Beurteilung der intestinalen Transzytose von neonatalen Escherichia coli Bacteremia-Isolaten

Zusammenfassung

Escherichia coli verursacht Sepsis bei Neugeborenen, die die Bakterien um den Zeitpunkt der Geburt aufnehmen. Der Prozess, der an der Fähigkeit von E. coli beteiligt ist, vom Darmtrakt in den Blutkreislauf zu gelangen, ist kaum verstanden. Dieses In-vitro-Modell bewertet die Fähigkeit von E. coli-Stämmen, durch die Darmepithelzellen zu wandern.

Zusammenfassung

Neugeborene nehmen mütterliche E. coli-Stämme auf, die ihren Darmtrakt um den Zeitpunkt der Geburt besiedeln. E. coli-Stämme mit der Fähigkeit, über den Darm zu translozieren, dringen in den Blutkreislauf des Neugeborenen ein und verursachen lebensbedrohliche Bakteriämie. Die hier vorgestellte Methodik verwendet polarisierte intestinale Epithelzellen, die auf semipermeablen Einsätzen gezüchtet wurden, um die Transzytose von neonatalen E. coli-Bakteriämie-Isolaten in vitro zu beurteilen. Diese Methode nutzt die etablierte T84-Darmzelllinie, die die Fähigkeit hat, zu Konfluenz zu wachsen und enge Verbindungen und Desmosomen zu bilden. Nach Erreichen der Konfluenz entwickeln reife T84-Monoschichten einen transepithelialen Widerstand (TEER), der mit einem Voltmeter quantifiziert werden kann. Die TEER-Werte korrelieren umgekehrt mit der parazellulären Permeabilität extrazellulärer Komponenten, einschließlich Bakterien, über die intestinale Monoschicht. Die transzelluläre Passage von Bakterien (Transzytose) hingegen verändert die TEER-Messungen nicht notwendigerweise. In diesem Modell wird die bakterielle Passage durch die intestinale Monoschicht bis zu 6 h nach der Infektion quantifiziert, und wiederholte Messungen von TEER werden durchgeführt, um die parazelluläre Permeabilität zu überwachen. Darüber hinaus erleichtert diese Methode den Einsatz von Techniken wie der Immunfärbung, um die strukturellen Veränderungen in Tight Junctions und anderen Zell-zu-Zell-Adhäsionsproteinen während der bakteriellen Transzytose über das polarisierte Epithel zu untersuchen. Die Verwendung dieses Modells trägt zur Charakterisierung der Mechanismen bei, durch die neonatale E. coli durch das Darmepithel transzytieren, um Bakteriämie zu erzeugen.

Einleitung

Escherichia coli ist die häufigste Ursache für eine früh einsetzende Sepsis bei Neugeborenen ^1,2,3. Die Sterblichkeitsrate der neonatalen E. coli-Bakteriämie kann 40% erreichen, und Meningitis ist eine mögliche Komplikation, die mit schweren neurologischen Entwicklungsstörungen einhergeht². Die Aufnahme von mütterlichen E. coli-Stämmen durch das Neugeborene kann zu neonataler Bakteriämie führen; Dieser Prozess wurde in Tiermodellen^{repliziert 2,4}. Einmal eingenommen, w....

Protokoll

HINWEIS: Führen Sie alle Manipulationen der T84-Zellen, Bakterien, Platten und Reagenzien in einer Sicherheitswerkbank der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durch, um eine Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie separate Bereiche und Inkubatoren für alle Arbeiten mit sterilen T84-Zellen, infizierten T84-Zellen und E. coli. Die klinischen E. coli-Isolate, die mit den hier beschriebenen Methoden getestet wurden, wurden nach den Richtlinien des Institutional Review Board an unserer Institution ^1,16 gewonnen.

1. Herstellung von Transzytose-Inserts mit T84-Zellen (c....

Ergebnisse

Abbildung 1: T84 TEER im Zeitverlauf. Wenn die T84-Zellschicht auf dem Einsatz reift, steigt der elektrische Widerstand der Monoschicht. Bei einem TEER von mindestens 1.000 Ω·^cm2 ist die Zellschicht ausreichend entwickelt, um den parazellulären Bakterientransport zu verringern und die Messung des primär transzellulären Bakterientransits z.......

Diskussion

Diese Methode leitet sich von Techniken ab, die in der Gastroenterologie und bei Infektionskrankheiten^{verwendet werden 20}. In-vitro-Modelle der intestinalen Epithelbarriere wurden verwendet, um die Mechanismen aufzuklären, durch die die luminalen Gehalte mit dieser relevanten Komponente der angeborenen Immunität interagieren ^6,8. Die Wirt-Pathogen-Interaktionen von invasiven neonatalen E. coli wurden auch separat durch ge.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10.000 U/ml Penicillin/Streptomycin-Gemisch	Fisher Scientific	15-140-122
15 mL sterile konische Röhrchen	MidSci	C15B
2 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Avant	AVSS2000
50 mL sterile konische Röhrchen aus Polypropylen	Falcon	352070
Aspirator	Corning	4930
Biosicherheitswerkbänke	Labconco	30441010028343	Drei davon werden in der Methode verwendet: eine für die Arbeit mit sterilem Gewebe, eine für die Arbeit mit infiziertem Gewebe und eine für die Arbeit mit Bakterien.
Zentrifuge	Sorvall	Legend RT
Einweg-Impfösen	Fisherbrand	22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-084
Epithel Volt/Ohm Meter	World Precision Instruments	EVOM2
Fötales Rinderserum	Fisher Scientific	10437028
Ham's F-12 Nährstoffmischung	Gibco	11765-047
Hämazytometer	Sigma Aldrich, Bright Line	Z359629
Inkubatorschüttler	New Brunswick	Innova 4080
Inkubatoren	Thermo Scientific	51030284	Drei davon werden in der Methode verwendet: einer für die sterile Gewebekultivierung, einer für die Kultivierung von infiziertem Gewebe und einer für die bakterielle Inkubation.
Lysogenie-Bouillon	Difco	244610
Lysogen-Bouillon-Agar	IBI Scientific	IB49101
Nikon Eclipse TS2R Mikroskop	Nikon
Spektralphotometer	Unico	1100RS
T84 Darmzellen	Amerikanische Gewebekultur-Sammlung	CCL248
Gewebekultureinsätze, mit Polyethylen-Trephthalat-Membran, 3 & Mikro; m Poren,  24-Well-Format	Falcon	353096
Gewebekulturplatte, 24 Wells	Falcon	353504
Trypanblau-Färbung	Fisher Scientific	T10282