Herstellung von zytoplasmatischen und nukleären langen RNAs aus primären und kultivierten Zellen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll bietet eine effiziente und flexible Methode, um RNA aus nukleären und zytoplasmatischen Fraktionen unter Verwendung kultivierter Zellen zu isolieren und dann mittels qPCR zu validieren. Dies dient effektiv als Ersatz für andere RNA-Präparationskits.

Zusammenfassung

Die Trennung intrazellulärer Komponenten ist seit vielen Jahren ein Schlüsselwerkzeug in der Zellbiologie und konnte nützliche Erkenntnisse darüber liefern, wie sich ihre Lage auf ihre Funktion auswirken kann. Insbesondere die Trennung von nukleärer und zytoplasmatischer RNA ist im Zusammenhang mit Krebszellen und der Suche nach neuen Angriffspunkten für Medikamente wichtig geworden. Der Kauf von Kits für die nukleär-zytoplasmatische RNA-Extraktion kann kostspielig sein, wenn viele der benötigten Materialien in einer typischen Laborumgebung gefunden werden können. Mit dem vorliegenden Verfahren, das teurere Kits oder andere zeitaufwändige Prozesse ersetzen kann, werden nur ein hausgemachter Lysepuffer, eine Tischzentrifuge und RNA-Isolationsreinigungssäulen benötigt, um nukleare und zytoplasmatische RNA zu isolieren. Lysepuffer wird verwendet, um die äußere Membran der Zelle sanft zu lysieren, ohne die Integrität der Kernhülle zu beeinträchtigen, wodurch ihre intrazellulären Komponenten freigesetzt werden können. Dann können die Kerne durch einen einfachen Zentrifugationsschritt isoliert werden, da sie eine höhere Dichte als die Lyselösung besitzen. Zentrifugation wird verwendet, um diese Bereiche basierend auf ihren Dichteunterschieden zu trennen, um subzelluläre Elemente im Zellkern von denen im Zytoplasma zu isolieren. Sobald die Zentrifugation die verschiedenen Komponenten isoliert hat, wird ein RNA-Clean-up-Kit verwendet, um den RNA-Gehalt zu reinigen, und es wird eine qPCR durchgeführt, um die Trennqualität zu validieren, die durch die Menge an nukleärer und zytoplasmatischer RNA in den verschiedenen Fraktionen quantifiziert wird. Es wurden statistisch signifikante Trennungsgrade erreicht, was die Wirksamkeit des Protokolls verdeutlicht. Darüber hinaus kann dieses System für die Isolierung verschiedener RNA-Typen (Gesamt-, Klein-RNA usw.) angepasst werden, was eine gezielte Untersuchung von Zytoplasma-Kern-Wechselwirkungen ermöglicht und zum Verständnis der Unterschiede in der Funktion von RNA beiträgt, die sich im Zellkern und im Zytoplasma befindet.

Einleitung

Die zelluläre Fraktionierung in subzelluläre Komponenten ermöglicht die Isolierung und Untersuchung definierter biochemischer Domänen und hilft bei der Bestimmung der Lokalisierung spezifischer zellulärer Prozesse und wie sich dies auf ihre Funktion auswirken kann¹. Die Isolierung von RNA an verschiedenen intrazellulären Stellen kann eine verbesserte Genauigkeit der genetischen und biochemischen Analyse von Ereignissen auf Transkriptionsebene und anderen Wechselwirkungen zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma ermöglichen, was als Hauptzweck des aktuellen Protokolls² dient. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Isol....

Protokoll

Für die vorliegende Studie werden K562-Zellen verwendet. Dieses Protokoll wurde für 1 x 10,^6-5 x 10,⁶ Millionen Zellen optimiert. Das Verfahren kann jedoch für größere Zellmengen skaliert werden, indem die Volumina entsprechend erhöht werden.

1. Herstellung des 0,25-fachen Lysepuffers

1. Bereiten Sie 0,25-fachen Lysepuffer vor, indem Sie die folgenden Komponenten in Tabelle 1A mischen.
   HINWEIS: Für die Proben werden ca. 300 μl 0,25-facher Lysepuffer benötigt. Empfohlenes Volumen = Anzahl der Proben x 300 μl.

2. Trennung von Kern- und Zy....

Ergebnisse

Um sicherzustellen, dass eine nukleare und zytoplasmatische Isolierung erreicht wurde, wurde eine qPCR durchgeführt, um die Ergebnisse zu validieren. Dabei wurden Primer verwendet, die für die interessierende Region spezifisch sind, um die nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus zu demonstrieren. In dieser Studie wurden MALAT1 und TUG1 als nukleäre bzw. zytoplasmatische Primer verwendet. Zusammen ermöglichen sie den Nachweis eines hohen Niveaus der Kernfraktionierung mit MALAT1 als Positivkontrolle für Ker.......

Diskussion

Während des gesamten Protokolls wurden einige Schritte unternommen, um die Elemente so zu optimieren, dass sie für die interessierende Zelllinie am effektivsten sind. Während die Schritte innerhalb des Protokolls relativ einfach sind, können Analysen und kleinere Anpassungen bei kritischen Aspekten des Protokolls erforderlich sein. Der kritischste Schritt im Protokoll besteht darin, die Konzentration des Lysepuffers auf eine geeignete Konzentration zu ändern, die auf der interessierenden Zelllinie und dem zellulären Ziel.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	Das Agilent TapeStation-System ist eine automatisierte Elektrophoreselösung für die Qualitätskontrolle von DNA- und RNA-Proben.
0,5 % Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Wird bei der Herstellung von Lysepuffer
50 mM verwendet, Tris-Cl pH 8,0	Thermo-Fischer	15568025	Wird bei der Herstellung von Lysepuffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Wird zur Bestätigung der Kernfraktion verwendet.
MicroAmp Optical 96-Well-Reaktionsplatte mit Barcode	Thermo-Fischer	4326659	Die Applied Biosystems MicroAmp Optische 96-Well-Reaktionsplatte mit Barcode ist optimiert, um eine unübertroffene Temperaturgenauigkeit und Gleichmäßigkeit für eine schnelle und effiziente PCR-Amplifikation zu bieten. Diese Platte, die aus einem einzigen starren Stück Polypropylen im 96-Well-Format besteht, ist mit 96-Well-Real-Time-PCR-Systemen und Thermocyclern von Applied Biosystems kompatibel.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	Die Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduziert die Wahrscheinlichkeit einer Well-to-Well-Kontamination und Probenverdunstung, wenn sie während der qPCR auf eine Mikroplatte aufgetragen
. PBS	Gibco	20012-023	Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ist eine ausgewogene Salzlösung, die für eine Vielzahl von Zellkulturanwendungen verwendet wird, z. B. zum Waschen von Zellen vor der Dissoziation. Transportieren von Zellen oder Gewebeproben, Verdünnen von Zellen für die Zählung und Vorbereiten von Reagenzien.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA-Cleanup Kits ermöglichen die effiziente RNA-Aufreinigung von enzymatischen Reaktionen und die Reinigung von RNA, die mit verschiedenen Methoden gereinigt wurde. Enthält RW1-, RLT- und RW1-Puffer, die im gesamten Protokoll erwähnt werden.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR-Software, die während des Protokolls verwendet wird. Enthält Design- und Analysesoftware für die Analyse von Fraktionierungsproben
RLT-Puffer	Qiagen	79216	Lysepuffer aus dem RNA-Aufreinigungskit
RPE-Puffer	Qiagen	1018013	Waschpuffer aus dem RNA-Aufreinigungskit
RW1 Puffer	Qiagen	1053394	Waschpuffer aus dem RNA-Aufreinigungskit
Taqman Genexpressionsassays	Thermo-Fischer	4331182	Die TaqMan Genexpressions-Assays von Applied Biosystems stellen mit über 2,8 Millionen Assays für 32 eukaryotische Spezies und zahlreiche Mikroben die größte Sammlung von vorgefertigten Assays in der Branche dar. TaqMan Genexpressions-Assays ermöglichen es Ihnen, schnell Ergebnisse zu erzielen, ohne Zeit mit der Optimierung von SYBR Green Primern zu verschwenden und ohne zusätzliche Zeit für das Ausführen und Analysieren von Schmelzkurven.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix ist die ideale Reagenzlösung, wenn Sie einen Mastermix für mehrere 5'-Nuklease-DNA-Anwendungen benötigen. Die Reagenzien von Applied Biosystems wurden mit TaqMan-Assays und Echtzeitsystemen von Applied Biosystems validiert, um jedes Mal eine empfindliche, genaue und zuverlässige Leistung zu gewährleisten.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	wird zur Bestätigung der zytoplasmatischen Fraktion verwendet.
Thermo-Fischer		750024	UltraPure DEPC-behandeltes Wasser ist für die Verwendung mit RNA geeignet. Es wird durch Inkubation mit 0,1 % Diethylpyrocarbonat (DEPC) hergestellt und dann autoklaviert, um das DEPC zu entfernen. Steril gefiltert.

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