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Methodenartikel

Untersuchung der mikrobiellen Kooperation mittels bildgebender Massenspektrometrie-Analyse von Bakterienkolonien, die während der Infektion auf Agar und im Gewebe gezüchtet wurden

2.6K Ansichten

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DOI:

10.3791/64200

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18. November 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Florida, 2Division of Protective Immunity, Children’s Hospital of Philadelphia, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine neuartige Probenvorbereitungsmethode wird für die Analyse von agarbasierten, bakteriellen Makrokolonien mittels matrixunterstützter Laserdesorptions-/Ionisationsbildgebungs-Massenspektrometrie demonstriert.

Zusammenfassung

Das Verständnis der metabolischen Konsequenzen mikrobieller Interaktionen, die während einer Infektion auftreten, stellt eine einzigartige Herausforderung für das Gebiet der biomedizinischen Bildgebung dar. Die Matrix-assistierte Laserdesorptions-/Ionisations-Bildgebungs-Massenspektrometrie (MALDI) stellt eine markierungsfreie In-situ-Bildgebungsmodalität dar, die in der Lage ist, räumliche Karten für eine Vielzahl von Metaboliten zu erstellen. Während dünn geschnittene Gewebeproben heute routinemäßig mit dieser Technologie analysiert werden, bleiben bildgebende Massenspektrometrie-Analysen von nicht-traditionellen Substraten, wie z. B. Bakterienkolonien, die in der mikrobiologischen Forschung üblicherweise auf Agar gezüchtet werden, aufgrund des hohen Wassergehalts und der ungleichmäßigen Topographie dieser Proben eine Herausforderung. In diesem Artikel wird ein Arbeitsablauf zur Probenvorbereitung demonstriert, der bildgebende Massenspektrometrie-Analysen dieser Probentypen ermöglicht. Dieser Prozess wird anhand von bakteriellen Co-Kultur-Makrokolonien zweier gastrointestinaler Krankheitserreger veranschaulicht: Clostridioides difficile und Enterococcus faecalis. Es wird auch gezeigt, dass die Untersuchung mikrobieller Interaktionen in dieser gut definierten Agarumgebung Gewebestudien ergänzt, die darauf abzielen, die mikrobielle metabolische Zusammenarbeit zwischen diesen beiden pathogenen Organismen in Mausmodellen der Infektion zu verstehen. Bildgebende massenspektrometrische Analysen der Aminosäuremetaboliten Arginin und Ornithin werden als repräsentative Daten dargestellt. Diese Methode ist breit anwendbar auf andere Analyten, mikrobielle Krankheitserreger oder Krankheiten und Gewebetypen, bei denen ein räumliches Maß der Zell- oder Gewebebiochemie gewünscht wird.

Einleitung

Das menschliche Mikrobiom ist ein hochdynamisches Ökosystem mit molekularen Wechselwirkungen von Bakterien, Viren, Archaeen und anderen mikrobiellen Eukaryoten. Während mikrobielle Beziehungen in den letzten Jahren intensiv untersucht wurden, muss noch viel über mikrobielle Prozesse auf chemischer Ebeneverstanden werden 1,2. Dies ist zum Teil auf die Nichtverfügbarkeit von Werkzeugen zurückzuführen, die in der Lage sind, komplexe mikrobielle Umgebungen genau zu messen. Fortschritte auf dem Gebiet der bildgebenden Massenspektrometrie (IMS) in den letzten zehn Jahren haben die räumliche Kartierung vieler Metaboliten, Lipide und Proteine in biologischen Substraten in situ und markierungsfrei ermöglicht 3,4. Die Matrix-unterstützte Laserdesorption/-ionisation (MALDI) hat sich als die gebräuchlichste Ionisationstechnik in der bildgebenden Massenspektrometrie herausgestellt, bei der ein UV-Laser verwendet wird, um Material von der Oberfläche eines dünnen Gewebeschnitts zur Messung durch Massenspektrometrie4 abzutragen. Dieser Prozess wird durch das Aufbringen einer chemischen Matrix erleichtert, die homogen auf die Oberfläche der Probe aufgebracht wird, so dass sequentielle Messungen in einem Rastermuster über die Probenoberfläche durchgeführt werden können. Nach der Datenerfassung werden dann Heatmaps der Analytionenintensitäten erstellt. Jüngste Fortschritte bei Ionisationsquellen und Probenahmetechniken haben die Analyse von nicht-traditionellen Substraten wie bakteriellen5 und Säugetieren 6,7,8 zellulären Proben ermöglicht, die auf Nährstoffagar gezüchtet wurden. Die molekularen räumlichen Informationen, die von IMS bereitgestellt werden, können einen einzigartigen Einblick in die biochemische Kommunikation von Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen während der Infektion geben 9,10,11,12,13,14.

Bei einer Clostridioides difficile-Infektion (CDI) ist C. difficile einer sich schnell verändernden mikrobiellen Umgebung im Magen-Darm-Trakt ausgesetzt, in der polymikrobielle Interaktionen wahrscheinlich die Infektionsergebnisse beeinflussen15,16. Überraschenderweise ist wenig über die molekularen Mechanismen der Wechselwirkungen zwischen C. difficile und residenten Mikrobiota während der Infektion bekannt. Zum Beispiel sind Enterokokken eine Klasse opportunistischer kommensaler Krankheitserreger im Darmmikrobiom und wurden mit einer erhöhten Anfälligkeit und einem erhöhten Schweregrad von CDI17,18,19,20 in Verbindung gebracht. Über die molekularen Mechanismen der Wechselwirkungen zwischen diesen Erregern ist jedoch wenig bekannt. Um die niedermolekulare Kommunikation zwischen diesen Mitgliedern des Darmmikrobioms zu visualisieren, wurden hier bakterielle Makrokolonien auf Agar gezüchtet, um Mikroben-Mikroben-Interaktionen und bakterielle Biofilmbildung in einer kontrollierten Umgebung zu simulieren. Aufgrund des hohen Wassergehalts und der ungleichmäßigen Oberflächentopographie dieser Proben ist es jedoch schwierig, repräsentative metabolische Verteilungen bei der bildgebenden MALDI-Massenspektrometrie-Analyse von Bakterienkulturproben zu erhalten. Dies wird hauptsächlich durch die stark hydrophile Natur von Agar und die ungleichmäßige Reaktion der Agaroberfläche während der Feuchtigkeitsentfernung verursacht.

Der hohe Wassergehalt von Agar kann es auch schwierig machen, eine homogene MALDI-Matrixbeschichtung zu erreichen, und kann die anschließende MALDI-Analyse im Vakuum21 beeinträchtigen. Zum Beispiel arbeiten viele MALDI-Quellen mit Drücken von 0,1-10 Torr, was ein ausreichendes Vakuum ist, um Feuchtigkeit aus dem Agar zu entfernen, und eine Verformung der Probe verursachen kann. Diese morphologischen Veränderungen im Agar, die durch die Vakuumumgebung induziert werden, verursachen Blasenbildung und Rissbildung im getrockneten Agarmaterial. Diese Artefakte verringern die Haftung des Agars auf dem Objektträger und können dazu führen, dass die Probe in das Vakuumsystem des Instruments zerlegt oder abgeplatzt wird. Die Dicke der Agarproben kann bis zu 5 mm vom Objektträger entfernt sein, was zu einem unzureichenden Abstand von der Ionenoptik im Inneren des Instruments führen kann, was zu einer Kontamination und/oder Beschädigung der Instrumentenionenoptik führen kann. Diese kumulativen Effekte können zu einer Verringerung des Ionensignals führen, das die Oberflächentopographie und nicht die zugrunde liegenden mikrobiellen biochemischen Wechselwirkungen widerspiegelt. Agarproben müssen vor der Analyse im Vakuum homogen getrocknet und fest auf einem Objektträger haften.

Diese Arbeit demonstriert einen Probenvorbereitungs-Workflow für die kontrollierte Trocknung von Bakterienkultur-Makrokolonien, die auf Agarmedien gezüchtet werden. Dieser mehrstufige, langsamere Trocknungsprozess (im Vergleich zu den zuvor berichteten) stellt sicher, dass der Agar gleichmäßig dehydriert und gleichzeitig die Auswirkungen von Blasenbildung oder Rissbildung von Agarproben, die auf Objektträgern montiert sind, minimiert werden. Durch die Verwendung dieser schrittweisen Trocknungsmethode werden die Proben fest auf dem Objektträger haftbar und sind für die anschließende Matrixapplikation und MALDI-Analyse geeignet. Dies wird anhand von Modellbakterienkolonien von C. difficile veranschaulicht, die auf Agar- und Mausgewebemodellen gezüchtet wurden, die CDI mit und ohne das Vorhandensein von kommensalem und opportunistischem Erreger, Enterococcus faecalis, beherbergen. Die bildgebenden Massenspektrometrie-Analysen von Bakterien- und Gewebemodellen von MALDI ermöglichen die räumliche Kartierung von Aminosäure-Metabolitenprofilen und bieten neue Einblicke in den bioenergetischen mikrobiellen Stoffwechsel und die Kommunikation.

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Protokoll

HINWEIS: Tierversuche wurden von den Animal Care and Use Committees des Children's Hospital of Philadelphia und der University of Pennsylvania Perelman School of Medicine genehmigt (Protokolle IAC 18-001316 und 806279).

ACHTUNG: Clostridium difficile (C. difficile) und Enterococcus faecalis (E. faecalis) sind BSLII-Erreger und sollten mit äußerster Vorsicht behandelt werden. Verwenden Sie bei Bedarf geeignete Dekontaminationsprotokolle.

1. Wachstum von Makrokolonien für Bakterienkulturen und Vorbereitung für den Versand über Nacht

  1. Bereiten Sie C. difficile - und E. faecalis-Nachtkulturen vor und züchten Sie sie einzeln bei 37 °C in einer anaeroben Kammer (85% Stickstoff, 10% Wasserstoff, 5% Kohlendioxid) in Gehirn-Herz-Infusionsbrühe, ergänzt mit 0,5% Hefeextrakt und 0,1% L-Cystein (BHIS). Verwenden Sie 1,5% Agar für alle plattierten Proben.
  2. Normalisieren Sie das bakterielle Nährmedium auf optische Dichte bei 600 nm (OD600). 5 μl jeder Makrokolonie auf BHIS + L-Cystein-Agarplatten auffüllen und 7 Tage lang bei 37 °C anaerob wachsen. Bei Makrokolonien gemischter Spezies werden die Bakterienkulturmedien vor dem Ausplattieren im Verhältnis 1:1 gemischt.
  3. Bereiten Sie Indiumzinnoxid (ITO)-beschichtete Objektträger vor, indem Sie ein Ohmmeter verwenden, um die Seite des Objektträgers mit der leitfähigen Beschichtung zu identifizieren. Verwenden Sie einen Ritzer mit Diamantspitze, um die ITO-beschichtete Seite des Objektträgers zu ätzen und zu beschriften.
  4. Entfernen Sie die gesamte Kultur von der Agar-Wachstumsfuge und montieren Sie sie dann auf einen ITO-beschichteten Objektträger, wobei sichergestellt ist, dass keine Luftblasen zwischen Agar und Objektträger eingeschlossen werden.
    HINWEIS: Der Wassergehalt in den Agarmedien sollte es der Kultur ermöglichen, auf natürliche Weise an der Oberfläche des Objektträgers zu haften. Ein Video, das diesen Prozess veranschaulicht, finden Sie in der ergänzenden Dokumentation von Yang et al.22.
  5. Legen Sie die Kolonien zum Schutz in Objektträgerboxen. Bewahren Sie die Objektträgerboxen in 8 in x 8 in Transportbeuteln für Biohazard-Proben mit einer Handvoll Trockenmittelpellets auf und versiegeln Sie sie für den Versand über Nacht zur weiteren Verarbeitung und Analyse.
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine trockene Umgebung für die Bakterienkulturen aufrechtzuerhalten, wenn sie unter Umgebungsbedingungen versandt werden, um das Bakterienwachstum und den Stoffwechsel zu verlangsamen und die Fixierung der Bakterienproben bis zur Analyse aufrechtzuerhalten. Diese Versandart wurde durch umfangreiche Experimente optimiert und wird dem Versand der in Trockeneis gefrorenen Kolonien vorgezogen. Größere Temperaturänderungen vor dem Trocknen neigen dazu, unter der montierten Agarprobe zu demontieren und zu sprudeln.

2. Umgebungstrocknung von bakteriellen Makrokolonien von C. difficile + E. faecalis

  1. Entfernen Sie die Agarose-Bakterienkolonien, die auf ITO-beschichteten Objektträgern montiert sind, aus dem Verpackungsmaterial. Legen Sie die Proben in eine trockene Box mit Trockenmittel für 48-72 h bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Dies ist ein milder und langsamer Trocknungsprozess, der das Sprudeln, Reißen oder Ablösen des Agarmediums von der Oberfläche des Objektträgers minimiert.
  2. Entsorgen Sie alle kontaminierten Verpackungsmaterialien ordnungsgemäß und dekontaminieren Sie den Arbeitsbereich mit einem geeigneten bakteriziden/sporiziden Desinfektionsmittel.
  3. Untersuchen Sie die Kolonien visuell auf Verformungen in der Agaroberfläche (z. B. Sprudeln, Reißen, Absteigen).
    HINWEIS: Die Höhe der Agaroseoberfläche sollte sichtbar abnehmen und flach über dem Objektträger liegen.

3. Vakuum- und wärmevermittelte Trocknung von Bakterienmakrokolonien von C. difficile + E. faecalis

HINWEIS: Eine speziell angefertigte Vakuumtrocknungsvorrichtung (Abbildung 1) wurde gebaut, um die Entfernung von überschüssiger Feuchtigkeit aus den Agarproben zu erleichtern. Diese Vorrichtung verwendet eine Drehschieber-Vakuumpumpe, die in Reihe mit einem HEPA-Biofilter, einer Kühlfalle und einer Edelstahlkammer verbunden ist, in der die Bakterienproben platziert werden. Ein Transformator mit variabler Spannung ist mit einem isolierten Drahtfaden verbunden, der es dem Benutzer ermöglicht, die Kammer zu erwärmen, um den Trocknungsprozess zu beschleunigen.

  1. Schließen Sie die Vakuumleitung zur Probenkammer und schalten Sie den Netzschalter für die Drehschieberpumpe ein, damit sich die Vakuumpumpe erwärmen und den richtigen Vakuumdruck erreichen kann.
  2. Schalten Sie den Transformator mit variabler Spannung ein, um den um die Kammer gewickelten Drahtfaden zu erhitzen. Stellen Sie die variable Stromversorgung ein, bis die Innentemperatur der Vakuumkammer ~50 °C erreicht. Während sich die Pumpe erwärmt, geben Sie eine Aufschlämmung aus Trockeneis und 100% Ethanol in den Kondensator der Kühlfalle.
    HINWEIS: Die Kühlfalle kondensiert alle Dämpfe oder Sporen aus der Probe und vermeidet eine Kontamination des Drehschieberpumpensystems und des Vakuumpumpenöls.
  3. Öffnen Sie die Vakuumkammer, indem Sie die 16-mm-Doppelklauenflanschklemmen mit einem Schraubenschlüssel lösen. Führen Sie die Agaroseproben in die Kammer ein und verschließen Sie die Kammer mit den 16-mm-Doppelklauenflanschklemmen fest.
  4. Öffnen Sie das Pumpenventil, um die Kammer zu evakuieren. Lassen Sie die Proben 60-120 Minuten trocknen (z. B. bei ~150 mTorr).
    HINWEIS: Diese Trocknungszeit reicht aus, um den größten Teil der Feuchtigkeit in kleinen Agarabschnitten zu entfernen. Eine empirische Bestimmung der optimalen Trocknungszeit für den Feuchtigkeitsentzug und die Verringerung der Agarhöhe kann je nach individuellem Aufbau und Proben erforderlich sein. Wesentlich längere Trocknungszeiten können dazu führen, dass der getrocknete Agar spröde wird und zu Rissen neigt.
  5. Wenn Sie fertig sind, entlüften Sie die Vakuumkammer langsam auf Umgebungsdruck, indem Sie das Ventil an der Drehschieberpumpe schließen und das externe Ventil für die Umgebungsluft öffnen. Öffnen Sie die Kammer mit dem zuvor genannten Protokoll und entfernen Sie die getrocknete Agaroseprobe aus der Kammer.
  6. Lagern Sie die Probe in einer trockenen Box mit Trockenmittel bis zum Auftragen der Matrix.
    HINWEIS: Abbildung 2 zeigt Bilder der Agaroberfläche vor und nach dem Trocknen.

4. MALDI-Matrixauftrag mittels Roboterspritzen

HINWEIS: Nachdem die Agaroseproben gründlich getrocknet wurden und die Höhe der Kulturschnitte merklich abgenommen hat, verwenden Sie ein Roboter-Matrixsprühgerät, um eine dünne Schicht einer chemischen MALDI-Matrixverbindung homogen aufzutragen. Dieses Verfahren sollte in einem chemischen Abzug und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhen, Laborbrille und Laborkittel, durchgeführt werden.

  1. Wählen Sie die entsprechende MALDI-Matrix aus. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie die 1,5-Diaminonaphthalin (DAN) MALDI-Matrix für die günstige Desorption und Ionisierung von Aminosäuren im negativen Ionenmodus.
  2. Bereiten Sie 10 ml einer 10 mg/mL DAN MALDI-Matrixlösung in 90/10 (v/v) Acetonitril/Wasser vor. Verwenden Sie Lösungsmittel in HPLC-Qualität, beschallen Sie sie 30 Minuten lang und filtrieren Sie die Lösung durch 0,2-μm-Nylonspritzenfilter, bevor Sie sie in die Spritzenpumpe des Robotersprühgeräts einführen. Bereiten Sie außerdem Waschlösungen vor, um sicherzustellen, dass die Sprühleitung zwischen den einzelnen Anwendungen sauber ist.
    HINWEIS: Waschlösungen werden gewählt, um die Löslichkeit der Matrix und anderer Verunreinigungen in der Sprühlinie zu erhöhen und deren Entfernung aus dem System zu erleichtern. Die hier verwendeten Waschlösungen sind 90/10 (v/v) Acetonitril/Wasser, 50/50 (v/v) Wasser/Methanol, 99/1 (v/v) Acetonitril/Essigsäure und 95/5 (v/v) Wasser/Ammoniumhydroxid.
  3. Befestigen Sie die Probe an der Sprühschale und laden Sie die vorbereiteten Lösungen in die Sprühleitung (Abbildung 3). Geben Sie mithilfe der Computersoftware die erforderlichen Parameter an, um eine gleichmäßige Beschichtung der Matrixmischung zu ermöglichen: 30 °C Düsentemperatur, acht Durchgänge, 0,1 ml/min Durchflussrate, CC-Muster, 0 s Trocknungszeit, 10 psi.
    HINWEIS: Es ist allgemein anerkannt, dass die meisten Krankheitserreger durch Anwendung der MALDI-Matrix, bei der es sich typischerweise um eine kleine organische Säure oder Base handelt, inaktiviert werden.
  4. Nachdem die Sprühsequenz beendet ist, nehmen Sie die Probe aus der Sprühschale und lagern Sie sie bis zur Analyse in einem Austrocknungsschrank.

5. Vorbereitung von bakteriellen Makrokolonien für die MALDI-Bildgebungs-Massenspektrometrie-Datenerfassung

HINWEIS: Alle bildgebenden Massenspektrometrie-Analysen wurden mit einem Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer (FTICR) durchgeführt. Dieses Gerät ist mit einem Nd:YAG MALDI Lasersystem (2 kHz, 355 nm) ausgestattet.

  1. Legen Sie die matrixbeschichtete Probe in den MALDI-Objektträgeradapter für Zielplatten ein und ritzen Sie mindestens drei Passermarker, die den Probenbereich umfassen, mit Permanentmarkern (Abbildung 4). Verwenden Sie einen Flachbettscanner, um ein optisches Bild des Objektträgers einschließlich der Passermarken zu erstellen.
    HINWEIS: Die Passermarken ermöglichen die Registrierung des optischen Bildes für die im Instrument beobachtete MALDI-Kameraansicht.
  2. Definieren Sie eine MS-Gerätemethode, die für den gewünschten Massenbereich, die Empfindlichkeit und die Auflösung optimiert ist, einschließlich Massenkalibrierung, MALDI-Lasereinstellungen, Parameter der Ionenoptik und ICR-Zellbedingungen. Wählen Sie für diese Methode ein 100-Da-Massenfenster von m/z 100 bis 200 für die Anreicherung von Gasphasensignalen im negativen Ionenmodus unter Verwendung eines CASI-Ansatzes (Continuous accumulation of selected ions)23, der die m/z-Werte der interessierenden Metaboliten umfasst.
  3. Öffnen Sie die Bilderfassungssoftware des Instruments und verwenden Sie den Setup-Assistenten , um den Dateinamen und den Speicherort, die MS-Erfassungsmethode, die zu untersuchenden Regionen und die räumliche Auflösung des Bildes zu definieren.
    HINWEIS: Räumliche Auflösungen von 100-300 μm werden typischerweise für die Bildgebung bakterieller Makrokolonien verwendet.
  4. Sobald alle Parameter definiert sind, starten Sie die Erfassungssequenz, um seriell ein Massenspektrum an jedem Pixel über die definierten Regionen von Interesse zu erfassen.
    HINWEIS: Die Bildaufnahmezeit hängt von den Geräteeinstellungen ab, liegt aber bei Bildern mit 5.000 bis 10.000 Pixeln in der Regel zwischen 2 und 6 Stunden.

6. Bildgebende Massenspektrometrie, Datenanalyse und Identifizierung von Verbindungen

  1. Speichern Sie die Daten nach der Bildaufnahme mit der Dateierweiterung ".mis", einem herstellerspezifischen Dateiformat für bildgebende Massenspektrometrieplattformen. Öffnen Sie die Datendatei in flexImaging- oder SCiLS-Softwarepaketen oder exportieren Sie sie in ein nicht-proprietäres Datenformat wie .mzml und visualisieren Sie sie mit herstellerneutraler Software (z. B. Cardinal24 oder MSIreader25,26).
    HINWEIS: Beim Öffnen der Bildgebungsdaten in flexImaging wird ein durchschnittliches Massenspektrum angezeigt, das die durchschnittlichen Intensitäten aller in den abgetasteten Regionen nachgewiesenen Ionen darstellt. Interessierende Spitzen können auf der Grundlage genauer Massenmessungen vorläufig identifiziert werden. Typischerweise sind Massengenauigkeiten von besser als 5 Teilen pro Million (ppm) für die Identifizierung von Metaboliten auf FICCR-Massenspektrometern ausreichend.
  2. Definieren Sie mithilfe der referenzierten Software Massenfenster für interessierende Peaks , um Falschfarben-Heatmaps der Ionenverteilungen in den abgetasteten Regionen zu erstellen.
    1. Zoomen Sie auf der Anzeige des durchschnittlichen Massenspektrums auf den interessierenden Peak, und wählen Sie ein geeignetes Massenfenster aus, das den Bereich des Peakprofils umfasst.
    2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das markierte Massenfenster und wählen Sie Massenfilter hinzufügen.... Beschriften Sie den ausgewählten m/z-Wert mit der vorläufigen Identifizierung für den vermuteten Metaboliten, wie er durch die hochauflösende genaue Massenmessung bestimmt wurde.
    3. Wählen Sie den Intensitätsschwellenwert aus, um den Dynamikbereich des Analytbildes anzupassen, das von der Falschfarben-Heatmap angezeigt wird. Passen Sie die Massenfilterparameter weiter an, sodass das Massenfenster den Bereich des Peakprofils umfasst, und fügen Sie dann den Massenfilter hinzu.
      HINWEIS: Die Intensitätsnormalisierung kann nach Bedarf durchgeführt werden, um die relative Quantifizierung in den gemessenen Regionen zu verbessern. Die Experimente hier verwendeten CASI-Datenerfassung (siehe unten), was die Normalisierungsmethoden der Gesamtionenzahl (TIC) und des quadratischen Mittelwerts (RMS) ungenau machen kann. Daher werden alle hier gezeigten Ionenbilder ohne Normalisierung angezeigt.

7. Herstellung und Versand von nicht infizierten Kontroll- und C. difficile-infizierten Mäuse-Blinddarmgeweben

  1. Innokulieren Sie 4-8 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse mit Antibiotika (0,5 mg/ml Cefoperazon oder 0,5 mg/ml Cefoperazon + 1 mg/ml Vancomycin) in Trinkwasser ad libitum für 5 Tage, gefolgt von einer 2-tägigen Erholungsphase und anschließender Infektion.
  2. Euthanasieren Sie die Tiere durch CO2 -Veredelung und ernten Sie sofort das Blinddarmorgan der Maus. Einbetten in eine 20%ige Mischung aus optimaler Schnitttemperaturverbindung (OCT) in destilliertem Wasser.
  3. Legen Sie die Proben auf Trockeneis und verpacken Sie sie und versenden Sie sie zur Analyse. Bis zur Analyse bei -80 °C lagern.

8. Kryosektion von nicht infizierten Kontroll-Verus-C. difficile-infizierten Mäuse-Blinddarmgeweben

  1. Reinigen Sie alle Kryosektionsgeräte durch Spülen mit 100% Ethanol und lassen Sie sie trocknen, bevor Sie die Proben in die Kryostatkammer geben. Bereiten Sie ITO-beschichtete Objektträger vor, indem Sie ein Ohmmeter verwenden, um die Seite des Objektträgers mit der leitfähigen Beschichtung zu identifizieren. Verwenden Sie einen Ritzer mit Diamantspitze, um die ITO-beschichtete Seite des Objektträgers zu ätzen und zu beschriften.
    HINWEIS: Geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, Laborbrille, Laborkittel und Kryostatärmel, sollte getragen werden.
  2. Führen Sie eine Kryosektion an einem Forschungskryomikrotom durch. Übertragen Sie die in die OCT eingebetteten Maus-Ceca-Gewebe aus einem -80 °C-Gefrierschrank auf Trockeneis in die Kryomikrotomkammer (30 °C Kammertemperatur, -28 °C Objekttemperatur). Montieren Sie die zu vergleichenden Gewebeproben mittels bildgebender Massenspektrometrie (z. B. nicht infizierte Kontrolle vs. C. difficile-infiziert) auf demselben Objektträger, um eine identische Probenvorbereitung beider Gewebetypen sicherzustellen und genaue Metabolitenvergleiche zu ermöglichen.
  3. Montieren Sie das in die OCT eingebettete Gewebe in der Kryomikrotomkammer mit einer zusätzlichen OCT-Lösung auf einem Probenfutter. Nachdem die OCT-Lösung erstarrt ist, befestigen Sie das Spannfutter am Probenkopf. Beginnen Sie mit der Kryosektion in Schritten von 10-50 μm, um die gewünschte Gewebetiefe/-ebene des Organs zu erreichen.
  4. Sobald ein optimaler Querschnitt des Gewebes erreicht ist, beginnen Sie mit der Entnahme von Schnitten mit einer Dicke von 12 μm. Manipulieren Sie die Scheibe vorsichtig mit Künstlerpinseln und legen Sie sie auf einen teflonbeschichteten Objektträger.
  5. Rollen Sie den ITO-beschichteten Objektträger auf den Gewebeschnitt, um das Gewebe vom teflonbeschichteten Objektträger aufzunehmen. Auftauen Montieren Sie den Gewebeschnitt auf dem Objektträger, indem Sie die Handfläche auf die Rückseite des ITO-beschichteten Objektträgers drücken. Tauen Sie die Halterung weiter auf, bis der Gewebeabschnitt von einer durchscheinenden zu einer undurchsichtigen/matten Textur übergeht.
  6. Übertragen Sie die auf Gewebe montierten Objektträger auf Trockeneis in eine trockene Box mit Trockenmittel zur Lagerung für die Analyse am selben Tag oder lagern Sie sie bei -80 °C für eine längerfristige Lagerung.

9. Vorbereitung von nicht-infizierten Kontrollgeweben im Vergleich zu C. difficile-infizierten Maus-Blinddarmgeweben für die Matrixapplikation und die MALDI-Bildgebungs-Massenspektrometrie

  1. Führen Sie die MALDI-Matrixanwendung mit dem in Schritt 4 beschriebenen Protokoll durch (30 ° C Düsentemperatur, acht Durchgänge, 0,1 ml/min Durchflussrate, CC-Muster, 0 s Trocknungszeit, 10 psi).
  2. Führen Sie die bildgebende MALDI-Massenspektrometrie mit den in den Schritten 5 und 6 beschriebenen Protokollen durch.
  3. Analysieren Sie die Ionenbilder von mehreren biologischen Replikaten und vergleichen Sie die Ergebnisse auf Signifikanz über Intensitäts-Box-Plot-Vergleiche mit der oben genannten SCiLS-Statistiksoftware.
    HINWEIS: Die geeigneten statistischen Tests und Vergleiche hängen von der Anwendung ab und können räumliche Segmentierung, Klassifizierungsmodelle und vergleichende Analysen zur Bestimmung diskriminierender und korrelierter spektraler Merkmale umfassen. Vergleichende Analysen können die Zuweisung von p-Werten zu signifikanten Merkmalen, die Erstellung von Hauptkomponentenanalysen für Gewebevergleiche und die Visualisierung von Boxplots zur Identifizierung von Variationen umfassen. Es ist auch sinnvoll, das Gewebe mittels Hellfeldmikroskopie des mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Gewebeschnitts nach bildgebender Massenspektrometrie sichtbar zu machen. Dies ermöglicht eine eindeutige Identifizierung morphologischer Merkmale im Gewebe und kann in Absprache mit einem ausgebildeten Pathologen analysiert werden.

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Ergebnisse

Wir haben eine metabolitische MALDI-Bildgebungs-Massenspektrometrie von Modellbakterienkolonien und Mäusen durchgeführt, die mit E. faecalis und C. difficile kokolonisiert wurden, um die Rolle von Aminosäuren bei Mikroben-Mikroben-Interaktionen zu untersuchen. Bakterielle Makrokolonien, die auf Agar gezüchtet werden, dienen als klar definiertes Modell, um unterschiedliche biochemische Veränderungen in der bakteriellen Biofilmbildung zu analysieren. Es ist wichtig, einen kontrollierten Trocknungsprozess ...

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Diskussion

Bei der bildgebenden MALDI-Massenspektrometrie ist es wichtig, eine flache Probenoberfläche zu haben, um einen gleichmäßigen Fokusdurchmesser des einfallenden MALDI-Lasers auf dem Probensubstrat zu gewährleisten. Abweichungen in der Probenhöhe können dazu führen, dass sich der MALDI-Laserstrahl unscharf verschiebt, was zu Änderungen des Strahldurchmessers und der Strahlintensität führt, die die MALDI-Ionisationseffizienz beeinträchtigen können. Diese Veränderungen in der Ionisationseffizienz können zu Unterschieden in de...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) unter der Auszeichnung GM138660 unterstützt. J.T.S. wurde durch das Charles and Monica Burkett Family Summer Fellowship der University of Florida unterstützt. J.P.Z. wurde durch die NIH-Zuschüsse K22AI7220 (NIAID) und R35GM138369 (NIGMS) unterstützt. A.B.S. wurde durch den Cell and Molecular Biology Training Grant an der University of Pennsylvania (T32GM07229) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 μ m Titan3 Nylon SpritzenvorsatzfilterThermo Scientific42225-NN
1,5-Diaminonaphthalin MALDI MatrixSigma Aldrich2243-62-1
20 mL Henke Ject Luer-Lock-SpritzenHenke Sass Wolf4200.000V0 
Konvektions-Vakuummessgerät der Serie 275iFirma Kurt J. LeskerKJL275807LL
7T solariX FTICR Massenspektrometer, ausgestattet mit einem Smartbeam II Nd:YAG MALDI Lasersystem (2 kHz, 355 nm)Bruker Daltonics
Essigsäurelösung, geeignet für HPLCSigma Aldrich64-19-7
Acetonitril, geeignet für HPLC, Gradientenqualität, ≥ 99,9%Sigma Aldrich75-05-8
Ammoniumhydroxidlösung, 28% NH3 in H2O, ≥ 99,99 % SpurenmetallbasisSigma Aldrich1336-21-6
Autoklavierbare Biohazard-Beutel: 55 GallonenGrainger45TV10
Biohazard Probentransportbeutel (8 x 8 Zoll)Fisher Scientific01-800-07
Gehirn-Herz-InfusionsbrüheBD Biosciences90003-040
C57BL/6 männliche Mäuse Jackson Laboratories
CanoScan 9000F Mark II Foto- und DokumentenscannerCanon
CM 3050S Kryomikrotom für die ForschungLeica Biosystems
ExsikkatorschrankSigma AldrichZ268135
Diamantritzer, ElektronenmikroskopieFisher Scientific50-254-51
TrockenmittelpelletsDrierit21005
Ethanol, 200 ProofDecon Labs2701
flexImaging SoftwareBruker Daltonics
ftmsSteuerungssoftwareBruker Daltonics
GlasvakuumfalleSigma AldrichZ549460
HTX M5 TM Roboter-SprühgerätHTX Technologies
Indiumzinnoxid (ITO)-beschichtete ObjektträgerDelta TechnologiesCG-81IN-S115
Inline-HEPA-Filter für VakuumpumpeLABCONCO7386500
Methanol, HPLC-QualitätFisher Chemical67-56-1
MTP Schiebeadapter IIBruker Daltonics235380
Compound für optimale Schnitttemperatur (OCT)Fischer Scientific23-730-571
Peridox RTU Sporizid-, Desinfektions- und ReinigungsmittelCONTECCR85335 
PTFE (Teflon) gedruckte Objektträger, Elektronenmikroskopie SciencesVWR100488-874
Drehschieber-Vakuumpumpe RV8EdwardsA65401903
Tissue-Tek Accu-Edge Einweg-Mikrotomklingen mit hohem ProfilElektronenmikroskopie Sciences63068-HP
Transparenter VakuumschlauchCole PalmerEW-06414-30
Ultragrade 19 VakuumpumpenölEdwardsH11025011
VerstellspannungswandlerPowerstat
Wasser, passend für HPLCSigma Aldrich7732-18-5
Weithals-DewargefäßSigma AldrichZ120790

Referenzen

  1. Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
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