Methodenartikel

Eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform basierend auf äußeren Membranvesikeln mit SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne

DOI:

10.3791/64213

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25. Juli 2022

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1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das vorliegende Protokoll beschreibt das Bioengineering von äußeren Membranvesikeln als "Plug-and-Display"-Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.

Zusammenfassung

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Biomimetische Nanopartikel, die aus Bakterien oder Viren gewonnen werden, haben großes Interesse an der Impfstoffforschung und -entwicklung geweckt. Äußere Membranvesikel (OMVs) werden hauptsächlich von gramnegativen Bakterien während des durchschnittlichen Wachstums mit einem Durchmesser in Nanogröße und selbstadjuvanter Aktivität sezerniert, was ideal für die Impfstoffabgabe sein kann. OMVs haben als facettenreiches Liefersystem für Proteine, Nukleinsäuren und kleine Moleküle funktioniert. Um die biologischen Eigenschaften von OMVs voll auszuschöpfen, wurden biotechnologisch hergestellte Escherichia coli-abgeleitete OMVs als Träger und SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne (RBD) als Antigen verwendet, um eine "Plug-and-Display"-Impfstoffplattform zu konstruieren. Die Domänen SpyCatcher (SC) und SpyTag (ST) in Streptococcus pyogenes wurden angewendet, um OMVs und RBD zu konjugieren. Das Cytolysin A (ClyA)-Gen wurde nach Plasmidtransfektion mit dem SC-Gen als Fusionsprotein übersetzt, wobei eine reaktive Stelle auf der Oberfläche der OMVs zurückblieb. Nach dem Mischen von RBD-ST in einem konventionellen Puffersystem über Nacht wurde eine kovalente Bindung zwischen den OMVs und RBD gebildet. Somit wurde ein multivalent anzeigender OMV Impfstoff erreicht. Durch den Ersatz durch verschiedene Antigene kann die OMVs Impfstoffplattform eine Vielzahl heterogener Antigene effizient darstellen und so Epidemien von Infektionskrankheiten schnell verhindern. Dieses Protokoll beschreibt eine präzise Methode zum Aufbau der OMV Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.

Einleitung

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Als potenzielle Impfstoffplattform haben äußere Membranvesikel (OMVs) in den letzten Jahren immer mehr Aufmerksamkeit erregt 1,2. OMVs, die hauptsächlich auf natürliche Weise von gramnegativen Bakterien3 sezerniert werden, sind kugelförmige nanoskalige Partikel, die aus einer Lipiddoppelschicht bestehen, normalerweise in der Größe von 20-300nm4. OMVs enthalten verschiedene bakterielle Ausgangskomponenten, einschließlich bakterieller Antigene und pathogenassoziierter molekularer Muster (PAMPs), die als feste Immunpotentiatoren dienen5. OMVs....

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Protokoll

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1. Plasmidaufbau

  1. Fügen Sie DNA, die die SpyCatcher-Sequenz (Supplementary File 1) kodiert, in ein Ampicillin-resistentes pThioHisA-ClyA-Plasmid (siehe Materialtabelle) zwischen den Stellen BamH I und Sal I ein, um das Plasmid pThioHisA ClyA-SC nach einem zuvor veröffentlichten Bericht zu konstruieren20.
  2. Ligate das synthetisierte SpyTag-RBD-Histag-Fusionsgen (Supplementary File 1) in ein pcDNA3.1-Plasmid (siehe Materialtabelle) zwischen den Standorten BamH I und EcoR I, um das Plasmid pcDNA3.1 RBD-ST nach einem zuvor veröffentlichten....

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Ergebnisse

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Das Flussdiagramm für dieses Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll könnte ein allgemeiner Ansatz zur Nutzung von OMVs als Impfstoffplattform sein. Man muss nur die geeigneten Expressionssysteme basierend auf der Art der Antigene auswählen.

Abbildung 2 zeigt ein realisierbares Plasmid-Design-Schema. Das SC-Gen ist über einen flexiblen Linker mit dem ClyA-Gen verbunden, während ST mit dem 5'-Terminal des RBD-Gens mi.......

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Diskussion

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Um eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform zu schaffen, wurde SC-fusioniertes ClyA in BL21(DE3)-Stämmen exprimiert, die aufgrund ihrer Vorteile bei der Proteinexpression24 eines der am weitesten verbreiteten Modelle für die rekombinante Proteinproduktion sind, so dass während des Prozesses der Bakterienproliferation genügend SC-Fragmente auf der Oberfläche der OMVs angezeigt werden. Gleichzeitig wurde ein ST-fusioniertes Zielantigen für die chemische Kopplung zwischen den Antigenen.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde vom Key Program der Chongqing Natural Science Foundation (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) und das Chinese National Natural Science Foundation Project (Nr. 31670936, 82041045).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ampicillin-Natrium-SangonBiotechA610028
Automatisierter ZellzählerCountstarBioTech
BCA-Protein-Quantifizierungskitcwbiocw0014s
ChemiDoc Touching Imaging SystemBio-rad
Danamic Light ScatteringMalvernZetasizer Nano S90
ElektrophoresegerätCavoyPower BV
EZ-Puffer H 10X TBST PufferSangon BiotechC520009
Ziege pAb zur Maus IgG1Abcamab97240
Hochgeschwindigkeits-GefrierzentrifugeBioridgeH2500R
His-Tag Maus mAbZellsignaltechnologie2366s
ImidazolSangon Biotech
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranosidSangon BiotechA600118
Ni-NTA His-Bind SuperflowQiagen70691
Fettfreies MilchpulverSangon BiotechA600669
OPM-293 ZellkulturmediumOpm biosciences81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST PlasmidWuhan genecreat Biologische Technologie
Phosphatpuffer KochsalzlösungZSGB-bioZLI-9061
Polyethylenimin LinearPolysciences23966-1
Vorgefärbte ProteinleiterThermo26616
pThioHisA ClyA-SC PlasmidWuhan genecreat biologische Technologie
PVDF Western Blotting MembranenRoche
Quixstand Tischsysteme (100 kD Hohlfasersäule)GE Healthcare
SDS-PAGE Ladepuffer (5x)BeyotimeP0015
NatriumchloridSangon BiotechA100241
Supersignal west pico PLUS (verbesserte Chemilumineszenzlösung)Thermo34577
SuspensionsinstrumentLife TechnologyHula-Mischer
TransmissionselektronenmikroskopHitachiHT7800
Trypton-Oxoid-LP0042B
UltrazentrifugeBeckman-ScharXPN-100
Ultraviolett-SpektralphotometerHitachiU-3900
HefeextraktSangon BiotechA610961
A60027703010040001

Referenzen

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  1. Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
  2. Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. ....

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Schlagwörter

Outer Membrane VesiclesNanoparticle VaccineSARS CoV 2 RBDPlug And Display PlatformOMV BioconjugationSpyCatcher SpyTagProtein PurificationUltracentrifugationTransmission Electron MicroscopyDynamic Light Scattering

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