Dieser Artikel stellt die Schritt-für-Schritt-Protokolle für die CRISPR/Cas9-Mutagenese der orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis vor. Detaillierte Schritte, die von diesem standardisierten Protokoll bereitgestellt werden, werden als nützlicher Leitfaden für die Erzeugung mutierter Fliegen für funktionelle Genstudien in B. dorsalis dienen.
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Methodenartikel
Protokolle für CRISPR/Cas9-Mutagenese der Orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die orientalische Fruchtfliege, Bactrocera dorsalis, ist eine hochinvasive und anpassungsfähige Schädlingsart, die Zitrusfrüchte und über 150 andere Obstkulturen weltweit schädigt. Da erwachsene Fruchtfliegen eine große Flugkapazität haben und Weibchen ihre Eier unter die Schalen von Früchten legen, schneiden Insektizide, die direkten Kontakt mit dem Schädling erfordern, auf dem Feld normalerweise schlecht ab. Mit der Entwicklung molekularbiologischer Werkzeuge und Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie versuchen viele Wissenschaftler, umweltfreundliche Schädlingsbekämpfungsstrategien zu entwickeln. Dazu gehören RNAi- oder Gen-Editing-basierte Pestizide, die Gene (molekulare Ziele), wie olfaktorische Gene, die am Suchverhalten beteiligt sind, in verschiedenen Insektenschädlingen herunterregulieren oder zum Schweigen bringen. Um diese Strategien für die Bekämpfung orientalischer Fruchtfliegen anzupassen, sind effektive Methoden zur funktionellen Genforschung erforderlich. Gene mit kritischen Funktionen beim Überleben und der Fortpflanzung von B. dorsalis dienen als gute molekulare Ziele für Gen-Knockdown und/oder Silencing. Das CRISPR/Cas9-System ist eine zuverlässige Technik zur Genbearbeitung, insbesondere bei Insekten. Dieser Artikel stellt eine systematische Methode für die CRISPR/Cas9-Mutagenese von B. dorsalis vor, einschließlich des Designs und der Synthese von Guide-RNAs, der Entnahme von Embryonen, der Embryoinjektion, der Insektenaufzucht und des Mutantenscreenings. Diese Protokolle dienen als nützlicher Leitfaden für die Erzeugung mutierter Fliegen für Forscher, die an funktionellen Genstudien in B. dorsalis interessiert sind.
Einleitung
Die orientalische Fruchtfliege, Bactrocera dorsalis , ist eine kosmopolitische Insektenschädlingsart, die Schäden an über 150 Arten von Obstkulturen verursacht, darunter Guave, Mango, Eugenia spp., Surinam-Kirsche, Zitrusfrüchte, Mispel und Papaya1. Der Schaden allein in der Provinz Guangdong (China) wird auf über 200 Millionen Yuan geschätzt. Erwachsene Weibchen legen ihre Eier unter die Haut reifender oder gereifter Früchte, was zu Verfall und Zerfall der Frucht führt, was die Fruchtqualität und den Gesamtertrag der Ernte verringert2. Da erwachsene Fruchtfliegen eine große Flugkapazität haben und sich ihre Lar....
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Protokoll
1. Target-Design und in vitro Synthese von sgRNA
- Vorhersage der Struktur von Zielgenen von Interesse und Bestimmung der Grenzen zwischen Exons und Introns durch bioinformatische Analyse des B. dorsalis-Genoms (hier verwendete Softwareanwendungen sind in der Materialtabelle aufgeführt).
HINWEIS: BLAT20 wurde verwendet, um potenzielle Genorte im Genom zu suchen. Die hochwertigen RNA-seq-Lesevorgänge (Transkriptom) wurden mit Hisat221 an die erworbenen Genloci angepasst. Samtools22 wurde verwendet, um die sortierten BAM-Dateie....
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Ergebnisse
Dieses Protokoll enthält detaillierte Schritte für die Entwicklung von B. dorsalis-Mutanten unter Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie, einschließlich repräsentativer Ergebnisse der gDNA-Selektion, der Entnahme von Embryonen und der Mikroinjektion, der Insektenpflege und des Mutantenscreenings.
Das Beispiel der Zielstelle des ausgewählten Gens befindet sich im dritten Exon (Abbildung 1C). Diese Stelle ist hoch konserviert, und eine einzelne Bande wurde .......
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Diskussion
Das CRISPR/Cas9-System ist das am weitesten verbreitete Gen-Editing-Tool und hat verschiedene Anwendungen, wie Gen-Threpy30, Pflanzenzüchtung 31 und grundlegende Studien der Genfunktionen32. Dieses System wurde bereits für die Gen-Editierung bei verschiedenen Insektenarten eingesetzt und diente als effektives Werkzeug für funktionelle Genstudien bei Schädlingen. Die Protokolle, die wir hier vorstellen, standardisieren das Verfahren des Designs und de.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272) und Sonderfonds für wissenschaftlich-technologische Innovation und industrielle Entwicklung des Shenzhen Dapeng New District (Grant No. PT202101-02) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Künstliche Klimakammer | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA Zur Suche nach potentiellen Genorten im Genom | |
| Kapillarglas | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 Mikromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA Zum | Ausrichten des Transkriptoms an die erworbenen Genloci |
| IGV | NA | NA | Zur Visualisierung der Ergebnisse aus dem Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Mikroskop | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Klonierungskit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenolrotlösung | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipetten-Kochbuch 2018 P-97 & P-1000 Mikropipetten-Abzieher | Instrument Unternehmen | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA Zum | Generieren der sortierten bam-Dateien |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrumenten-Unternehmen | P-97 | |
| Trans2K DNA-Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA Zur | Kombination der Ergebnisse von Assemblierungstranskripten und Genloci Information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher | Scientific A36498 | |
| Ultra-Spuren-biologisch Detektor | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
Referenzen
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. P....
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Nachdrucke und Genehmigungen
