitragen, so viele Embryonen wie möglich zu erhalten.
    HINWEIS: Lassen Sie die Embryonen nicht in Orangensaft einweichen oder mit Gaze eingerieben, da dies die Überlebensrate der Embryonen erheblich verringern kann.
  4. Stellen Sie eine neue Eiablagekammer in den Käfig, wenn der Mikroinjektionsaufbau fertig ist. Sammeln Sie die Embryonen alle 10 Minuten mit einer feinen nassen Bürste und richten Sie sie dann auf einer selbstgebauten Injektionsplatte aus (Plexiglas mit einer Länge von 55 mm, einer Breite von 13,75 mm und einer Höhe von 5 mm, eine 45 mm x 5 mm x 0,3 mm flache Rille wird in der Mitte geöffnet, um die Eiablage zu erleichtern). Wenn die Embryonen einen hohen Innendruck haben, ist eine leichte Austrocknung bei <10% RH für 10 min optional. Tauchen Sie die Embryonen während der Injektion in Halogenkohlenstofföl, um eine weitere Austrocknung zu vermeiden (Abbildung 2C).

3. Mikroinjektion des Embryos

  1. Bereiten Sie die Glasinjektionsnadel mit einem Mikropipettenzieher vor.
    HINWEIS: Das Einstellen der Parameter nach dem Benutzerhandbuch ist wichtig. In diesen Protokollen können verschiedene Nadelformen mit den Parametern hergestellt werden, die im Handbuch des Mikropipettenziehers vorgeschlagen werden. Die Glaskapillare muss so sauber wie möglich sein, um zu verhindern, dass Staub die Nadel verstopft.
  2. Bereiten Sie die funktionierende Lösung vor. Das Cas9-Protein und die entsprechende sgRNA werden auf folgende Arbeitskonzentrationen gemischt: sgRNA, 300 ng/μL; Cas9-Protein, 150 ng/μL. Fügen Sie der Mischung 1 μL Phenolrot hinzu, um als bequeme Möglichkeit zur Markierung injizierter Embryonen zu dienen. Die vorbereitete Mischung auf Eis legen, um einen Abbau der sgRNA zu vermeiden.
    HINWEIS: Verwenden Sie nukleasefreie Pipettenspitzen und PCR-Röhrchen. Die Konzentration des Cas9-Proteins muss kleiner oder gleich 150 ng/μL sein; Höhere Konzentrationen sind toxisch und verringern die Überlebensrate des Embryos erheblich. Cas9 könnte auch im DNA- oder mRNA-Format geliefert werden, um eine erfolgreiche Genbearbeitung zu erreichen17,19. In diesem Protokoll wird das Cas9-Protein empfohlen, da mRNAs anfällig für den Abbau sind und die Expression des Cas9-Proteins aus Plasmid-DNA Zeit für die Transkription und Translation benötigt.
  3. Stellen Sie die Parameter für den Injektor ein. Das Ausgangsprogramm ist Pi-500 hPa, Ti-0,5 s und PC-200 hPa. Passen Sie diese Parameter während der Mikroinjektion nach Bedarf weiter an.
  4. 3 μL der Mischung in die Injektionsnadel geben. Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen, die möglicherweise die Nadel verstopfen können. Öffnen Sie die Nadel mit einem Microgrinder.
  5. Verbinden Sie die Nadel gemäß der Bedienungsanleitung mit dem Mikromanipulator (Abbildung 2E).
  6. Stellen Sie den Teller mit aufgereihten Embryonen auf den objektiven Tisch. Stellen Sie die Position der Mikropipette unter einem feinen Lichtmikroskop ein und stellen Sie die Mikropipette und den Embryo auf die gleiche Ebene. Stellen Sie die Tröpfchenlautstärke ein, indem Sie das Pedal drücken. 1/10 des Embryonenvolumens wird empfohlen.
  7. Führen Sie die Nadelspitze in den hinteren (pflanzlichen Pol) des Embryos ein. Geben Sie die Mischungen in den Embryo ab, indem Sie das Pedal vom Injektor drücken. Wenn Phenolrot hinzugefügt wird, wird sofort eine leicht rötliche Farbe beobachtet.
    HINWEIS: Ein kleines Volumen zytoplasmatischer Rückfluss aus der Lochblende verringert die Überlebensrate des Embryos nicht. Die Injektion von 200 Embryonen reicht für eine erfolgreiche Mutagenese eines Gens aus. Die Zugabe von mehr Halogenkohlenstofföl zum Eintauchen der Embryonen kann eine weitere Austrocknung verhindern. Die Injektion muss vor der Polzellbildung durchgeführt werden, wodurch sichergestellt wird, dass jede Mutation effizient vererbt werden kann.

4. Insektenaufzucht nach der Injektion

  1. Legen Sie die Injektionsplatte mit den injizierten Embryonen in eine künstliche Klimakammer, die bei 55% relative Luftfeuchtigkeit, 26,5 °C und einem 14:10 l / D-Zyklus gehalten wird (Licht um sechs Uhr morgens, Licht aus um acht Uhr abends).
  2. Nach der Injektion dauert die Bildung des Embryos in der Regel 24 Stunden und 36 Stunden bis zum Schlüpfen. Verwenden Sie eine feine Bürste, um die Larven auf eine vorbereitete Larvendiät zu übertragen. Sammeln Sie Larven drei- bis viermal täglich bis keine Larven mehr schlüpfen. Im Allgemeinen brauchen Larven 2-3 Tage, um das Schlüpfen zu beenden und sich innerhalb von 7 Tagen zu verpuppen.
    HINWEIS: Zur Fütterung der Larven wurde eine Maisdiät verwendet. Das Rezept enthält 150 g Maismehl, 150 g Banane, 0,6 g Natriumbenzoat, 30 g Hefe, 30 g Saccharose, 30 g Papiertuch, 1,2 ml Salzsäure und 300 ml Wasser29. Minimieren Sie die Zeit, in der Larven in Öl verbleiben (<2 h). Bewegen Sie die Larven sofort nach dem Schlüpfen so weit wie möglich auf das Futter. Dies kann die Überlebens- und Verpuppungsraten deutlich erhöhen. Geben Sie nicht zu viel Diät (eine Diät mit 2/3 einer 90 mm Petrischale reicht für 30 Larven); Andernfalls wird es schimmelig und verringert die Überlebensrate der Larven.
  3. Setzen Sie die reifen Larven in den nassen Sand, um sich zu verpuppen. Die Verpuppungsphase dauert etwa 10 Tage. Bewegen Sie die Puppen in Plastikkäfige, bevor die Eklosion beginnt.

5. Mutanten-Screening

  1. Ein Flussdiagramm des Mutantenscreenings ist in Abbildung 3A dargestellt. Kreuzen Sie G0-Erwachsene, die durch Mikroinjektion mit Wildtyp-Erwachsenen erhalten wurden, um heterozygote Linien zu erhalten. Überprüfen Sie die Art der Mutationen, die die Nachkommen (G1) tragen, durch Genotypisierung.
  2. Selbstkreuzung von G1 mit dem gleichen mutierten Genotyp, um homozygote Linien in G2 zu erhalten. Wenn die Genotypen der Mutanten in G1 völlig unterschiedlich sind, kreuzen Sie die Heterozygoten mit Wildtypfliegen. Homozygote Linien werden normalerweise in G3 erhalten. Pflegen Sie zwei oder drei homozygote Linien für nachfolgende Phänotypisierungsexperimente.
  3. Verwenden Sie die genomische DNA eines frischen Pupariums oder eines einzelnen Mittelbeins einzelner Erwachsener, um eine Genotypisierung durchzuführen. Entwerfen Sie spezifische Primer, um den Zielbereich zu verstärken; Die Primer müssen mindestens 50 bps stromaufwärts und stromabwärts der Zielstelle einstellen. Weitere Informationen finden Sie in Schritt 1.2.
    HINWEIS: Da die Menge der DNA in einem Puparium extrem gering ist, werden kommerziell erhältliche DNA-Extraktionskits empfohlen.
  4. Die PCR wird unter den folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: 98 °C für 3 min, gefolgt von 35 Zyklen von 98 °C für 10 s, 15 s bei einer für die ausgelegten Primer geeigneten Glühtemperatur, 72 °C für 35 s, gefolgt von einer endgültigen Verlängerung von 72 °C für 10 min.
  5. Sequenzieren Sie die gereinigten PCR-Produkte. Wenn mehrere überlappende Peaks neben der Zielstelle erkannt werden (Abbildung 3B), ist eine erfolgreiche Mutagenese aufgetreten. Subklonen Sie die gereinigten PCR-Produkte in einen stumpfen Vektor und wählen Sie 10 einzelne Bakterienkolonien für die Sequenzierung aus, um den Genotyp der Mutanten zu überprüfen. Pflegen Sie die Linien mit Frameshift-Mutationen und vorzeitigen Translationsabbrüchen (Abbildung 3C).
    HINWEIS: Es ist keine Einzelklonsequenzierung erforderlich, um den Genotyp von G0-Individuen zu überprüfen. Sequenzieren Sie einfach die PCR-Produkte und pflegen Sie die Individuen mit offensichtlichen multiplen Überlappungspeaks neben der Zielstelle. Nach der ersten Injektion wird empfohlen, 10 Embryonen zur Extraktion genomischer DNA auszuwählen und die PCR-Produkte basierend auf den Standards in Schritt 5.3 zu sequenzieren. Dies kann helfen, Mutationsraten im Voraus vorherzusagen. In dieser Studie wurde die Sanger-Sequenzierung zur Bestimmung des Genotyps von einer Sequenzierungsfirma durchgeführt.

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Ergebnisse

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Dieses Protokoll enthält detaillierte Schritte für die Entwicklung von B. dorsalis-Mutanten unter Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie, einschließlich repräsentativer Ergebnisse der gDNA-Selektion, der Entnahme von Embryonen und der Mikroinjektion, der Insektenpflege und des Mutantenscreenings.

Das Beispiel der Zielstelle des ausgewählten Gens befindet sich im dritten Exon (Abbildung 1C). Diese Stelle ist hoch konserviert, und eine einzelne Bande wurde ...

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Diskussion

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Das CRISPR/Cas9-System ist das am weitesten verbreitete Gen-Editing-Tool und hat verschiedene Anwendungen, wie Gen-Threpy30, Pflanzenzüchtung 31 und grundlegende Studien der Genfunktionen32. Dieses System wurde bereits für die Gen-Editierung bei verschiedenen Insektenarten eingesetzt und diente als effektives Werkzeug für funktionelle Genstudien bei Schädlingen. Die Protokolle, die wir hier vorstellen, standardisieren das Verfahren des Designs und de...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde vom Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272) und Sonderfonds für wissenschaftlich-technologische Innovation und industrielle Entwicklung des Shenzhen Dapeng New District (Grant No. PT202101-02) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6x DNA Loading BufferTransGen BiotechGH101-01
Künstliche KlimakammerShangHai BluePardMGC-350P
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction KitAxygenAP-MN-MS-GDNA-250G
BLATNANA Zur Suche nach potentiellen Genorten im Genom
KapillarglasWPI 1B100F-4
Eppendorf InjectMan 4 MikromanipulatorEppendorfInjectMan 4
GeneArt Precision gRNA Synthesis KitThermo Fisher ScientificA29377
Hisat2NANA ZumAusrichten des Transkriptoms an die erworbenen Genloci
IGVNANAZur Visualisierung der Ergebnisse aus dem Transdecoder
MicrogrinderNARISHIGEEG-401
Olympus MikroskopOlympus CorporationSZ2-ILST
pEASY-Blunt KlonierungskitTransGen BiotechCB101-02https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
PhenolrotlösungSigma-AldrichP0290-100ML
Pipetten-Kochbuch 2018 P-97 & P-1000 Mikropipetten-AbzieherInstrument Unternehmen https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (Premix)Takara Biomedical TechnologyR040A
SAMtoolsNANA ZumGenerieren der sortierten bam-Dateien
sgRNAcas9-AINANAsgRNA design
http://123.57.239.141:8080/home
Sutter Micropipette Puller Sutter Instrumenten-Unternehmen P-97
Trans2K DNA-MarkerTransGen BiotechBM101-02
TransdecoderNANA ZurKombination der Ergebnisse von Assemblierungstranskripten und Genloci Information
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 Protein v2Thermo FisherScientific A36498
Ultra-Spuren-biologisch DetektorThermo Fisher ScientificNanodrop 2000C

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