Methodenartikel

En Gesicht Endokardkissenpräparation für die planare Morphogeneseanalyse in Mausembryonen

DOI:

10.3791/64207

⸱

27. Juli 2022

 ,  , 
1Intercellular Signalling in Cardiovascular Development and Disease Laboratory, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Ciber de Enfermedades Cardiovasculares

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Klassischerweise wurde das Endokard des embryonalen Klappenprimordiums der Maus anhand transversaler, koronaler oder sagittaler Schnitte analysiert. Unser neuartiger Ansatz für die enface, zweidimensionale Bildgebung des Endokards in valvulogenen Regionen ermöglicht eine planare Polaritäts- und Zellumlagerungsanalyse des Endokards während der Klappenentwicklung.

Zusammenfassung

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Die Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen, die der Entwicklung des Säugetierherzens zugrunde liegen, ist unerlässlich, um angeborene Herzfehler beim Menschen zu behandeln. Die Entwicklung der primitiven Herzklappen beinhaltet den epithelialen zu mesenchymalen Übergang (EMT) von Endokardzellen aus den Regionen des atrioventrikulären Kanals (AVC) und des Ausflusstrakts (OFT) des Herzens als Reaktion auf lokale induktive myokardiale und endokardiale Signale. Sobald die Zellen delaminieren und in die extrazelluläre Matrix (Herzgelee) eindringen, die sich zwischen dem Endokard und dem Myokard befindet, bilden sich die primitiven endokardialen Kissen (EC). Dieser Prozess impliziert, dass das Endokard die Lücken füllen muss, die von den delaminierten Zellen hinterlassen werden, und sich neu organisieren muss, um entlang einer Achse zu konvergieren (zu verengen) oder sich zu verlängern (zu verlängern). Aktuelle Forschungen haben den planaren Zellpolaritätsweg (PCP) mit der Regulierung der subzellulären Lokalisation der an diesem Prozess beteiligten Faktoren in Verbindung gebracht. Klassischerweise wurden die Anfangsphasen der Herzklappenentwicklung in Querschnitten embryonaler Herzen oder in ex vivo AVC- oder OFT-Explantaten untersucht, die auf Kollagengelen kultiviert wurden. Diese Ansätze erlauben die Analyse der apiko-basalen Polarität, nicht jedoch die Analyse des Zellverhaltens innerhalb der Epithelebene oder der morphologischen Veränderungen wandernder Zellen. Hier zeigen wir einen experimentellen Ansatz, der die Visualisierung des Endokards in valvulogenen Regionen als planares Zellfeld ermöglicht. Dieser experimentelle Ansatz bietet die Möglichkeit, PCP, planare Topologie und interzelluläre Kommunikation innerhalb des Endokards von OFT und AVC während der Klappenentwicklung zu untersuchen. Die Entschlüsselung neuer zellulärer Mechanismen, die an der Morphogenese der Herzklappe beteiligt sind, kann zum Verständnis angeborener Herzfehler beitragen, die mit endokardialen Kissendefekten einhergehen.

Einleitung

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Das Herz ist das erste funktionsfähige Organ eines Säugetierembryos. Um den embryonalen Tag (E) 7,5 bei Mäusen bilden bilaterale präkardiale Mesodermzellen die Herzsichel in der ventralen Seite1. Die Herzsichel enthält zwei Populationen von Präkardialzellen, die Vorläufer des Myokards und des Endokardsenthalten 2. Um E8.0 verschmelzen die Herzvorläufer in der Mittellinie und bilden die primitive Herzröhre, die aus zwei Epithelgeweben, dem äußeren Myokard und dem inneren Endokard besteht, das ein spezialisiertes Endothel ist, das durch eine extrazelluläre Matrix namens Herzgelee getrennt ist. Später, bei E8,5, erfährt der Herzschlauch eine Rechtsschleife. Das geschlungene Herz hat verschiedene anatomische Regionen mit spezifischen molekularen Signaturen wie den Ausflusstrakt (OFT), die Ventrikel und den atriventrikulären Kanal (AVC)3. Obwohl sich der Herzschlauch zunächst an seiner Zuflussseite durch die Hinzufügung von Zellen4 ausdehnt, führt die intensive Herzproliferation bei E9,5 zu einer Ballonbildung der Kammern und zur Etablierung des trabekulären Netzwerks5. Die Klappenbildung findet in der AVC (zukünftige Mitral- und Trikuspidalklappen) und in der OFT (zukünftige Aorten- und Pulmonalklappen) statt.

Das Endokard spielt eine entscheidende Rolle bei der Klappenentwicklung. Endokardzellen durchlaufen einen epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) im AVC und OFT, um die endokardialen Kissen zu bilden, eine Struktur, die zu Beginn der Klappenentwicklung auftritt. Verschiedene Signalwege aktivieren diesen Prozess; bei E9,5 bei Mäusen fördert NOTCH, das im Endokard als Reaktion auf myokardial abgeleitetes BMP2 aktiviert wird, die invasive EMT von Endokardzellen in den AVC- und OFT-Regionen durch Aktivierung von TGFβ2 und SNAIL (SNAI1), die die Expression von vaskulärem endothelialem Cadherin (VE-Cadherin), einer Transmembrankomponente von Adherens Junctions (AJs), direkt unterdrückt6,7,8 . Im OFT wird die Aktivierung des Endokards zur Initiierung von EMT durch FGF8 und BMP4 vermittelt, deren Expression durch NOTCH 9,10,11,12 aktiviert wird.

Das Fortschreiten von EMT beinhaltet die zelluläre Dynamik, wenn Zellen ihre Form ändern, Verbindungen mit ihren Nachbarn brechen und neu bilden, delaminieren und beginnen zu wandern13. Diese Veränderungen umfassen AJ-Remodellierung und allmähliche Demontage 14,15, planare Zellpolarität (PCP) -Signalisierung, den Verlust der apiko-basalen Polarität (ABP), apikale Konstriktion und zytoskelettale Organisation 16,17. ABP bezieht sich auf die Verteilung von Proteinen entlang der vorder-hinteren Achse einer Zelle. Im sich entwickelnden Herzen ist eine ABP-Regulation in Kardiomyozyten für die ventrikuläre Entwicklung erforderlich18. PCP bezieht sich auf eine polarisierte Verteilung von Proteinen innerhalb von Zellen über die Ebene eines Gewebes und reguliert die zelluläre Verteilung; Epithelien mit einer stabilen Geometrie bestehen aus sechseckigen Zellen, in denen nur drei Zellen an den Eckpunkten 19,20,21,22 zusammenlaufen. Verschiedene zelluläre Prozesse, wie Zellteilung, Nachbaraustausch oder Delaminierung, die während der epithelialen Morphogenese auftreten, führen zu einer Zunahme der Anzahl der Zellen, die auf einem Scheitelpunkt konvergieren, und der Anzahl der benachbarten Zellen, die eine bestimmte Zelle hat22. Diese zellulären Verhaltensweisen im Zusammenhang mit PCP können durch verschiedene Signalwege, Aktindynamik oder intrazellulären Transport reguliert werden23.

Die Daten, die zur Untersuchung der Klappenentwicklung bei Mäusen generiert wurden, stammen aus transversalen, koronalen oder sagittalen Abschnitten von E8,5- und E9,5-embryonalen Herzen, wobei das Endokard als Zelllinie und nicht als Zellfeld dargestellt wird - das Endokard bedeckt die gesamte innere Oberfläche der Herzröhre24. Embryonale Schnitte erlauben keine Analyse von PCP im Endokard von Mausembryonen. Unsere neuartige experimentelle Methode ermöglicht die Analyse der endokardialen Zellverteilung, der AJ-Anisotropie und der Einzelzellformanalyse, wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt. Diese Art von Daten ist für die PCP-Analyse erforderlich, zusammen mit der Beschreibung anderer Moleküle, die mit PCP verwandt sind und in diesem Bericht nicht aufgeführt sind. Die vollständige Immunfluoreszenz, die spezifische Probenvorbereitung und der Einsatz gentechnisch veränderter Mäuse ermöglichen eine planare Polaritätsanalyse im Endokard zu Beginn der Klappenentwicklung bei Mäusen.

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Protokoll

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Die Tierversuche wurden von der Ethikkommission für Tierversuche des Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) und von der Autonomen Gemeinschaft Madrid genehmigt (siehe PROEX 155.7/20). Alle Tierverfahren entsprechen der EU-Richtlinie 2010/63EU und der Empfehlung 2007/526/EG zum Schutz von Tieren, die für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, die im spanischen Recht unter dem Real Decreto 1201/2005 erlassen wurden.

1. Obtention von AVC und/oder OFTs (adaptiert von Xiao et al. 25)

  1. Stellen Sie am Nachmittag Kreuzungen zwischen weiblichen mTmG und männlichen VE-Cadherin-Cre-ERT/+ auf.
  2. Am nächsten Morgen suchen Sie nach einem Vaginalpfropfen. Wenn es einen Vaginalpfropfen gibt, zählen Sie ihn als einen halben Tag (E0,5). Zählen Sie je nach interessantem Experiment 8 Tage oder 9 Tage.
  3. 24 h vor der Dissektion die schwangere Frau oral mit 50 μL 5 mg/ml 4-OH-Tamoxifen in Maisöl verdünnt.
    HINWEIS: Diese Dosis induziert eine begrenzte Menge an CRE-vermittelter Rekombination, die durch das Vorhandensein von GFP-positiven Klonen nachgewiesen wird. Die geeignete Dosis muss mit jeder neuen Charge von 4-OH-Tamoxifen bestimmt werden.
  4. Opfern Sie die schwangere Frau bei E8,5 oder E9,5 durch zervikale Dislokation.
  5. Öffnen Sie den Bauch der trächtigen Mäuse mit einer Schere und entfernen Sie die Gebärmutter mit den Embryonen mit einer Schere und einer feinen Pinzette.
  6. Legen Sie die Gebärmutter in eine Petrischale, die eiskalte 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,1% Tween-20 (PBT) enthält.
  7. Entfernen Sie die einzelnen Deciduae aus der Gebärmutter unter einem Seziermikroskop und mit einer feinen Pinzette.
  8. Machen Sie mit einer feinen Pinzette einen Schnitt in den weißen Teil der Decidua, in dem sich der Embryo befindet, entfernen Sie ihn vorsichtig, vermeiden Sie das Ziehen, und übertragen Sie die Embryonen in eine neue Petrischale mit frischem PBT mit einem P1000 mit abgeschnittener Spitze, so dass ein Durchmesser groß genug ist, damit ein Embryo passieren kann, ohne zu brechen.
  9. Für die Genotypisierung nehmen Sie ein kleines Stück des Dottersacks (0,5 mm2) oder ein Stück des Schwanzes (vom hinteren Ende, 5 bis 10 Somiten in Richtung Kopf) und verdauen es in 100 μL geeignetem Puffer.
  10. Unter dem Abzug werden die Embryonen in eiskaltes 4% Paraformaldehyd (4% PFA) in sterilfiltriertem PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen (2 ml) bei 4 °C überführt. Die Embryonen werden von 2 h bis Nacht (O/N) bei 4 °C auf einem Nutator fixiert.
  11. Entfernen Sie unter dem Abzug das 4% PFA-Fixiermittel aus den Mikrozentrifugenröhrchen, ohne die Embryonen zu berühren. Entsorgen Sie die PFA in einem geeigneten Behälter.
  12. Waschen Sie die Embryonen 5x in kaltem PBT für jeweils 10 min bei Raumtemperatur (RT).
  13. Entfernen Sie das Herz mit einer feinen Pinzette und übertragen Sie es in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit frischem PBT.

2. Immunfluoreszenz des embryonalen Herzens der Maus

  1. Ersetzen Sie PBT durch PBSTr (0,4% Triton X-100 in PBS) und waschen Sie die Proben jeweils 3x, 5 min, bei RT auf einem Orbitalschüttler.
  2. Ersetzen Sie PBSTr durch eine Blocklösung (PBSTr mit 10% hitzeinaktiviertem Rinderserum). Inkubieren von 2 h bis O/N bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler.
  3. Ersetzen Sie die Blockierlösung durch eine Blocklösung, die einen primären Antikörper in der gewünschten Konzentration enthält (für Anti-GFP- oder Anti-VE-Cadherin-Antikörper verwenden Sie eine Verdünnung von 1:1000). O/N auf einem Orbitalschüttler bei 4 °C inkubieren.
  4. Nach O/N-Inkubation bei 4 °C 1,5 h bei RT auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Dieser Schritt ist sehr wichtig, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen.
  5. Entfernen und lagern Sie die primäre Antikörperlösung bei 4 °C für bis zu drei zukünftige Experimente (Natriumazid zu einer Endkonzentration von 0,02% für beste Konservierung).
  6. Waschen Sie die Embryonen 3x mit PBSTr für jeweils 3 Minuten.
  7. Die Embryonen mit PBSTr 3x jeweils 30 min auf einem Orbitalschüttler bei 4 °C waschen.
  8. Nach dem letzten Waschgang 1 ml Blockierlösung mit 1:1000 fluoreszenzkonjugierten sekundären Antikörpern gegen die primäre Antikörperwirtsspezies hinzufügen. Der Lösung werden auch 1:3000 DAPI hinzugefügt und die Embryonen O/N auf einem Orbitalschüttler bei 4 °C inkubiert.
  9. Nach O/N-Inkubation bei 4 °C 1,5 h bei RT auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Dieser Schritt ist sehr wichtig, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen.
  10. Waschen Sie die Embryonen 3x mit PBSTr für jeweils 3 Minuten.
  11. Waschen Sie die Embryonen mit PBSTr 3x-5x für jeweils 30 min auf einem Orbitalshaker bei RT.

3. Montage der embryonalen AVC oder OFTs der Maus

  1. Legen Sie die Herzen auf eine Petrischale (35 mm), die PBS enthält.
  2. Isolieren Sie den AVC oder den OFT mit einem Wolframdraht und einer feinen Pinzette und schneiden Sie sie längs26.
  3. Bereiten Sie Deckgläser (22 mm x 22 mm), Objektträger (60 mm x 24 mm), Pinzetten, eine P200-Pipette mit den entsprechenden Spitzen, ein Papiertuch und alle wässrigen Montagemedien auf Glycerinbasis für die Fluoreszenz ohne DAPI vor.
  4. Mit einem ähnlichen Ansatz wie in Xiao, C. et al.25, kleben Sie zwei Streifen Klebeband auf einen Objektträger, getrennt durch 0,3-0,6 cm, um einen 3D-Raumraum zu schaffen, der es den Proben ermöglicht, ihre ursprüngliche Form zu erhalten, ohne sie zu zerquetschen.
  5. Lassen Sie die Proben vorsichtig und mit dem minimalen Puffervolumen mit einer geschnittenen P200-Pipette auf den Objektträger zwischen den Bandstreifen fallen. Verwenden Sie ein Seziermikroskop, um die Genauigkeit zu erhöhen.
  6. Legen Sie die Proben mit einer feinen Pinzette mit dem Endokard nach oben (Myokard nach unten auf dem Objektträger).
  7. Entfernen Sie überschüssiges PBS mit einem Papiertuch (vermeiden Sie es, die Probe zu berühren), und trocknen Sie dann die Proben für 1-2 Minuten bei RT, damit die Proben am Objektträger haften.
  8. Fügen Sie 40 μL wässrige Montagemedien auf das Gewebe auf.
  9. Legen Sie das Deckglas über die beiden Klebebandstücke und senken Sie es langsam mit einer Nadel oder Pinzette auf das Gewebe. Vermeiden Sie es, Luftblasen zu erzeugen.
  10. Versiegeln Sie das Deckglas mit einem Tropfen Nagellack auf jedem Scheitelpunkt des Deckglases.
  11. Sobald der Nagellack trocken ist, reinigen Sie die überschüssigen Montagemedien von den Seiten des Deckglases mit einem saugfähigen Papiertuch. Vermeiden Sie es, das Deckglas zu bewegen.
  12. Fügen Sie Nagellack entlang der Deckglaskanten hinzu, um sie vollständig abzudichten und die Verdunstung der Montagemedien zu verhindern.
  13. Nehmen Sie mit einem aufrechten oder einem inversen konfokalen Mikroskop Bilder mit 10x für die Gesamtansicht und mit 63x mit 3x Zoom für detaillierte Bilder auf.

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Ergebnisse

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Die mit diesem Protokoll generierten Daten zeigen, dass es möglich ist, eine Gesichtsbildgebung des Endokards des AVC durchzuführen. Das erste Ziel war es, die Zellform des Endokards während der Bildung der Klappen mit zellulärer Auflösung zu analysieren (Abbildung 1). Um einzelne Endokardzellen bei E9.5 hervorzuheben, verwendeten wir zwei transgene Mausstämme. (1) ROSAmT/mG ist ein zweifarbiges fluoreszierendes Cre-Reporter-Allel (tdTomato/mT und EG...

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Diskussion

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Das Endokard ist eine epitheliale Monoschicht, die die gesamte innere Oberfläche des embryonalen Herzschlauchs bedeckt. Während der Klappenentwicklung werden endokardiale Zellen in den prospektiven Klappenregionen EMT unterzogen, so dass endokardiale Zellen ihr Zytoskelett transformieren und neu anordnen, um vom Endokard in Richtung Herzgelee zu delaminatieren. Wir und andere haben relevante Daten über die Klappenentwicklung in Mausembryonen erhalten, indem wir transversale Abschnitte von E8.5 und E9.5 embryonalen Herzen...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Studie wurde durch die Zuschüsse PID2019-104776RB-I00 und CB16/11/00399 (CIBER CV) von MCIN/AEI/10.13039/501100011033 an J. L. P. J.G.-B. unterstützt. wurde vom Programa de Atracción de Talento der Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729) finanziert. T.G.-C. wurde gefördert von Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Wir danken der CNIC Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, ICTS-ReDib, kofinanziert von MCIN/AEI /10.13039/501100011033 und FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Wir danken auch A. Galicia und L. Méndez für die Mäusehaltung. Die Kosten für diese Veröffentlichung wurden teilweise aus Mitteln des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung getragen. Das CNIC wird vom ISCIII, dem MCIN und der Pro CNIC Foundation unterstützt und ist ein Severo Ochoa Center of Excellence (Stipendium CEX2020-001041-S), finanziert von MCIN/AEI /10.13039/501100011033.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4-OH-TamoxifenSigma AldrichH-6278
16 % ParaformaldheydElektronenmikroskopie Sciences157-10Verdünnung auf 4 % in Wasser
Anti-GFPAves LabsFGP-1010
Anti-VECadherinBD Biosciences555289
Ziege Anti-Huhn, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11039
Ziege Anti-Maus Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch115-605-174
DAPIAppliChemA4099,0005
Folien Superfrost PLUSVWR631-010825 mm x 75 mm x 1,0 mm
Triton X-100Sigma AldrichX100-100ML
Tween 20A4974,0500AppliChem
Vectashield Montage MediumVector LaboratorienH-1000-10

Referenzen

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Herzklappenentwicklungplanare Zellpolarit tepithelial mesenchymale TransitionKonfokalmikroskopieAtrioventrikularkanalVE Cadherin F rbungembryonales Herz

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