Methodenartikel

ATAC-Seq Optimierung für die Krebsepigenetikforschung

DOI:

10.3791/64242

⸱

30. Juni 2022

 ,  ,  ,  , 
1University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, 2Dana-Farber Cancer Institute

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATAC-seq ist eine DNA-Sequenzierungsmethode, die die hyperaktive mutierte Transposase Tn5 verwendet, um Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit abzubilden, die durch Transkriptionsfaktoren vermittelt werden. ATAC-seq ermöglicht die Entdeckung der molekularen Mechanismen, die phänotypischen Veränderungen in Krebszellen zugrunde liegen. Dieses Protokoll beschreibt Optimierungsverfahren für ATAC-seq in Epithelzelltypen, einschließlich Krebszellen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatzsequenzierung (ATAC-seq) untersucht die Zugänglichkeit von Desoxyribonukleinsäure (DNA) unter Verwendung der hyperaktiven Tn5-Transposase. Tn5 schneidet und ligiert Adapter für Hochdurchsatzsequenzierung innerhalb zugänglicher Chromatinregionen. In eukaryotischen Zellen wird genomische DNA in Chromatin verpackt, einen Komplex aus DNA, Histone und anderen Proteinen, der als physikalische Barriere für die Transkriptionsmaschinerie wirkt. Als Reaktion auf extrinsische Signale rekrutieren Transkriptionsfaktoren Chromatin-Remodeling-Komplexe, um den Zugang zur Transkriptionsmaschinerie für die Genaktivierung zu ermöglichen. Daher ist die Identifizierung offener Chromatinregionen nützlich, wenn die Aktivitäten von Enhancern und Genpromotoren während biologischer Ereignisse wie dem Fortschreiten von Krebs überwacht werden. Da dieses Protokoll einfach zu bedienen ist und einen geringen Zelleingangsbedarf hat, wurde ATAC-seq weit verbreitet, um offene Chromatinregionen in verschiedenen Zelltypen, einschließlich Krebszellen, zu definieren. Für eine erfolgreiche Datenerfassung müssen bei der Vorbereitung von ATAC-seq-Bibliotheken mehrere Parameter berücksichtigt werden. Unter ihnen sind die Wahl des Zelllysepuffers, die Titration des Enzyms Tn5 und das Startvolumen der Zellen entscheidend für die Vorbereitung der ATAC-seq-Bibliothek in Krebszellen. Optimierung ist unerlässlich, um qualitativ hochwertige Daten zu generieren. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der ATAC-seq-Optimierungsmethoden für Epithelzelltypen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Zugänglichkeit von Chromatin ist eine Schlüsselvoraussetzung für die Regulation der Genexpression auf einer genomweiten Skala1. Veränderungen der Chromatinzugänglichkeit sind häufig mit mehreren Krankheitszuständen verbunden, einschließlich Krebs 2,3,4. Im Laufe der Jahre wurden zahlreiche Techniken entwickelt, die es Forschern ermöglichen, die Chromatinlandschaft zu untersuchen, indem sie Regionen mit Chromatinzugänglichkeit kartieren. Einige von ihnen umfassen DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyd-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, und der Schwerpunkt dieser Arbeit, ATAC-seq (Assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq kartiert zugängliche Regionen durch die Verwendung eines Schlüsselmerkmals von DNase, nämlich der bevorzugten Verdauung von nackter DNA, die frei von Histonen und anderen Proteinen wie Transkriptionsfaktoren5 ist. FAIRE-seq, ähnlich wie ChIP-seq, nutzt Formaldehydvernetzung und Beschallung, außer dass keine Immunpräzipitation beteiligt ist, und die nukleosomenfreien Regionen werden durch Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert6. Die MAPit-Methode verwendet eine GC-Methyltransferase, um die Chromatinstruktur bei Einzelmolekülauflösung7 zu untersuchen. ATAC-seq basiert auf der hyperaktiven Transposase Tn58. Die Tn5-Transposase bindet bevorzugt an offene Chromatinbereiche und fügt Sequenzierungsadapter in zugängliche Bereiche ein. Tn5 arbeitet durch einen DNA-vermittelten "Cut and Paste"-Mechanismus, wobei die mit Adaptern vorgeladene Transposase an offene Chromatinstellen bindet, DNA schneidet und die Adapter8 ligiert. Tn5-gebundene Regionen werden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern wiederhergestellt, die an diese Adapter angeglüht werden. FAIRE-seq und DNase-seq erfordern eine große Menge an Ausgangsmaterial (~100.000 Zellen bis 225.000 Zellen) und einen separaten Bibliotheksvorbereitungsschritt vor der Sequenzierung9. Auf der anderen Seite ist das ATAC-seq-Protokoll relativ einfach und erfordert eine kleine Anzahl von Zellen (<50.000 Zellen)10. Im Gegensatz zu den FAIRE-seq- und DNase-seq-Techniken ist die Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung von ATAC-seq relativ einfach, da die isolierte DNA-Probe bereits mit den Sequenzierungsadaptern von Tn5 markiert wird. Daher ist nur der PCR-Amplifikationsschritt mit geeigneten Primern erforderlich, um die Bibliotheksvorbereitung abzuschließen, und die vorherigen Verarbeitungsschritte wie Endreparatur und Adapterligatur müssen nicht durchgeführt werden, was Zeit spart11. Zweitens vermeidet ATAC-seq die Notwendigkeit einer Bisulfitumwandlung, Klonierung und Amplifikation mit regionsspezifischen Primern, die für MAPit7 erforderlich sind. Aufgrund dieser Vorteile ist ATAC-seq zu einer sehr beliebten Methode zur Definition offener Chromatinregionen geworden. Obwohl die ATAC-seq-Methode einfach ist, erfordern mehrere Schritte eine Optimierung, um qualitativ hochwertige und reproduzierbare Daten zu erhalten. Dieses Manuskript diskutiert Optimierungsverfahren für die Standard-ATAC-seq-Bibliotheksvorbereitung und hebt insbesondere drei Parameter hervor: (1) Lysepufferzusammensetzung, (2) Tn5-Transposase-Konzentration und (3) Zellzahl. Darüber hinaus liefert dieser Artikel Beispieldaten aus den Optimierungsbedingungen unter Verwendung von krebsartigen und nicht-kanzerösen adhärenten Epithelzellen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vorbereitungen vor Beginn des Experiments

  1. Lysepufferlager vorbereiten.
    HINWEIS: Der optimale nukleare Isolationspuffer kann für jeden Zelltyp unterschiedlich sein. Wir empfehlen, sowohl den im Originalpapier8 verwendeten hypotonischen Puffer als auch einen CSK-Puffer12,13 für jeden Zelltyp unter Verwendung von Trypanblau-Färbung zu testen.
    1. Zur Herstellung des hypotonischen Puffers (Greenleaf-Puffer) mischen Sie 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 und 0,1% NP-40.
    2. Zur Herstellung des CSK-Puffers mischen Sie 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM Saccharose, 3 mMMgCl2 und 0,1% Triton X-100.
  2. Stellen Sie sicher, dass die Zellkulturbedingungen optimal sind; Untersuchen Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass es keine erhöhten Apoptosewerte gibt.
  3. Schalten Sie die Zentrifuge ein, damit sie 4 °C erreicht.

2. Zellernte

  1. Absaugen von Medien aus einer Zellkultur bei <80% Konfluenz. Zellen werden typischerweise in einer 35 mm oder 60 mm Schale gezüchtet, basierend auf der Anzahl der benötigten Zellen, Behandlungen usw.
  2. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml oder 3 ml PBS.
  3. Fügen Sie 0,5 ml oder 1 ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie für 2-3 min (abhängig von den Zelltypen). Verwenden Sie vorsichtig eine 1-ml-Pipette, um gut zu mischen.
  4. Geben Sie 1 ml oder 2 ml Medien auf die Platte und mischen Sie gut. Transfer in ein 15 ml konisches Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen für 3 min bei 300 x g.
    HINWEIS: Ein schwingender Schaufelrotor wird empfohlen, um den Zellverlust zu minimieren.
  5. Saugen Sie das Medium ab und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml oder 2 ml Medium.
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine homogene Einzelzelllösung herzustellen. Für Gewebe kann ein Dounce-Homogenisator verwendet werden, um Gewebe zu homogenisieren und große Zellklumpen oder Aggregate zu minimieren. Einige Gewebe erfordern Filtration (z. B. Zellsiebe) und/oder FACS-Zellsortierung, um lebensfähige Zellen zu isolieren und eine Einzelzelllösung zu erhalten.
  6. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Zellzählers.
    HINWEIS: In dieser Studie wurde ein automatisierter Zellzähler (Table of Materials) verwendet.
  7. Zentrifugieren Sie das erforderliche Zellvolumen (z. B. ein Volumen mit 1 x 106 Zellen basierend auf der Zellzahl) bei 300 x g für 3 min bei Raumtemperatur (RT).
  8. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 x 106 Zellen in 1 ml kaltem PBS.
    HINWEIS: Wenn die Zellzahlen kleiner als 1 x 10 6 Zellen sind, verringern Sie das kalte PBS-Volumen, um die Zelllösung in der gleichen Konzentration (1 x 106 Zellen / ml) herzustellen.

3. Zelllyse

  1. 25 μL (= 2,5 x 104 Zellen) in ein neues 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführen. 5 min bei 500 x g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entsorgen
    HINWEIS: Ein schwingender Schaufelrotor wird empfohlen, um den Zellverlust zu minimieren. Lassen Sie etwa 3 μL Überstand, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht verworfen werden.
  2. Fügen Sie 25 μL Lysepuffer hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren auf und ab. 5 min auf Eis inkubieren
  3. 5 min bei 500 x g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig verwerfen.
    HINWEIS: Ein schwingender Schaufelrotor wird empfohlen, um den Zellverlust zu minimieren. Lassen Sie etwa 3 μL Überstand, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht verworfen werden.

4. Tn5-Tagmentation

  1. Das Pellet wird sofort in 25 μL Tn5-Reaktionsgemisch resuspendiert. Die Tn5-Reaktionsmischung ist wie folgt: 12,5 μL 2x Tagmentations-DNA-Puffer (TD-Puffer), 1,25-5 μL Tn5-Transposase und 11,25-7,5 μL nukleasefreies Wasser.
    HINWEIS: Die Standardkonzentration von Tn5 beträgt 2,5 μL für 2,5 x 104 Zellen.
  2. 30 min bei 37 °C inkubieren.
    HINWEIS: Mischen Sie die Lösung alle 10 Minuten.

5. DNA-Reinigung

HINWEIS: Vor der Verstärkung ist eine Reinigung erforderlich. Die DNA-Aufreinigung erfolgt mit dem MinElute PCR-Reinigungskit (Table of Materials).

  1. Fügen Sie 5 μL 3 M Natriumacetat (pH 5,2) hinzu.
  2. Sofort 125 μL Buffer PB hinzufügen und gut mischen.
  3. Befolgen Sie ab Schritt 2 das Protokoll des PCR-Aufreinigungskits .
    1. Legen Sie die Spin-Säule in ein 2-ml-Sammelröhrchen.
    2. Die Probe auf die Spinsäule auftragen und 1 min bei 17.900 x g RT zentrifugieren.
    3. Verwerfen Sie den Durchfluss, und setzen Sie die Schleudersäule wieder in dasselbe Sammelrohr ein.
    4. 750 μL Puffer-PE in die Spin-Säule geben und 1 min bei 17.900 x g RT zentrifugieren.
    5. Verwerfen Sie den Durchfluss, und setzen Sie die Schleudersäule wieder in dasselbe Sammelrohr ein.
    6. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule für 5 min, um die Membran vollständig zu trocknen.
    7. Verwerfen Sie den Durchfluss und legen Sie die Spin-Säule in ein neues 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    8. Eluieren Sie die DNA-Fragmente mit 10 μL Buffer EB.
    9. Lassen Sie die Säule 1 min bei RT stehen.
    10. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 17.900 x g RT, um die DNA zu eluieren.

6. PCR-Amplifikation

HINWEIS: Die PCR-Amplifikation transponierter (markierter) DNA ist für die Sequenzierung notwendig. In diesem Beispiel wurden Nextera-Kit-Adapter (Table of Materials) verwendet. Die in dieser Studie verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.

  1. Die folgende PCR-Reaktion in 200 μL PCR-Röhrchen (50 μL für jede Probe) einrichten. Die PCR-Reaktionsmischung ist wie folgt: 10 μL eluierte DNA (Schritt 5.), 2,5 μL 25 mM Adapter 1, 2,5 μL 25 mM Adapter 2, 25 μL 2x PCR-Mastermix und 10 μL nukleasefreies Wasser
  2. Führen Sie das PCR-Amplifikationsprogramm Teil 1 durch (Tabelle 2).
    HINWEIS: Für die anfängliche Amplifikation werden für alle Proben mit einem Standard-Thermocycler die gleichen Bedingungen verwendet.
  3. Real-time qPCR (insgesamt 14,5 μL pro Probe)
    1. Richten Sie unter Verwendung von 5 μL des Produkts aus der PCR-Amplifikation Teil 1 (Schritt 6.2) die folgende Reaktion ein, diesmal einschließlich SYBR-Gold und Nachweis in einer Echtzeit-PCR-Maschine.
    2. Das PCR-Reaktionsgemisch wird wie folgt hergestellt: 5 μL PCR-Produkt aus Schritt 6.2., 0,75 μL SYBR-Gold (1000x verdünnt), 5 μL 2x PCR-Mastermix und 3,75 μL nukleasefreies Wasser.
      HINWEIS: Die genauen Zykluszahlen für die Bibliotheksamplifikation vor Erreichen der Sättigung für jede Probe werden durch qPCR bestimmt (Tabelle 3), um den GC- und Größenbias in PCR10 zu reduzieren. SYBR Gold wurde mit nukleasefreiem Wasser verdünnt. Zur Herstellung der verdünnten Lösung wurde 1 μL SYBR Gold (Stammkonzentration 10.000x) zu 999 μL nukleasefreiem Wasser gegeben. Die in Tabelle 3 erwähnte Laufzeit der RT-qPCR beträgt ca. 60 min.
  4. Ermitteln Sie die erforderliche Anzahl zusätzlicher PCR-Zyklen anhand der Laufparameter aus Schritt 6.3.
    1. Anzahl der Zyklen = 1/4 maximale (gesättigte) Fluoreszenzintensität (typischerweise 3 oder 4 PCR-Zyklen)
  5. PCR-Amplifikationsprogramm Teil 2 (Volumen = 45 μL; Tabelle 4): Sobald Sie die Zyklusnummer ermittelt haben, richten Sie PCRs mit zusätzlichen Zyklen ein, die in Schritt 6.4.1 berechnet werden. Wenn die berechnete Zykluszahl beispielsweise 3 ist, richten Sie im folgenden Programm 3 Zyklen ein. Die Gesamtzyklen wären 8 (5 in Schritt 6.2., plus 3 zusätzliche Zyklen in Schritt 6.5).

7. Reinigung von Perlen

HINWEIS: Hier wurden AMPure XP (Table of Materials) Perlen verwendet.

  1. Zu den im vorherigen Schritt amplifizierten PCR-Produkten werden 150 μL Perlen bei RT hinzugefügt.
    HINWEIS: Hausgemachte AMPure-Perlen14 können in diesem Prozess verwendet werden.
  2. Inkubieren Sie für 15 min bei RT.
  3. Legen Sie die Röhrchen für 5 min auf einen Magnetständer.
  4. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig.
  5. Waschen Sie die Perlen mit 200 μL 80% Ethanol.
    HINWEIS: 80% Ethanol sollte frisch zubereitet werden.
  6. Wiederholen Sie Schritt 7.4.
  7. Entfernen Sie das Ethanol vollständig.
  8. Trocknen Sie die Proben 10 min an der Luft bei RT.
  9. Resuspendieren mit 50 μL Elutionspuffer (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
  10. Wiederholen Sie die Perlenreinigung (Schritte 7.1.-7.9.), um die Verunreinigung des Primers weiter zu minimieren.

8. DNA-Konzentration und Qualitätskontrolle

  1. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Nukleinsäure-Quantifizierungskit (Table of Materials).
  2. Überprüfen Sie die amplifizierten DNA-Fragmente durch Gelelektrophorese mit SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% Agarosegel) oder einem automatisierten Elektrophoresesystem (z.B. TapeStation, Bioanalyzer).

9. Sequenzierung

  1. Durchführung einer Hochdurchsatzsequenzierung unter Verwendung der amplifizierten DNA-Proben12,13.
    HINWEIS: Amplifizierte DNA-Proben sind bereit für die Hochdurchsatzsequenzierung. Um nukleosomale DNA-Fragmentinformationen zu erhalten, wird die Paar-End-Sequenzierung gegenüber der Single-End-Sequenzierung empfohlen. Beide Enden der DNA-Fragmente zeigen an, wo die Transposase bindet. Für die Kartierung offener Chromatinbereiche sind in der Regel 30 Millionen Lesevorgänge/Probe ausreichend.

10. Datenanalyse

  1. Datenfilterung basierend auf der Qualität von Basisanrufen: Legen Sie den minimalen durchschnittlichen Basisqualitätsfaktor auf 20 fest (Genauigkeit von 99 %).
  2. Adapterzuschnitt: Entfernen Sie die Adaptersequenzen mit einem geeigneten Werkzeug.
    HINWEIS: Das Wrapper-Werkzeug "Galore trimmen" (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) wurde verwendet, um Adaptersequenzen zu entfernen. Für ATAC-seq-Bibliotheken, die von Illumina Tn5 vorbereitet wurden, wird die folgende Sequenz als Adaptersequenz verwendet: CTGTCTCTTATACACATCT. Die minimale Sequenzlänge zur Erkennung von Adapterverunreinigungen ist auf 5 festgelegt.
  3. Genomkartierung: Ordnen Sie die Messwerte dem entsprechenden Genom mit Bowtie unter Verwendung der folgenden Parameter "-I 0 -X 2000 -m 1"15 zu. Ein Beispiel für die Kartierungsqualität von MDA-MB-231 basalen Brustkrebszellen ist unten:
    Lesevorgänge mit mindestens einer gemeldeten Ausrichtung: 52,79 %
    Lesevorgänge, die nicht ausgerichtet werden konnten: 13,10 %
    Lesevorgänge mit unterdrückten Ausrichtungen aufgrund von -m: 34,11 %
  4. Deduplizierung: Markieren Sie die PCR-Duplikate mit Picard-Tools16.
  5. Generieren einer Genomabdeckungsdatei für die Datenvisualisierung: Konvertieren Sie die deduplizierten Paired-End-Lesevorgänge in Single-End-Lesefragmente. Genomabdeckungsspuren werden mit genomeCoverageBed von Bettwerkzeugen17 erhalten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um erfolgreiche und qualitativ hochwertige ATAC-seq-Daten zu erhalten, ist es wichtig, die experimentellen Bedingungen zu optimieren. Die ATAC-seq-Bibliotheksvorbereitung kann in die fünf Hauptschritte unterteilt werden (Abbildung 1), nämlich Zelllyse, Tagmentation (Fragmentierung und Adapterinsertion durch Tn5), genomische DNA-Aufreinigung, PCR-Amplifikation und Datenanalyse. Als ersten Prozess muss zunächst der Zelllysepuffer (Kernisolierung) für jeden Zelltyp optimiert werden. Zur Lyse vo...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATAC-seq wurde häufig für die Kartierung offener und aktiver Chromatinregionen verwendet. Die Progression von Krebszellen wird häufig durch genetische Veränderungen und epigenetische Reprogrammierung vorangetrieben, was zu einer veränderten Chromatinzugänglichkeit und Genexpression führt. Ein Beispiel für diese Reprogrammierung ist während des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs (EMT) und seines umgekehrten Prozesses, des mesenchymalen zu epithelialen Übergangs (MET), die als wichtige zelluläre Reprogrammierungsproze...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass es keine relevanten oder wesentlichen finanziellen Interessen gibt, die sich auf die in diesem Papier beschriebene Forschung beziehen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken der UND Genomics Core Facility für die hervorragende technische Unterstützung.

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [P20GM104360 bis M.T., P20 GM104360 bis A.D.] und Anschubfonds der University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Department of Biomedical Sciences [bis M.T.] finanziert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenUSA Scientific1615-5500Natural
10 & micro; L XL TipOne-SpitzenUSA Scientific1120-3810Gefiltert und mit geringer Retention
100 & Mikro; L XL TipOne RPT-SpitzenUSA Scientific1182-1830Gefiltert und mit geringer Retention
100 & Mikro; L XL TipOne-SpitzenUSA Scientific1120-1840Gefiltert und mit geringer Retention.
Konische Zentrifugenröhrchen mit abgeschrägten 15 mLCorning352096
20 & Mikro; L TipOne RPT-SpitzenUSA Scientific1183-1810Gefiltert und mit geringer Retention
200 & Mikro; L TipOne RPT-SpitzenUSA Scientific1180-8810Gefilterte und 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit geringer Retention
Fisherbrand06-443-19
AgaroseThermoFisher ScientificYBP136010Genetische Analysequalität
Alle in dieser Studie verwendeten Zelllinien stammen aus ATCCATCC
Allegra X-30R ZentrifugeBeckman Coulter364658SX2415
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881Beads Aufreinigungskit
CellDrop ZellzählerDeNovixCellDrop FLZellzähler
EDTAMilliporeSigmaEDSBioUltra, wasserfrei, ≥ 99% (Titration)
EGTAMilliporeSigmaE3889
Ethanol 100%ThermoFisher ScientificAC615100020wasserfrei; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilisationsprodukte
Fötales Rinderserum - TET GeprüfteForschung und Entwicklung D SystemsS10350Triple 0.1 µ m gefiltert
Gibco DMEM 1xThermoFisher Scientific11965092[+] 4,5 g/L D-Glukose; [+] L-Glutamin; [-] Natriumpyruvat
Gibco PBS 1xThermoFisher Scientific10010023pH 7,4
Gibco Trypsin-EDTA 1xThermoFisher Scientific25200056(0,25%), Phenolrot
GlycerinIBI Scientific56-81-5
GlycinMilliporeSigmaG8898
HClMilliporeSigmaH1758
HEPESMilliporeSigmaH3375
Invitrogen Qubit FluorometerThermoFisher ScientificQ32857
MgCl2MilliporeSigmaM3634
MinElute PCR-AufreinigungskitQiagen28004DNA-Aufreinigungskit
NaClIBI Scientific7647-14-5
NaOHMilliporeSigmaS8045BioXtra, ≥ 98% (säuerlich), Pellets (wasserfrei)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541
Nextera DNA-ProbenvorbereitungskitIlluminaFC-121-10302x TD und Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)MilliporeSigmaI8896für die Molekularbiologie
PCR NachweissystemBioRad1855484CFX384 Echtzeit-System. C1000 Touch Thermocycler
PIPESMilliporeSigmaP1851BioPerformance Zertifiziert, geeignet für Zellkultur
Qubit dsDNA HS Assay KitThermoFisher ScientificQ32854Invitrogen; Nukleinsäure-Quantifizierungskit
Quibit Assay TubesThermoFisher ScientificQ32856Invitrogen
SDSMilliporeSigmaL3771
NatriumacetatHausgemacht-pH5,2
SaccharoseIBI Scientific57-50-1
SYBR GoldThermoFisher ScientificS11494
SYBR Grün Supermix, 1,25 mLBioRad1708882
T100 ThermocyclerBioRad1861096
TempAssure 0,2 mL PCR 8-Röhrchen-StreifenUSA Scientific1402-4700Flex-frei, natürlich, Polypropylen
TempPlate 384-WELL PCR PLATEUSA Scientific1438-4700Einzelne Kerbe. Natürliches Polypropylen
Tris BaseMilliporeSigma648311ULTROL Grade
Triton x-100IBI Scientific9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer KitIlluminaPE-121-1003
Trypan Blue StainThermoFisher ScientificQ32851
Tween-20MilliporeSigmaP7949BioXtra, viskose Flüssigkeit
WasserMilliporeSigmaW3500steril gefiltert, BioReagenz, geeignet für Zellkultur

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
  2. Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
  3. Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732(2021).
  4. Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
  5. Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
  6. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
  7. Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
  8. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  9. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1(2015).
  11. Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687(2021).
  12. Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516(2019).
  13. Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36(2016).
  14. Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
  15. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25(2009).
  16. Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository. , Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022).
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
  19. Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
  20. Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059(2018).
  21. Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072(2019).
  22. Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672(2019).
  23. Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
  24. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  25. Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
  26. Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
  27. McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
  28. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
  29. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  30. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  31. Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786(2021).
  32. Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
  33. Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Chromatin AccessibilityTn5 TransposaseLibrary PreparationOpen Chromatin RegionsCell Lysis BufferPCR AmplificationNucleosome Free FragmentsPeak Annotation

Verwandte Artikel