C. elegans Gonadendissektion und Gefrierriss für Immunfluoreszenz und DAPI-Färbung

Zusammenfassung

Dies ist eine häufig verwendete Methode für die C. elegans-Gonadendissektion, gefolgt von Freeze Crack, bei der Keimbahnproben für die Immunfluoreszenz durch Antikörperfärbung oder für die einfache DAPI-Färbung zur Visualisierung von DNA hergestellt werden. Dieses Protokoll war erfolgreich für Studenten in einem Forschungslabor und in einer kursbasierten Bachelor-Forschungserfahrung.

Zusammenfassung

Die Keimbahn von C. elegans ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Meiose, zum Teil aufgrund der einfachen Durchführung zytologischer Analysen an sezierten Tieren. Ganze Mount-Präparate bewahren die Struktur der meiotischen Kerne, und wichtig ist, dass jeder Gonadenarm alle Stadien der Meiose enthält, die in einer zeitlich-räumlichen Progression organisiert sind, die es leicht macht, Kerne in verschiedenen Stadien zu identifizieren. Erwachsene Hermaphroditen haben zwei Gonadenarme, die jeweils als geschlossene Röhre mit proliferierenden Keimbahnstammzellen am distalen geschlossenen Ende und zellularisierten Eizellen am proximalen offenen Ende organisiert sind, die sich in der Mitte der Gebärmutter verbinden. Die Dissektion löst einen oder beide Gonadenarme aus der Körperhöhle, so dass die Gesamtheit der Meiose sichtbar gemacht werden kann. Hier wird ein gemeinsames Protokoll für die Immunfluoreszenz gegen ein Protein von Interesse vorgestellt, gefolgt von einer DAPI-Färbung zur Markierung aller Chromosomen. Junge Erwachsene werden in Levamisol immobilisiert und schnell mit zwei Spritzennadeln seziert. Nach der Keimbahnextrusion wird die Probe fixiert, bevor sie einen Gefrierriss in flüssigem Stickstoff durchläuft, der die Permeabilisierung der Kutikula und anderer Gewebe unterstützt. Die Probe kann dann in Ethanol dehydriert, rehydriert und mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert werden. DAPI wird der Probe im Montagemedium hinzugefügt, was eine zuverlässige Visualisierung der DNA ermöglicht und es einfach macht, Tiere zu finden, die unter einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden können. Diese Technik wird von denjenigen, die mit dem Umgang mit C. elegans vertraut sind, nach einigen Stunden des Übens der Dissektionsmethode selbst leicht übernommen. Dieses Protokoll wurde Schülern und Studenten beigebracht, die in einem Forschungslabor arbeiten, und in eine kursbasierte Forschungserfahrung an einem Liberal Arts College integriert.

Einleitung

Meiose ist die spezialisierte Zellteilung, die zur Erzeugung von Gameten (Eizellen und Spermien/Pollen) in allen sich sexuell vermehrenden Organismen verwendet^{wird 1,2}. Crossover-Rekombination ist der wechselseitige Austausch von DNA zwischen homologen Chromosomen; Sie ist essentiell für die Meiose, da sie sowohl eine wichtige Quelle der genetischen Vielfalt darstellt als auch die Stabilität des Genoms über Generationen hinweg fördert. Chromosomen, die während der Meiose nicht mindestens ein Crossover bilden, werden zufällig getrennt, was zu einer Nichtdisjunktion des Chromosoms führen kann, wodurch Gameten mit der falschen Anzahl von Chromosomen entstehen - ein Zustand, der für die resultierenden Nachkommen normalerweise tödlich ist³. Während der Meiose werden Crossover durch programmierte Doppelstrang-DNA-Brüche induziert⁴. Eine Teilmenge dieser Brüche wird als Crossover repariert, die physische Verbindungen der DNA, sogenannte Chiasmata, bereitstellen, die helfen, homologe Chromosomen in Vorbereitung auf die Zellteilung^{zu orientieren 5}. Meiotische Stadien sind in allen Eukaryoten hoch konserviert, und ihre chromosomale Konformation ermöglicht es, sie leicht zu identifizieren.

Als grundlegendes Konzept der Biologie ist Meiose ein Thema, dem Studierende in verschiedenen Biologiekursen mehrfach begegnen. Sie werden oft in der High School in die Mechanik der meiotischen Chromosomentrennung eingeführt, während sich Kurse auf College-Niveau auf die Zellbiologie der Segregation und die genetischen Auswirkungen der Crossover-Rekombination konzentrieren. Meiose ist jedoch für viele Studenten ein notorisch kniffliges Konzept¹. Ein Versäumnis, die Beziehung zwischen Genen, DNA, Chromosomen und Meiose zu verstehen, kann zu Missverständnissen und Verständnislücken führen, die ein vollständiges Verständnis der genetischen Vererbung behindern ^6,7. Eine Möglichkeit, das Verständnis der Schüler für abstrakte Themen zu verbessern, besteht darin, konkrete, praktische Aktivitäten anzubieten. Beim Unterrichten von Meiose können Lehrkräfte beispielsweise zwischen Aktivitäten wählen, die die molekulare Analyse⁸ emulieren, 3D-Modellen, mit denen die Schüler Moleküle⁹ manipulieren können, oder Rollenspielen, bei denen die Schüler selbst die molekulare Choreografie¹ nachspielen. Die Einbeziehung von Forschung mit unbekannten Ergebnissen ist ein besonders effektiver Weg, um das Verständnis der Schüler zu verbessern. Diese Praxis ist als kursbasierte Undergraduate-Forschungserfahrung (CURE) bekannt und hat den zusätzlichen Vorteil, die Einstellung und Handlungsfähigkeit der Studenten zu stärken, insbesondere für diejenigen, die zu Gruppen gehören, die in STEM^10,11 unterrepräsentiert bleiben. Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans eignet sich besonders für Unterrichtsstudien zu Verhalten, Fruchtbarkeit und genetischen Kreuzungen und ist ein wirksames Modell, um Schüler in die biologische Forschung einzuführen¹².

C. elegans ist ein leistungsfähiger Modellorganismus für die Zellbiologie, indem es Molekulargenetik mit einfachen zytologischen Analysen kombiniert. Es eignet sich auch besonders gut für den Einsatz in einem Biologieunterricht ^13,14,15. Sie sind einfach und wirtschaftlich in einem Labor zu warten und produzieren alle 3 Tage Hunderte von Nachkommen, sowohl bei Standardraumtemperatur als auch bei 20 ° C, der häufigsten Inkubationstemperatur. Wichtig ist, dass sie als Glycerinvorräte eingefroren und in einem Gefrierschrank von -80 °C aufbewahrt werden können, was bedeutet, dass alle Haltungsfehler, die von unerfahrenen Forschern gemacht werden, leicht korrigiert werden können¹⁶. Darüber hinaus ermöglicht sein gut annotiertes Genom vorwärts- und rückwärtsgenetische Techniken^17,18, so dass C. elegans verwendet werden kann^, um biologische Fragen zu beantworten, die von molekular bis evolutionär reichen. Schließlich haben die Forscher von C. elegans eine unterstützende Gemeinschaft geschaffen, die oft bereit ist, angehenden Wissenschaftlern mit Rat und Tat zur Seite zu stehen¹⁹. Diese Vorteile haben dazu geführt, dass C. elegans in eine Reihe von CUREs verschiedener Arten von Institutionen aufgenommen wurde 12,19,20,21,22,23.

Neben seinem Nutzen für Forschung und Lehre ist C. elegans zu einem beliebten Modell für Studien zur Meiose und Keimbahnentwicklung geworden^24,25,26. Die optische Klarheit dieser Tiere vereinfacht zytologische Ansätze²⁷, und bei Erwachsenen machen Gonaden fast die Hälfte des Tieres aus und liefern Hunderte von meiotischen Zellen zum Untersuchen. In Gonaden sind meiotische Keimbahnkerne wie ein Fließband angeordnet (Abbildung 1); Die mitotische Replikation erfolgt an der distalen Spitze der Gonade, wobei die Kerne durch meiotische Stadien fortschreiten, während sie zum proximalen Ende der Gonade wandern, wo befruchtete Embryonen aus der Vulva austreten. Da die stereotype räumliche Organisation auch einen zeitlichen Verlauf durch Meiose darstellt, können verschiedene Stadien anhand ihrer chromosomalen Organisation und ihrer Lage in der Gonade leicht identifiziert werden. Schließlich erzeugen Prozesse, die die Meiose stören und Aneuploidie verursachen, Phänotypen, die selbst für Anfänger leicht zu charakterisieren sind: Sterilität, embryonale Letalität oder eine hohe Inzidenz von Männern (Him-Phänotyp)²⁸.

Dies ist ein einfaches Protokoll zur Visualisierung meiotischer Chromosomen in C. elegans. Montage, Dissektion, Fixierung und Antikörperfärbung werden alle auf demselben Objektträger durchgeführt, was das Protokoll vereinfacht und eine nahezu perfekte Probenrückgewinnung ermöglicht. Diese Methode funktioniert für die einfache DAPI-Färbung zur Visualisierung von Chromosomen und kann für die Immunfluoreszenz verwendet werden, um die Lokalisation von Proteinen in der Gonade zu visualisieren. Die Schüler sezieren Gonaden mit einfachen Seziermikroskopen, erzeugen Ganzpräparate zur Visualisierung von DNA oder Immunfluoreszenz und bilden sie auf einem zusammengesetzten Fluoreszenzmikroskop ab. Dieses Protokoll wurde Gymnasiasten und Studenten beigebracht, die in einem Forschungslabor von C. elegans arbeiten, und in ein CURE an einem Liberal Arts College^{integriert 12}. Obwohl das CURE eine relativ kleine Klassengröße hatte, wäre dieses Protokoll aufgrund der relativ niedrigen Kosten für Wurmstämme und Reagenzien für Klassen an einer Reihe von Institutionen geeignet. Die Ausbilder wären nur durch die Anzahl der zur Verfügung stehenden Seziermikroskope begrenzt. Die vorherige Implementierung sah vor, dass die Schüler in Dreiergruppen arbeiteten, um ein einzelnes Mikroskop zu teilen, und fand in drei 90-minütigen Sitzungen statt: die erste, um die Dissektion zu üben, die zweite um Dissektion und DAPI-Färbung zu implementieren, und die dritte, um Objektträger auf einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop abzubilden. Die Teilnahme an der Bachelor-Forschung bietet viele Vorteile für Studenten^11,29, sowohl akademische als auch persönliche. Die Einbettung von Forschung in Kurse über CUREs ermöglicht es den Schülern, während der normalen Unterrichtszeit 11,30,31 an der Forschung teilzunehmen^, was die Exposition gegenüber diesen Vorteilen zugänglicher und gerechter macht.

Protokoll

1. C. elegans Haltung

ANMERKUNG: Siehe C. elegans Wartungsprotokoll¹⁶ und Elgin et al.32 für weitere Details. C. elegans-Stämme können leicht vom Caenorhabditis Genetics Center (https://cgc.umn.edu) erworben werden und werden per Post an jeden Ort in den USA versandt. Jede Sorte kostet $ 10, und jedes Labor / Benutzer zahlt eine jährliche Gebühr von $ 30.

1. Bereiten Sie mit steriler Technik 6 cm Nematodenwachstumsmittel-Agarplatten (NGM-Agarplatten) vor.
   HINWEIS: Gegossene Teller können kopfüber in ihren originalen Kunststoffhülsen oder luftdichten Behältern bei 4 °C für mehrere Monate gelagert werden.
   1. Um NGM-Agarplatten herzustellen, fügen Sie 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Pepton, 20 g NGM-Agar und ddH₂O bis 1 L (~ 975 ml) hinzu. Autoklavieren Sie das Medium mit einem Flüssigkeitszyklus, der 20 Minuten lang bei 121 °C hält. Auf 55 °C abkühlen lassen und mit steriler Technik 1 ml Cholesterin, 0,5 ml 1 M CaCl₂, 1 ml 1 M_MgSO4 und 25 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 6) hinzufügen.
      HINWEIS: Um 1 M Kaliumphosphatpuffer herzustellen, mischen Sie 108,3 g KH2PO4 (einbasisch) und 35,6 g_K2HPO4(dibasisch); Stellen Sie bei Bedarf den pH-Wert mit KOH auf 6 ein. _ddH2Obis zu 1 L (normalerweise ~900 ml) zugeben und 40 min bei 121 °C autoklavieren. 1 L NGM ergibt etwa 100 Platten mit jeweils 10 ml.
2. Mit einer serologischen oder Transferpipette die Platten mit drei Tropfen E.coli OP50-Bakterienkulturen (~ 150 μL) aufdecken. Versuchen Sie, in der Mitte der Platte zu punktieren und vermeiden Sie, Flecken zu nahe an den Plattenkanten zu platzieren. Dies wird die Tiere davon abhalten, an den Seiten der Platten hochzukriechen und auszutrocknen.
3. Sobald der Bakterienrasen getrocknet ist, lagern Sie die gefleckten Platten kopfüber bei Raumtemperatur (RT) für bis zu 2 Wochen. Spotting-Platten mindestens 1-2 Tage vor der Verwendung ermöglichen es den Bakterienrasen, dicker zu werden und eine höhere Dichte von Tieren zu unterstützen.
   HINWEIS: Zur Herstellung von OP50-Bakterienkulturen kann OP50 beim Caenorhabditis Genetics Center bestellt werden. OP50-Bakterien werden von einem Glycerinvorrat auf eine LB-Platte gestreift, um einzelne Kolonien zu gewährleisten, und 4-6 Wochen bei 4 ° C gehalten. OP50-Bakterienkulturen werden in LB über Nacht bei 37 °C aus einer einzigen Kolonie gezüchtet – es ist kein Schütteln erforderlich. Zur Herstellung von LB-Medien 10 g Trypton, 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, 950 ml ddH2O zugeben, den pH-Wert mit 10 N NaOH auf 7 einstellen und das Endvolumen mit_ddH2O auf 1 L einstellen. Aliquot in 100-ml-Mengen und Autoklavfür 20 min bei 121 °C.
4. Um einen Arbeitsstock für jeden Stamm zu erstellen, wählen Sie drei L4-Stufen-Hermaphroditen auf eine gefleckte NGM-Platte. Lagern Sie die Platten bei 15-25 °C. Der Standard-Anbauzustand beträgt 20 °C. Wenn kein Zugang zu temperaturgesteuerten Inkubatoren verfügbar ist, warten Sie die Kulturen auf dem Labortisch bei RT.
   HINWEIS: L4-Stadien-Hermaphroditen können leicht inszeniert werden, sowohl durch die Größe (kleiner als Erwachsene) als auch durch das Vorhandensein eines deutlichen Halbkreises auf halbem Weg durch ihren Körper (die sich entwickelnde Vulva). Bei 20 °C erreichen die Tiere das L4-Stadium 34-46 h nach dem Schlüpfen (ca. 40-52 h nach der Embryonenbildung). Siehe Corsi et ^al.14 für weitere Details über den Zeitpunkt der Entwicklungsstadien.
   1. Verschieben Sie die Kulturen auf verschiedene Temperaturen, um die Entwicklungsrate zu kontrollieren. Tiere wachsen bei höheren Temperaturen schneller und bei niedrigeren Temperaturen langsamer. Sie beginnen bei Temperaturen über 25 °C steril zu werden.
      HINWEIS: Einige mutierte Genotypen sind temperaturempfindlich und zeigen je nach Kulturtemperatur unterschiedliche Phänotypen.
5. Pflegen Sie die Arbeitsbestände, indem Sie alle 4 Tage drei L4-Stufen-Hermaphroditen zu einer neuen gefleckten NGM-Platte pflücken. Dies wird eine konstante, gut ernährte Bevölkerung mit einer breiten Palette von Entwicklungsstadien gewährleisten.

2. Gonaden-Dissektion

1. Sammeln von altersgerechten Erwachsenen: 12-24 Stunden vor der Dissektion L4-Stadien Hermaphroditen zu einer neuen gefleckten NGM-Platte pflücken - diese wachsen am nächsten Tag zu jungen Erwachsenen heran, was ideal für die Dissektion ist. Die Anzahl der Hermaphroditen im L4-Stadium hängt von der durchgeführten zytologischen Analyse ab; Normalerweise werden 10-20 Hermaphroditen pro Dia seziert, wobei zwei bis vier Objektträger pro Bedingung erzeugt werden.
   HINWEIS: Gonaden werden am effizientesten bei gut gefütterten Tieren extrudiert. Achten Sie darauf, L4-Hermaphroditen aus Arbeitsbeständen zu pflücken, die nicht verhungert sind (dh noch einen sichtbaren Bakterienrasen auf dem Teller haben). Verhungerte Tiere neigen dazu, unvollständige Gonadenextrusionen zu durchlaufen, was sie schwer sichtbar macht.
   1. Bei der Beurteilung späterer Stadien der Meiose, wie Diakinese, sezieren Sie ältere Erwachsene (48 h nach L4), da sie mehr Kerne im Diakinesestadium akkumulieren, was die Analyse vereinfacht. Forscher sollten jedoch die Möglichkeit beachten, dass einige Effekte durch fortgeschrittenes Alter der Mutter verursacht werden können.
2. Bereiten Sie sich auf die Dissektion vor.
   1. M9 vorbereiten: 3 g KH2PO4 (monobasisch), 6 g Na2HPO4 (dibasisch), 5 g NaCl zugeben und _ddH2Oauf 100 ml geben. Autoklavieren Sie die Lösung für 20 min bei 121 °C, lassen Sie sie abkühlen und fügen Sie dann 1 ml 1 M_MgSO4 in steriler Technik hinzu.
   2. Sezierpuffer vorbereiten: Mischen Sie 1 μL 10% Tween 20, 12 μL 100 mM Levamisol, 10 μL 10x M9 und 77 μL_ddH2O.
      HINWEIS: Tween 20 ist im Sezierpuffer enthalten, um die Oberflächenspannung zu reduzieren und die Gewebemembranen weiter zu permeabilisieren.
   3. Fixlösung vorbereiten (2% PFA [100 μL]): Mischen Sie 12,5 μL 16% Paraformaldehyd (PFA), 10 μL 10x M9 und 77,5 μL_ddH2O; Achten Sie darauf, eine frische Ampulle PFA zu verwenden (nicht länger als 2 Wochen geöffnet).
      VORSICHT: PFA ist eine gefährliche Chemikalie, und die feste Lösung sollte im Abzug vorbereitet werden.
   4. Richten Sie die Gefriermethode ein - flüssiger Stickstoff ist einfacher zu handhaben, aber bei Bedarf kann ein Aluminiumblock auf Trockeneis verwendet werden.
      1. Flüssigstickstoffmethode: Stellen Sie ein Kunststoffbecherglas oder ein Kunststoff-Coplin-Glas in eine Styroporbox. Füllen Sie das Becherglas mit flüssigem Stickstoff (Überlauf in den Styroporbehälter ist in Ordnung). Stellen Sie die Pinzette in die Nähe. Idealerweise sollte das Becherglas schmal genug sein, um zu verhindern, dass Objektträger vollständig horizontal fallen - Objektträger sollten in einer Neigung liegen und mit einer Pinzette leicht zu greifen sein.
         HINWEIS: Es ist wichtig, Kunststoffbehälter zu verwenden, wenn mit flüssigem Stickstoff anstelle von Glas gearbeitet wird, um ein Zerbrechen durch schnelles Abkühlen zu vermeiden.
      2. Trockeneismethode:
         1. Legen Sie einen flachen Aluminiumblock auf Trockeneis in einen Styroporbehälter oder rechteckigen Eiskübel. Es ist einfacher, die Dias einzufrieren, wenn sich die Oberseite des Blocks über der Oberseite des Behälters befindet.
         2. Drücken Sie mit Handschuhen vorsichtig auf den Aluminiumblock, um einen guten Kontakt mit Trockeneis zu gewährleisten und den Kühlvorgang zu beschleunigen (es kann ein Kreischen auslösen, wenn das Metall schnell abkühlt). Stellen Sie eine Rasierklinge in die Nähe.
         3. Lassen Sie den Aluminiumblock mindestens 30 Minuten vor dem Gefrier-Crack-Stopp auf Trockeneis, um eine vollständige Abkühlung zu ermöglichen, die für ein schnelles Einfrieren erforderlich ist.
            HINWEIS: Idealerweise sollten feste Trockeneisblöcke verwendet werden, die dazu beitragen, dass die Oberfläche eben bleibt. Bei Bedarf kann Aluminiumblock auf Trockeneispellets gelegt werden, aber es sollte darauf geachtet werden, dass die Oberfläche eben bleibt.
         4. Die Oberfläche des Aluminiumblocks sammelt Frost, was einen engen Kontakt zwischen den Schienen und dem Block verhindern kann. Verwenden Sie die Rasierklinge, um Frost von der Oberfläche abzukratzen und einen Bereich für jede Folie freizugeben. Das Abdecken des Styroporbehälters mit einem Deckel hilft, eine übermäßige Frostansammlung zu verhindern.
   5. Füllen Sie ein Coplin-Glas mit ~ 40 ml 95% Ethanol.
   6. Füllen Sie drei Coplin-Gläser mit ~ 40 ml PBS-T.
      HINWEIS: Um PBS-T herzustellen, mischen Sie 100 ml 10x PBS, 5 ml Triton X-100 und 2 ml 0,5 M EDTA (pH 8). Fügen Sie 873 ml ddH2O hinzu. Kräftig schütteln, um Triton X-100 aufzulösen. Um 10x PBS herzustellen, mischen Sie 25,6 g Na_{2 HPO}4·7H 2 O, 80 g NaCl, 2 g KCl und 2 g KH₂PO₄. Fügen Sie ddH₂O hinzu, um das Volumen auf 1 L zu erhöhen. Autoklav für 40 min bei 121 °C. Das Waschmittel Triton X-100 ist im Waschpuffer PBS-T enthalten, um die Oberflächenspannung zu reduzieren und die Retention ganzer Tiere auf dem Objektträger zu verbessern.
3. Sezieren Sie die Tiere auf einem 18 mm x 18 mm großen Glasdeckglas. Dieser Schritt ist aufgrund der Verdampfung des Sezierpuffers zeitkritisch. Es sollte weniger als 5 Minuten dauern, um die Dissektionen abzuschließen.
   HINWEIS: Levamisol wird verwendet, um Tiere zu immobilisieren, um sie leichter zu sezieren, aber wenn sie zu lange in Levamisol bleiben, führt dies zu einer schlechten Gonadenextrusion. Es ist am einfachsten, die Anzahl der pro Objektträger sezierten Tiere zu reduzieren, um in den Zeitrahmen von 5 Minuten zu passen.
   1. Legen Sie einen Objektträger auf den Tisch eines Seziermikroskops - der Halteobjektträger wird verwendet, um das Deckglas leichter zu bewegen, und kann unbegrenzt wiederverwendet werden (Abbildung 2A, linkes Foto).
   2. Legen Sie das Deckglas auf den Halteobjektträger und pipieren Sie 4 μL der Sezierlösung in die Mitte des Deckglases. Bewegen Sie den Halteschieber auf eine Seite der Bühne, um die Sicht freizugeben.
   3. Picken Sie 10-20 Hermaphroditen in den Tropfen der Sezierlösung. Wählen Sie genügend Tiere, um ~10 pro Dia abzubilden, aber nicht so viele, dass sie nicht innerhalb von 5 Minuten seziert werden können.
   4. Sezieren Sie die Tiere mit zwei Spritzennadeln, eine für jede Hand (Abbildung 2A).
      1. Kreuzen Sie die Spitzen der Nadeln, um eine X-Form zu bilden, und verwenden Sie die Unterseite des X, um einen Erwachsenen an die Oberfläche des Deckglases zu heften.
         HINWEIS: Es kann Übung erfordern, um den besten Weg zu finden, jede Nadel in Bezug auf Winkel und Drehung zu halten. Beginnen Sie, indem Sie die Nadeln mit ihrer Fase (schräge Kante) nach unten halten. In der Diskussion finden Sie Vorschläge zum ersten Erlernen des Sezierens in einem größeren Band (Abbildung 2D).
      2. Positionieren Sie die X-Form unmittelbar hinter dem Pharynx, etwa 1/5 der Körperlänge eines jungen Erwachsenen oder knapp unter dem klaren Teil des Kopfes (Abbildung 2A, rechtes Diagramm).
      3. Enthaupte das Tier mit einer Scherenbewegung (wie das Schneiden von Futter mit Messer und Gabel). Eine gute Extrusion führt dazu, dass sich ein Arm der Gonade (oder manchmal beide Arme) zusammen mit einer oder beiden Darmhälften vollständig aus der Körperhöhle löst (Abbildung 2B, linkes Bild). Der Darm erscheint dunkler und von einheitlicher Breite, während die Gonade mit einer distalen konischen Spitze klar erscheint.
         1. Jedes Tier sollte nur einmal geschnitten werden; Wenn die Gonade nach dem Schnitt nicht extrudiert, gehen Sie einfach zum nächsten Tier über. Der erste Schnitt reduziert den hydrostatischen Druck in der Karosserie erheblich, was weitere Schnitte unwahrscheinlich macht, was zu einer besseren Extrusion führt. Unvollständige oder schlechte Extrusionen sind während der Bildgebung gut sichtbar und können ignoriert werden (Abbildung 2B, rechtes Bild).
            HINWEIS: Versuchen Sie nicht, die Gonade vom Kadaver zu trennen - dies reißt normalerweise das Gewebe und begrenzt die Anzahl der meiotischen Stadien, die analysiert werden können.
      4. Wiederholen Sie die Dissektion für die restlichen Tiere auf dem Deckbeleg.
4. Fixieren Sie die Probe mit Formaldehyd.
   1. Sanft arbeiten 4 μL der fixen Lösung auf dem Deckglas sehr nahe am Tropfen mit Tieren. Im Idealfall sind die Tropfen nahe genug, um miteinander zu verschmelzen. Vermeiden Sie es, direkt in den Präpariertropfen zu pipettieren und die sezierten Schlachtkörper zu verdrängen.
   2. Stecken Sie das Deckglas mit einem Finger an den Halteschieber. Mit der anderen Hand streichen Sie das Deckglas ein paar Mal vorsichtig, um die Tropfen zu mischen. Die endgültige Fixkonzentration beträgt 0,8% PFA.
   3. Halten Sie ein positiv geladenes Dia von vorne nach unten gedrückt und heben Sie damit das Deckglas in der Mitte des Objektträgers auf. Berühren Sie vorsichtig den Probentropfen, und die Oberflächenspannung des Tropfens nimmt das Deckglas auf.
      HINWEIS: Positiv geladene Objektträger haben eine elektrostatische Beschichtung, die dem Gewebe hilft, an der Oberfläche zu haften, um Probenverlust zu verhindern.
      1. Falls gewünscht, positionieren Sie das Deckglas diagonal, so dass eine Ecke um 1 mm von der Ober- oder Unterkante des Objektträgers abhängt. Das Verlassen eines Überhangs erleichtert das Abbrechen des Deckglases nach dem Einfrieren (Abbildung 2C).
   4. Stellen Sie den Schieber auf die Bank und fixieren Sie ihn für genau 5 min bei RT. Beschriften Sie die Folie während dieser Zeit mit einem Bleistift.
      HINWEIS: Es ist üblich, die Proben zu überfixieren, was durch einen Ausschluss von Antikörpern aus Kernen oder sogar allen Geweben nachgewiesen werden kann. Darüber hinaus sind einige Antikörper besonders empfindlich gegenüber Formaldehyd. In diesen Fällen reduzieren Sie die Fixierungszeit oder verringern Sie die Endkonzentration des verwendeten Formaldehyds.
5. Gefrier-Crack
   1. Unmittelbar nach der Korrektur frieren Sie die Folien ein.
      1. Bei Verwendung von flüssigem Stickstoff: Halten Sie den beschrifteten Rand des Objektträgers mit einer Pinzette fest und senken Sie ihn vorsichtig in flüssigen Stickstoff. Lassen Sie den Schieber so los, dass er sich mit der Deckseite nach oben an die Seite des Becherglases lehnt. Objektträger werden innerhalb von 10 s eingefroren (sobald die Flüssigkeit aufhört zu kochen).
      2. Bei Verwendung von Trockeneis: Kratzen Sie den Frost mit einem Rasiermesser von der Oberfläche des Aluminiumblocks. Halten Sie die beschriftete Kante des Objektträgers fest und legen Sie sie auf die freigemachte Oberfläche, wobei Sie etwas Druck nach unten ausüben, um vollen Kontakt mit dem Block zu gewährleisten. Das Deckglas sollte sich vollständig auf der Blockoberfläche befinden. Das Einfrieren erfolgt innerhalb von 10 s und kann visuell bestätigt werden, wenn die Probe unter dem Deckglas zu Eis wird.
      3. Lassen Sie die Objektträger bei beiden Methoden mindestens 5 Minuten einfrieren.
         HINWEIS: Nach dem Einfrieren können die Objektträger 15-20 min in flüssigem Stickstoff oder auf dem Block belassen werden, solange sie gefroren bleiben. Auf diese Weise können in dieser Phase mehrere Objektträger gesammelt werden, bevor mit dem Cracking-Schritt fortgefahren wird.
   2. Arbeiten Sie schnell, brechen Sie das Deckglas von der Probe. Dieser Schritt ist zeitkritisch. Entfernen Sie das Deckglas und tauchen Sie den Objektträger in Ethanol, bevor die Probe aufzutauen beginnt.
      1. Entfernen Sie den gefrorenen Objektträger (mit einer Pinzette für flüssigen Stickstoff).
      2. Fassen Sie die beschriftete kurze Kante der Rutsche fest und stützen Sie eine lange Kante gegen die Bank.
      3. Fassen Sie mit der anderen Hand ein Rasiermesser fest und schieben Sie die Rasiererkante die Folie hinunter, um das Deckglas von der Probe wegzustreichen. Dieser Schritt ist etwas einfacher, wenn das Deckglas mit einem Ecküberhang positioniert ist (Abbildung 2C).
6. Legen Sie den Objektträger sofort in ein Coplin-Glas mit 95% Ethanol bei RT. Lassen Sie die Objektträger mindestens 5 Minuten in Ethanol.
   HINWEIS: Objektträger können für eine Weile in Ethanol belassen werden - so können in diesem Schritt mehrere Objektträger gesammelt werden, bevor sie mit dem Waschen fortfahren. Folien können bei diesem Schritt auch für mehrere Tage gespeichert werden. Wenn Sie es lagern, stellen Sie das Coplin-Glas mit Objektträgern in Ethanol auf -20 °C.
7. Waschen Sie die Objektträger in PBS-T dreimal für jeweils 5 Minuten bei RT. Verwenden Sie frisches PBS-T für jede Wäsche.
8. Wenn Sie mit Antikörpern färben, fahren Sie mit Schritt 3 (Antikörperfärbung) fort. Wenn Sie nur mit DAPI Färbung durchführen, um Chromosomen sichtbar zu machen, fahren Sie mit Schritt 4 (Montage und Bildgebung) fort.

3. Antikörperfärbung

1. Inkubation primärer Antikörper
   HINWEIS: Bei der Ausarbeitung geeigneter Bedingungen für neue Antikörper ist es wichtig, die folgenden Negativkontrollen einzubeziehen, um die Spezifität des Fluoreszenzsignals zu überprüfen: 1) Ein Objektträger, dem ein primärer Antikörper fehlt und der nur einen sekundären Antikörper aufweist; 2) Ein Objektträger mit nur einem primären Antikörper, dem ein sekundärer Antikörper fehlt. Jede dieser Negativkontrollen sollte ein vollständiges Signalversagen erzeugen. Wenn auf dem sekundären Antikörper-Only-Objektträger eine Fluoreszenz festgestellt wird, sollte die sekundäre Antikörperverdünnung erhöht oder eine andere sekundäre verwendet werden. Wenn Fluoreszenz auf dem primären Antikörper-Objektträger identifiziert wird, ist dies wahrscheinlich auf Autofluoreszenz oder andere potenzielle Verunreinigungen zurückzuführen.
   1. Verdünnen Sie den primären Antikörper in Antikörperverdünnungspuffer (50 mg BSA + 50 μL 10% Natriumazid + 10 ml PBS-T) - bereiten Sie genügend Antikörperverdünnung vor, um 20-30 μL pro Objektträger zu verwenden.
   2. Bereiten Sie eine feuchte Kammer vor: Legen Sie den Boden eines Kunststoffbehälters mit einem luftdichten Deckel mit feuchten Papiertüchern aus. Legen Sie eine einzelne Schicht Glaspasteurpipetten auf die Papiertücher. Diese Pipeten schaffen eine Oberfläche, die es den Objektträgern ermöglicht, waagerecht zu bleiben und sie von den Papierhandtüchern entfernt zu halten.
      HINWEIS: Für feuchte Kammern ist es am besten, Aufbewahrungsbehälter aus Kunststoff mit Schnappdeckeln zu verwenden, was das Öffnen und Schließen des Behälters erleichtert, ohne die Objektträger darin zu stören. Suchen Sie nach einem, der lang genug für die Pasteur-Pipets ist, aber auch einen relativ flachen Boden ohne Vertiefungen hat, damit die Objektträger vollständig horizontal ruhen können.
   3. Entfernen Sie den Objektträger von der letzten PBS-T-Wäsche. Arbeiten Sie von diesem Schritt an schnell, um die Probe jederzeit nass zu halten und Verdunstung zu vermeiden. Wenn die Probe austrocknet, wird die Antikörperfärbung negativ beeinflusst.
   4. Trocknen Sie die gesamte Oberfläche des Objektträgers mit einem zu einem kompakten Rechteck gefalteten Wischtuch. Wischen Sie die Vorder- und Rückseite des Objektträgers ab, lassen Sie jedoch genügend Platz um die Probe herum. Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie die Oberfläche in der Nähe der Probe trocknen - vermeiden Sie es, zu nahe an die Probe heranzukommen, da dadurch ein Bereich von der Größe des Deckglases ungetrocknet bleibt. Stellen Sie jedoch sicher, dass der Umfang der Probe für den nächsten Schritt trocken ist.
   5. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben PAP-Stift einen Kreis um die Probe. Achten Sie darauf, den gesamten Probenbereich einzuschließen, aber vermeiden Sie es, die auf der Oberfläche des Objektträgers sichtbaren Tierkadaver zu stören. Warten Sie ~5 s, damit die Barriere vollständig trocknen kann.
      HINWEIS: Eine hydrophobe Barriere ist notwendig, um die primäre Antikörperlösung aufzunehmen, da die Oberfläche des Objektträgers mit PBS-T beschichtet wurde, das ein Reinigungsmittel enthält. Der PAP-Pen funktioniert am besten auf einer trockenen Objektträgeroberfläche, daher ist es wichtig, einen trockenen Umfang um die Probe herum zu schaffen. Wenn der Bereich, der der Probe am nächsten liegt, ungetrocknet bleibt, wird die Probe während dieses Schrittes geschützt
   6. Arbeiten Sie schnell und verwenden Sie die Ecke oder den Rand des gefalteten Wischgewebes, um Flüssigkeit von der Probe innerhalb der hydrophoben Barriere wegzuleiten. Achten Sie darauf, Tierkadaver nicht zu stören.
   7. Sofort werden 20 μL der primären Antikörperlösung in den durch die hydrophobe Barriere erzeugten Ring pipet. Achten Sie darauf, vorsichtig und schräg zu pfeifen, um zu vermeiden, dass die Schlachtkörper gestört werden. Vermeiden Sie es, direkt auf einen Schlachtkörper zu pipettieren.
   8. Neigen Sie den Objektträger vorsichtig, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche innerhalb der hydrophoben Barriere von der Lösung bedeckt ist.
      HINWEIS: Es ist am besten, wenn die hydrophoben Barrieren einen Innenumfang von 1-1,5 cm haben, der vollständig von 20 μL der Antikörperlösung bedeckt ist. Die Breite des Umfangs hängt davon ab, wie sich die Schlachtkörper während des Gefrier-Riss-Schritts verteilen. Breitere Barrieren erfordern möglicherweise ein höheres Volumen an Antikörperlösung. Auf Wunsch können kleine Quadrate aus Parafilm (zugeschnitten auf die Größe des 18 mm x 18 mm großen Deckglases) vorsichtig auf die Probe gelegt werden. Die Parafilmquadrate sorgen dafür, dass die Antikörperlösung die gesamte Probe bedeckt und tragen auch dazu bei, die Verdunstung zu verhindern.
   9. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.3-3.1.8 für die restlichen Folien.
   10. Bringen Sie die Objektträger vorsichtig in die Feuchtkammer, um sicherzustellen, dass die Lösung in der hydrophoben Barriere enthalten bleibt und dass die Objektträger vollständig eben ruhen.
   11. Je nach Antikörper kann dieser Schritt auf 6 h verkürzt oder über Nacht bei 4 °C durchgeführt werden, indem die Feuchtkammer in einem Kühlraum oder einem Kühlschrank aufbewahrt wird.
       HINWEIS: Die Verwendung einer feuchten Kammer und hydrophober Barrieren ist in der Regel ausreichend, um die Verdampfung der Antikörperlösung zu verhindern, selbst bei langen Inkubationen über Nacht. Wenn sich die Verdunstung jedoch als Problem erweist, können kleine Quadrate aus Parafilm vorsichtig auf jede Probe gelegt werden, was dazu beiträgt, eine Verdunstung zu verhindern. Diese können im ersten Waschschritt entfernt werden: Tauchen Sie jeden Objektträger in ein mit PBS-T gefülltes Coplin-Glas (das keine anderen Objektträger enthält) und lassen Sie den Parafilm von der Probe wegschwimmen. Entfernen Sie den Parafilm aus dem Coplin-Glas, bevor Sie dasselbe Glas verwenden, um den Parafilm vom nächsten Dia zu entfernen.
2. Waschen Sie die Objektträger in Coplin-Gläsern mit ~ 40 ml PBS-T dreimal für jeweils 5 Minuten bei RT. Verwenden Sie frisches PBS-T für jede Wäsche.
   1. Während dieser Wäschen wird der sekundäre Antikörper im Antikörperverdünnungspuffer verdünnt. Bereiten Sie genügend Antikörperverdünnung vor, um 20-30 μL pro Objektträger zu verwenden. Es ist üblich, Alexa Fluor konjugierte sekundäre Antikörper zu verwenden, die bei 1:200 verdünnt sind.
3. Sekundäre Antikörperinkubation
   1. Entfernen Sie den Objektträger von der letzten PBS-T-Wäsche. Arbeiten Sie von diesem Schritt an schnell, um die Probe jederzeit nass zu halten und Verdunstung zu vermeiden.
   2. Trocknen Sie den Objektträger mit einem gefalteten Wischtuch. Vermeiden Sie es, den von der hydrophoben Barriere eingeschlossenen Bereich auszutrocknen.
   3. Arbeiten Sie schnell und verwenden Sie die Ecke oder den Rand des gefalteten Wischgewebes, um Flüssigkeit von der Probe innerhalb der hydrophoben Barriere wegzuleiten. Achten Sie darauf, die Tierkadaver nicht zu stören.
   4. Sofort werden 20 μL der sekundären Antikörperlösung in den durch die hydrophobe Barriere erzeugten Ring pipet. Achten Sie darauf, vorsichtig und schräg zu pipetern, um eine Unterbrechung der Schlachtkörper zu vermeiden.
   5. Vermeiden Sie es, direkt auf einen Schlachtkörper zu pipettieren. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche innerhalb der hydrophoben Barriere von der Lösung bedeckt ist. Breitere Barriereumfänge können ein höheres Volumen an Antikörperlösung erfordern. Falls gewünscht, bedecken Sie die Probe mit einem kleinen Quadrat Parafilm (siehe Hinweis unten Schritt 3.1.8).
   6. Bringen Sie den Objektträger vorsichtig in die Feuchtkammer, um sicherzustellen, dass die Lösung in der hydrophoben Barriere enthalten bleibt und dass der Objektträger vollständig eben ruht. Setzen Sie den Deckel der feuchten Kammer wieder auf, um den Objektträger im Dunkeln zu halten.
   7. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.1-3.3.6 für die restlichen Folien.
   8. Inkubieren Sie im Dunkeln für 4 h bei RT.
      HINWEIS: Je nach Antikörper kann dieser Schritt auf 2 h verkürzt oder auf 6 h verlängert werden. Wenn die feuchte Kammer nicht dunkel ist, legen Sie sie in eine Schublade oder decken Sie sie mit einem Karton ab. Alternativ kann die Feuchtkammer in Aluminiumfolie eingewickelt werden, um die Dias im Dunkeln zu halten.
4. Waschen Sie die Objektträger in Coplin-Gläsern mit ~ 40 ml PBS-T dreimal für jeweils 5 Minuten bei RT. Verwenden Sie frisches PBS-T für jede Wäsche.

4. Montage und Bildgebung

1. Bereiten Sie sich auf die Montage der Probe vor, indem Sie Montagemedium + DAPI (2 μg/ml), 18 mm x 18 mm Glasdeckgläser und Nagellack in Reichweite haben.
2. Entfernen Sie den Objektträger aus der Endwäsche und trocknen Sie ihn mit einem gefalteten Wischtuch ab. Vermeiden Sie es, den von der hydrophoben Barriere eingeschlossenen Bereich auszutrocknen.
3. Mit der Ecke des gefalteten Wischtuchs vorsichtig Flüssigkeit aus der Probe in der Barriere ableiten. Entfernen Sie bei diesem Schritt die meiste Flüssigkeit, ohne die Schlachtkörper vollständig austrocknen zu lassen.
4. Wenn Sie schnell arbeiten, fügen Sie 8 μL des Montagemediums zur Probe hinzu. Pipeten Sie vorsichtig und schräg, um eine Unterbrechung der Schlachtkörper zu vermeiden. Vermeiden Sie es, direkt auf die Schlachtkörper zu pipettieren.
5. Immer noch schnell arbeitend, senken Sie vorsichtig ein Glasdeckglas auf die Probe.
   1. Luftblasen können die Bildgebung stören und zu einer Verschlechterung der Probe führen. Um Luftblasen zu minimieren, legen Sie eine Kante des Deckglases auf den Objektträger neben der Probe, so dass sie diagonal über der Probe gehalten wird. Es kann helfen, den oberen Rand des Deckglases auf einen Bleistift oder eine Pinzette zu legen. Dann senken Sie langsam die höhere Kante des Deckglases nach unten - diese Bewegung ermöglicht es dem Montagemedium, eine Flüssigkeitsdichtung zu erzeugen, die von einer Kante zur gegenüberliegenden Kante fortschreitet.
6. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.5 für die restlichen Folien.
7. Versiegeln Sie die Deckgläser mit Nagellack. Achten Sie darauf, nicht auf das Deckglas zu drücken (wodurch die Probe zerquetscht wird) oder das Deckglas horizontal zu verschieben (wodurch die Probe verschmiert wird).
   1. Fügen Sie einen kleinen Punkt Nagellack zu jeder Ecke eines Deckglases hinzu (~ 1 mm breit). Diese helfen, das Deckglas an Ort und Stelle zu halten. Lassen Sie die Punkte vollständig trocknen.
   2. Wenn die Ecken vollständig trocken sind, versiegeln Sie die Kanten mit Nagellack. Stellen Sie sicher, dass die Politur die Lücke zwischen Deckglas und Objektträger vollständig ausfüllt, aber vermeiden Sie es, das Deckglas zu sehr mit der Probe zu bedecken. Es ist am besten, eine Überlappung von 1 mm auf dem Deckglas beizubehalten. Verwenden Sie nur so viel Nagellack wie nötig. Vermeiden Sie zu viel oder überschüssige Politur, da das Trocknen lange dauern kann und das Mikroskopobjektiv beschädigt werden kann.
      HINWEIS: Es ist vorzuziehen, farbigen Nagellack anstelle von klar zu verwenden, was es einfacher macht, die Grenze der Robbe zu sehen und zu verhindern, dass Tiere unter der Nagellackgrenze liegen.
   3. Lassen Sie den Nagellack vor der Bildgebung vollständig trocknen. Dieser Schritt ist wichtig, da nasser Nagellack Mikroskopobjektive stark beschädigen kann.
      HINWEIS: Dias sollten von nun an so weit wie möglich im Dunkeln gehalten werden. Verwenden Sie einen flachen Karton, um sie abzudecken, während sie auf der Bank trocknen.
8. Lagern Sie die Dias vor der Aufnahme 1-2 Wochen im Dunkeln bei 4 °C. Lagern Sie die Dias bei Bedarf länger bei -20 °C.
9. Bild mit Standard-Fluoreszenzverbindungs-Lichtmikroskopie.
   1. Untersuchen Sie für jeden Objektträger zunächst die gesamte Probe 10x im DAPI-Kanal, um gut extrudierte Gonaden zu identifizieren und ihre Platzierung zu notieren. Vermeiden Sie für die meisten Anwendungen die Abbildung von Gonaden, die durchtrennt, unvollständig oder teilweise von einem anderen Teil des Tieres bedeckt sind. Bei den meisten Tieren ist nur ein Gonadenarm vollständig extrudiert und sichtbar.
      HINWEIS: Es kann hilfreich sein, ein Bild mit geringerer Vergrößerung bei 10x der gesamten Gonade im DAPI-Kanal aufzunehmen, um es später zu orientieren oder die Position bestimmter Kerne zu identifizieren.
   2. Je nach Anwendung können Bilder mit 40x, 63x oder 100x aufgenommen werden. Wenn die gesamte Gonade erfasst werden soll, erstellen Sie eine Montage mit überlappenden Grenzen. Denken Sie bei der Bildgebung daran, dass die Gonade eine hohle Röhre ist, mit den dichtesten Kernen oben und unten.

Ergebnisse

DAPI bindet stark an DNA und seine Färbung ist auch unter einer Vielzahl von Bedingungen robust (Abbildung 3A,B). Es sollte in allen Kernen vorhanden sein und macht daher eine wirksame Positivkontrolle für das Vorhandensein von Wurmgewebe auf dem Objektträger und die Fähigkeit, Fluoreszenz am Mikroskop zu erkennen. Die Färbung ist wirksam, wenn der Antikörper in meiotischen Kernen vorhanden ist (Abbildung 3A,B). Zum Beispiel zeigt Abbildung 3A,B mittlere Pachytenkerne, die mit DAPI und einem Antikörper gegen RAD-51, einen Marker für Doppelstrangbrüche, gefärbt sind. KLE-2 ist Bestandteil von Condensin, einem hochkonservierten Proteinkomplex, der Chromosomen in Vorbereitung auf Mitose und Meiose strukturiert. kle-2/+-Mutanten weisen geringfügige Defekte in der Chromosomenstruktur auf, wie eine leicht ungeordnete DAPI-Färbung und eine Zunahme der Doppelstrangbruchzahl zeigen, die sich in der höheren Anzahl von RAD-51-Herden widerspiegelt (Abbildung 3B). Ein häufiger Fehler bei der Immunfluoreszenz besteht darin, die Probe zu lange in der fixierten Lösung zu belassen. Eine Überfixierung kann zu einer erfolglosen Färbung führen, da sie normalerweise verhindert, dass Antikörper in Zellkerne diffundieren. Dieser Fehler kann identifiziert werden, wenn der Antikörper in den zytoplasmatischen Regionen der Gonade diffundiert, aber aus den Kernen ausgeschlossen zu sein scheint.

In der Keimbahn (Abbildung 1) vermehren sich Kerne mitotisch an der distalen Spitze, treten während der Übergangszone in die Meiose ein und schreiten durch Pachyten (das oft durch eine Reihe von Kernreihen in drei gleiche Stadien unterteilt ist), bevor sie in Diploten und schließlich in die Diakinese eintreten. Eizellen in der Diakinese werden basierend auf ihrer Nähe zur Spermathhek nummeriert, wobei die -1-Eizelle am nächsten zur Spermathhek ist, die -2-Eizelle die nächste distale ist und so weiter. C. elegans haben sechs Chromosomen, die sich als kompakte Ovale in Diakinesekernen manifestieren. Jede von ihnen repräsentiert ein homologes Paar von zwei Schwesterchromatiden, die durch ein Chiasma, auch bivalent genannt, zusammengehalten werden (Abbildung 3C). Mutanten wie spo-11, die die Crossover-Bildung stören, können keine Chiasmata bilden; Daher haben Diakinesekerne 12 separate DAPI-Körper (auch univalente Körper genannt), einen für jede Schwesterchromatide (Abbildung 3D).

Abbildung 1: Keimbahnkerne sind räumlich-zeitlich angeordnet, was ihren Verlauf durch Meiose darstellt . (A) Ganzer junger erwachsener Hermaphrodit, der mit DAPI gefärbt ist. Gonaden- und meiotische Stadien werden umrissen, von der distalen Spitze (Sternchen) bis zur proximalen Region (die -1-Eizelle, mit einem Pfeil gekennzeichnet), die die Spermatheca (Dreieck) enthält. Maßstabsbalken stellt 100 μm dar. (B) Projiziertes Fluoreszenzbild einer sezierten Hermaphroditengonade, die mit DAPI gefärbt ist. Meiotische Stadien werden bezeichnet, wobei repräsentative Kerne in Einsätzen dargestellt sind (alle Einschübe sind so dargestellt, dass sie miteinander skalieren). Kerne können leicht basierend auf ihrer Position in der Keimbahn und der charakteristischen Chromosomenmorphologie inszeniert werden, die von der mitotischen Zone an der distalen Spitze (Sternchen) zur Übergangszone durch Pachyten, Diploten und Diakinese fortschreiten. Die Spermatheca ist durch ein Dreieck markiert. Diese Abbildung wurde von Hillers et al. unter der Lizenz CC BY 3.0²⁸ angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Demonstration des Dissektionsaufbaus . (A) Mikroskoptisch während der Dissektion. Die Tiere werden in 4 μL Dissektionslösung auf einem Deckglas auf dem Halteobjektträger seziert, das verwendet wird, um das Deckglas in Sicht zu bringen. Das Diagramm zeigt die ideale Nadelplatzierung. Nadeln werden mit einer abgeschrägten Kante nach unten gehalten, die über die Rachenregion gekreuzt ist. Rosa Pfeile zeigen eine scherenartige Bewegung für Nadeln. Die rosa gestrichelte Linie zeigt die ideale Schnittposition. (B) Bilder von sezierten Tieren mit einem Beispiel einer vollständigen und einer unvollständigen Extrusion. Abschnitte von extrudierten Gonaden und Eingeweiden sind beschriftet. (C) Abbildung, die den Gefrier-Riss-Schritt demonstriert. Der Schlitten sollte fest in einer Hand gehalten werden, wobei die Deckglasseite vom Körper abgewandt ist. Die gegenüberliegende Kante ist gegen die Bank gespannt. Das Rasiermesser sollte in der anderen Hand gehalten werden. Der rosa Pfeil zeigt die Bewegungsrichtung an, in der das Rasiermesser das Deckglas vom Objektträger streicht, mit einer leichten Drehung, so dass das Deckglas vom Körper wegfliegt. Beachten Sie, dass das Deckglas so platziert wurde, dass eine Ecke über den langen Rand des Objektträgers hängt. (D) Abbildung des Aufbaus für die Dissektionspraxis in einer Glasschale zur Färbung von Embryonen. Die Tiere werden in 50-200 μL Dissektionslösung gegeben, was das Problem der Verdunstung negiert und die Zeit für die Dissektion verlängert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Repräsentative Fluoreszenzergebnisse von Keimbahnkernen. (A,B) Z-Stack-Projektionen von späten Pachytenkernen, gefärbt mit RAD-51-Antikörpern (grün) und DAPI (rot) in (A) Wildtyp- und (B) kle-2/+-Heterozygoten. (C,D) Z-Stack-Projektionen eines einzelnen Diakinesekerns, der mit DAPI gefärbt wurde, in (C) Wildtyp- (mit sechs DAPI-Färbekörpern) und (D) spo-11-Mutanten (mit 12 DAPI-Färbekörpern). Maßstabsbalken repräsentieren 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diskussion

Die sexuelle Fortpflanzung erfordert die Bildung haploider Gameten, die durch die spezialisierte Zellteilung der Meiose produziert werden. C. elegans ist aufgrund seiner optischen Transparenz, seiner bequemen Keimbahnanatomie und seiner leistungsstarken Genetik zu einem beliebten Modell für die zytologische Untersuchung der Meiose geworden²⁸. Einfache organismische Experimente zur Beurteilung der Fruchtbarkeit und embryonalen Letalität können mit Molekulargenetik kombiniert werden, um viele Fragen im Labor oder im Klassenzimmer zu beantworten. Da zum Beispiel Crossover für die richtige Chromosomentrennung unerlässlich sind, erzeugen Prozesse, die ihre Bildung oder Auflösung stören, aneuploide Gameten. Im Gegenzug führt Aneuploidie zu nicht lebensfähigen Nachkommen, die leicht durch Zählen von Nachkommen oder durch die etwas kompliziertere Methode zur Bestimmung der embryonalen Letalität beurteilt werden können. Zytologisch beeinflusst ein Mangel an Crossovers die Anzahl der DAPI-Färbekörper, die während der Diakinese beobachtet werden. Die Robustheit der DAPI-Färbung und die einfache Bewertung machen dies zu einem idealen Experiment, um zytologische Techniken zu lehren. Die zeitlich-räumliche Anordnung der Kerne in der Hermaphroditenkeimbahn liefert eine Momentaufnahme jedes Stadiums der Meiose zu einem einzigen Zeitpunkt. Kerne brauchen etwa 54 Stunden, um vom distalen mitotischen Ende der Keimbahn zum proximalen Ende zu gelangen (zum Beispiel siehe Jaramillo-Lambert et al.33, Stamper et al.34 und Libuda et ^al.35). Dieses gut etablierte Timing des meiotischen Fortschritts ermöglicht die Pulsjagd oder DNA-schädigende Experimente.

Da die DAPI-Färbung fast immer funktioniert, dient sie als nützliche technische Kontrolle für die Fluoreszenzmikroskopie (und kann Mikroskopikern in der Ausbildung Zufriedenheit bieten). Die Antikörperfärbung kann variabler sein und ist ein gutes Maß für die Reproduzierbarkeit zwischen Replikaten. C.elegans-Gonaden können schwierig konsistent zu beheben sein, da dieser Schritt ein Gleichgewicht zwischen der Erhaltung der Chromosomenstruktur und der Ermöglichung einer ausreichenden Antikörperdiffusion erfordert. Die Fixierung mit Formaldehyd bewahrt am besten die chromosomale Morphologie, und die Herstellung von Formaldehyd frisch aus Paraformaldehydampullen hat die reproduzierbarsten Ergebnisse geliefert. Es ist auch möglich, Formaldehyd aus Formalin (37% wässriges Formaldehyd und Methanol) zu verwenden. Fixationsstärke und -zeitpunkt müssen möglicherweise für jeden Antikörper empirisch bestimmt werden. Alternative Methoden umfassen das Überspringen der Formaldehydfixierung in Schritt 2.4 und nach dem Gefriercracken das Eintauchen in 100%iges Ethanol bei -20 °C oder das Eintauchen in 100% Methanol für 10 min gefolgt von einem Eintauchen in 100% Aceton für 10 min bei -20 °C. Diese fixen Bedingungen ermöglichen eine bessere Antikörperpenetration, wirken sich jedoch negativ auf die Gewebemorphologie aus (Chromosomen sehen ausgeblasen und geschwollener aus).

Das Timing ist sehr wichtig für die in Schritt 2 beschriebenen Dissektions- und Korrekturschritte. Da das Volumen der Dissektionslösung so klein ist, kann die Verdampfung die endgültige fixe Konzentration beeinflussen, was zu einer variablen Antikörperfärbung führt. Ein erfahrener C. elegans-Handler kann eine Folie in weniger als 2 Minuten nach dem Start (Schritt 2.3) vorbereiten, um sie zu reparieren (Schritt 2.4). Die größte technische Hürde ist die Fähigkeit, Tiere in den Tropfen der Sezierlösung zu pflücken und sie schnell zu sezieren. Es kann einfacher sein zu lernen, wie man in größeren Bänden seziert. Neue Auszubildende beginnen damit, Tiere in 50-200 μL Dissektionslösung in einer Glasschale mit Embryonenfärbung zu pflücken (Abbildung 2D); Die breitere Oberfläche bietet mehr Spielraum bei der Identifizierung einer idealen Nadelposition für gute Gonadenextrusionen, während das größere Flüssigkeitsvolumen die Verdampfung weniger problematisch macht. Sobald sie mit den Bewegungen des Sezierens vertraut sind, beginnen die Auszubildenden mit nur 50 μL in der Schale zu sezieren und wechseln dann zum Sezieren in 20 μL auf einem Objektträger. Nach dem Sezieren auf Objektträgern können die Auszubildenden schnell damit beginnen, die Lösungsmenge zu reduzieren, bis sie schnell genug in 4 μL arbeiten, um die Verdampfung vernachlässigbar zu machen.

Wenn der Zeitpunkt der Dissektion weiterhin ein Problem darstellt, können die Auszubildenden in Schritt 2.3 8 μL der Dissektionslösung sezieren. Während Schritt 2.4 können sie dann 8 μL der fixierten Lösung hinzufügen, vorsichtig pipettieren, um gründlich zu mischen (genau beobachten, dass die Schlachtkörper nicht gestört oder wegpipettiert werden) und 8 μL aus der Mischlösung entfernen. Dieser alternative Ansatz führt zum gleichen Endvolumen von 8 μL und zur gleichen endgültigen fixen Konzentration; Dieses Volumen ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Schlachtkörper während des Gefrierrisses in Schritt 2.5 sowohl die Deckglas- als auch die Objektträgeroberfläche berühren. Wenn der Zeitpunkt der Vorbereitung jedes Objektträgers auch bei größeren Dissektionsvolumina ein Problem bleibt, wird eine Suspensionsmethode für das Keimbahn-Immunfluoreszenzprotokoll von Gervaise und Arur²⁶ beschrieben.

Die Haupteinschränkung bei der Verwendung von Immunfluoreszenz zur Visualisierung von Proteinen in situ ist die Verfügbarkeit von primären Antikörpern, die auf ein bestimmtes Protein von Interesse abzielen. Wenn jedoch eine markierte Version des Proteins entwickelt wurde, kann dieses Protokoll angepasst werden, um das Protein-Tag zu visualisieren. Antikörper, die auf gängige Tags wie FLAG, HA oder GFP abzielen, sind allgemein verfügbar. Fluoreszierende Tags wie GFP können oft durch Fixierungsschritte gelöscht werden, daher wird empfohlen, einen primären Antikörper zu verwenden, der auf GFP abzielt, anstatt sich auf das native Fluoreszenzsignal selbst zu verlassen. Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass es die Keimbahn innerhalb eines einzigen Zeitrahmens erfasst (obwohl alle Stadien der Oogenese innerhalb der Keimbahn dargestellt werden). Daher kann diese Technik dynamische Veränderungen übersehen, die auftreten können, wenn eine Eizelle durch die Oogenese fortschreitet. Das Timing der Gametogenese ist jedoch bei C. elegans gut untersucht; Bei einem jungen Wildtyp-Erwachsenen benötigt eine Eizelle etwa 60 Stunden, um von der distalen Spitze der Keimbahn (der mitotischen Zone) zur Diakinese fortzuschreiten³³. Daher würde eine Pulsjagd oder spezifische Intervention wie Bestrahlung gefolgt von einem Zeitverlauf die Beobachtung von Effekten in verschiedenen Stadien der Meiose ermöglichen.

Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll die C. elegans-Gonadendissektion, gefolgt von DAPI und Antikörperfärbung für die Fluoreszenzmikroskopie . Das Zerlegen und Fixieren (Schritt 2) dauert 60-90 Minuten, abhängig von der Anzahl der erzeugten Objektträger. Die Antikörperfärbung (Schritt 3) ist meist freihändig und kann je nach Antikörperinkubationszeit von mindestens 7 h bis 1,5 Tagen reichen. Die Montage (Schritte 4.1-4.7) dauert ca. 15 min. Dieser allgemeine Ansatz zur Visualisierung von Keimbahnchromosomen und der Gonade kann für zytologische Untersuchungen jedes Proteins verwendet werden, wenn ein Antikörper oder ein fluoreszierendes Tag-Reagenz vorhanden ist. In seiner einfachsten Form kann die DAPI-Färbung von Diakinesekernen verwendet werden, um nach Faktoren zu suchen, die die meiotische Rekombination beeinflussen. In Kombination mit organismischen Analysen der Nachkommenzahl, der Inzidenz von Männchen (He-Phänotyp) und der embryonalen Letalität bietet dieser zytologische Ansatz einen einzelligen Kontrapunkt zu populationsbasierten Analysen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Alexa Fluor 488 Esel Anti-Kaninchen IgG Sekundäre	Antikörper-Molekularsonden	711-545-152
Aluminium-Heiz- / Kühlblock	Millipore Sigma	Z743497
Bacto Pepton	Gibco	DF0118 17/0
Borosilikatglas Pasteur-Pipetten, Einweg, 5,75 Zoll	Fisherbrand	13 678 20B	Wird zur Herstellung von Wurmpickeln
BSA verwendet, Rinderserumalbumin	VWR	97061 420
C. elegans Wildtyp (Vorfahren)	Caenorhabditis Genetics	Center N2 (ancestral)
C. elegans kle-2 (ok1151) mutants	Caenorhabditis Genetics Center	VC768	Der vollständige Genotyp dieses Stammes ist: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III). Es hat kle-2 ausgeglichen mit einem Balancer-Chromosom, das mit pharangealem GFP markiert ist. Wählen Sie nicht-grüne Tiere aus, um homozygote kle-2-Mutanten zu identifizieren.
C. elegans spo-11 (me44) mutants	Caenorhabditis Genetics	Center TY4342	Der vollständige Genotyp dieser Stämme lautet: spo-11(me44)  IV / nT1[qIs51] (IV:V). Es hat spo-11 balanciert mit einem Balancer-Chromosom, das mit pharangealem GFP markiert ist. Wählen Sie nicht-grüne Tiere aus, um homozygote spo-11Mutanten zu identifizieren.
Wasserfreies Calciumchlorid	VWR	97062 590
Cholesterin	Sigma Aldrich	501848300
DAPI	Life Technologies	D1306
EDTA, Dinatriumdihydrat Salz	Apex Bioresearch Products	20 147
Embryoschale, Glas, 30 mm Hohlraum	Elektronenmikroskopie Dienstleistungen	100492-980	Wird verwendet, um das Präparieren zu üben; Glas wird bevorzugt, da sezierte Tiere an Kunststoff haften bleiben können
Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
Vorratsbehälter für Lebensmittel, Kunststoff	verschiedene	n/a	Kunststoffbehälter mit (1) relativ flachen Böden, damit die Objektträger waagerecht ruhen können; (2) Deckel, die luftdicht sind, aber dennoch leicht entfernt werden können, ohne den Inhalt des Behälters zu stören, und (3) etwa 9 Zoll lang und 6 Zoll breit sind, werden bevorzugt
Glas Coplin Jar	DWK Life Sciences  Wheaton	08-813E Hydrophobe
Barriere PAP Pen	ImmEdge	NC9545623
Kimwipes	Kimtech Science	06 666A
Levamisolhydrochlorid	Sigma Aldrich	L0380000
Magnesiumsulfat wasserfrei	Fisher Chemical	M65 500
Nadeln, Einmalgebrauch, 25 g	BD PrecisionGlide	14 821 13D	blau, 1 Zoll
NGM-Agar, granuliert	Apex Bioresearch Products	20 249NGM
Parafilm	Bemis	16 101
Paraformaldehyd (16 % w/v) Wässrige Lösung	Elektronenmikroskopie Sciences	50 980 487
PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x Lösung)	Fisher BioReagents	BP399500
Petrischale, 60 mm	Tritech Research	NC9321999	Nicht belüfteter, scharfkantiger
Platindraht (90 % Platin, 10 % Iridium)	Tritech Research	PT 9010	Wird zur Herstellung von Wurmpickeln
verwendet Kaliumchlorid	Fisher	BP366-500
Kaliumphosphat Dibasisch	VWR BDH Chemikalien	BDH9266 500 G
Kaliumphosphat Monobasisch	VWR BDH Chemikalien	BDH9268 500 G
Premium Abdeckbrille 18 mm x 18 mm	Fisherbrand	12-548-AP	0.13 0,17 mm dicke
Rasierklingen, einschneidig	VWR	55411 055
SlowFade Gold Eindeckmittel Eindeckmittel		S36937	Alternativen: VectaShield Antifade Eindeckmedium (Vector Laboratories, H-1000-10) oder ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). Bei der Verwendung von ProLong Diamond ist kein Nagellack zum Versiegeln erforderlich, aber die Objektträger müssen 24 Stunden lang aushärten, bevor sie abgebildet werden.
Natriumazid	Fisher BioReagents	BP922I 500
Natriumchlorid	Fisher Chemical	S271 500
Natriumphosphat Dibasisches	Wasserfreies Sigma Aldrich	7558 79 4
Natriumphosphat Dibasisches Heptahydrat	Sigma Aldrich	S9390
Styroporbox	diverse	n/a	Ungefähre Abmessungen des Innenraums: 12 Zoll lang, 9 Zoll breit, 8 Zoll tief
Superfrost Plus Objektträger	Fisherbrand	22 037 246
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151 500
Trypton	Apex Bioresearch Products	20 251
Tween 20	Fisher Chemical	BP337 500
Hefeextrakt	Apex Produkte für die Bioforschung	20 254