Summary
De analyse van veranderingen in contractiele functie en cellulaire integriteit van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten is van immens belang voor de ontwikkeling van niet-klinische geneesmiddelen. Een hybride 96-well celanalysesysteem behandelt beide parameters op een real-time en fysiologische manier voor betrouwbare, voor de mens relevante resultaten, die nodig zijn voor een veilige overgang naar klinische stadia.
Abstract
Cardiale contractiliteitsbeoordeling is van immens belang voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën en hun veilige overgang naar klinische stadia. Hoewel door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM's) veelbelovend zijn om te dienen als een voor de mens relevant model in preklinische fasen van geneesmiddelenontdekking en veiligheidsfarmacologie, is hun volwassenheid nog steeds controversieel in de wetenschappelijke gemeenschap en in constante ontwikkeling. We presenteren een hybride contractiliteit en impedantie/extracellulair veldpotentieel (EFP) technologie, die aanzienlijke pro-rijpingsfuncties toevoegt aan een industriestandaard 96-well platform.
Het impedantie/EFP-systeem bewaakt de cellulaire functionaliteit in realtime. Naast de slagsnelheid van contractiele cellen, detecteren de elektrische impedantiespectroscopie-uitlezingen door verbindingen geïnduceerde morfologische veranderingen zoals celdichtheid en integriteit van de cellulaire monolaag. In het andere onderdeel van het hybride celanalysesysteem worden de cellen gekweekt op bioconforme membranen die de mechanische omgeving van echt hartweefsel nabootsen. Deze fysiologische omgeving ondersteunt de rijping van hiPSC-CMs in vitro, wat leidt tot meer volwassen-achtige contractiele reacties, waaronder positieve inotrope effecten na behandeling met isoproterenol, S-Bay K8644 of omecamtiv mecarbil. Parameters zoals de amplitude van de contractiekracht (mN/mm2) en de beatduur onthullen ook stroomafwaartse effecten van verbindingen met invloed op elektrofysiologische eigenschappen en calciumbehandeling.
Het hybride systeem biedt het ideale hulpmiddel voor holistische celanalyse, waardoor preklinische cardiale risicobeoordeling mogelijk is die verder gaat dan de huidige perspectieven van voor mensen relevante celgebaseerde testen.
Introduction
Een van de belangrijkste doelen van de ontwikkeling van moderne geneesmiddelen is de verbetering van het succespercentage van nieuwe therapieën in de pijplijn voor het ontdekken van geneesmiddelen. Veiligheidsfarmacologische tests van deze nieuwe geneesmiddelen onthullen vaak bijwerkingen op het cardiovasculaire systeem die goed zijn voor bijna een kwart van het verloop van geneesmiddelen in preklinische stadia1. De ontwikkeling en integratie van nieuwe benaderingsmethodologieën (NAMs) spelen een sleutelrol bij de modernisering van preklinische beoordeling, in het bijzonder kernbatterijorganen zoals het hart. Aangezien deze methodologieën diervrije benaderingen zijn, werd het gebruik van op mensen gebaseerde celmodellen zoals cardiomyocyten (CM's) van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) oorsprong het afgelopen decennium het werkpaard voor de moderne beoordeling van veiligheidsfarmacologische en toxicologische kwesties2. Veelgebruikte testsystemen voor dergelijke onderzoeken zijn micro-elektrode array (MEA) en spanningsgevoelige kleurstof-gebaseerde experimentele benaderingen3.
Niettemin plaatst de geclaimde fenotypische en functionele onvolwassenheid van dit celtype obstakels in de weg van een ideaal op mensen gebaseerd celmodel, met het potentieel om translationele hiaten tussen niet-klinische en klinische studies te verminderen4.
In de loop der jaren is er enorm veel onderzoek gedaan om de reden voor het impliciete onrijpe fenotype te begrijpen en manieren te vinden om het rijpingsproces van menselijke iPSC-CMs in vitro te pushen.
Het ontbreken van hartrijpingssignalen zoals langdurige celkweektijden, een afwezigheid van andere celtypen in de buurt of een gebrek aan hormonale stimulatie bleek het rijpingsproces te beïnvloeden5. Ook werd de niet-fysiologische omgeving van reguliere celkweekplaten geïdentificeerd als een belangrijke oorzaak die de rijping van menselijke iPSC-CM's belemmert, vanwege de ontbrekende fysiologische substraatstijfheid van het inheemse menselijke hart 5,6.
Verschillende testsystemen met een focus op inheemse fysiologische omstandigheden werden ontwikkeld om dit probleem aan te pakken, waaronder 3D-celkweeksystemen waarbij cellen driedimensionaal worden uitgelijnd om te lijken op inheemse cardiale architectuur in plaats van typische tweedimensionale celculturen7. Hoewel verbeterde rijping wordt verkregen met 3D-assays, belemmert de behoefte aan geschoolde arbeidskrachten en de lage doorvoer van deze systemen een overvloedig gebruik hiervan in het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen, aangezien tijd en kosten een fundamentele rol spelen bij de beoordeling van nieuwe therapieën op financieel niveau8.
Belangrijke uitlezingen voor de farmacologische en toxicologische beoordeling van nieuwe therapieën zijn veranderingen in functionele en structurele kenmerken van humane iPSC-CMs, aangezien door verbindingen geïnduceerde bijwerkingen van het cardiovasculaire systeem meestal een of beide van deze eigenschappen beïnvloeden 1,9. Bekende voorbeelden van dergelijke brede bijwerkingen zijn geneesmiddelen tegen kanker van de anthracyclinefamilie. Hier worden gevaarlijke functionele en nadelige structurele effecten op het cardiovasculaire systeem op grote schaal gemeld tijdens en na de behandeling van kanker bij patiënten, evenals met in vitro celgebaseerde assays10,11.
In deze studie beschrijven we een uitgebreide methodologie voor de beoordeling van zowel functionele als structurele samengestelde bijwerkingen op hiPSC-CMs. De methodologie omvat de analyse van cardiomyocytencontractiele kracht en impedantie / extracellulaire veldpotentiaal (EFP) analyse. De contractiele kracht wordt gemeten onder fysiologische mechanische omstandigheden, waarbij de cellen worden gekweekt op zachte (33 kPa) siliconensubstraten, die de mechanische omgeving van het inheemse menselijke hartweefsel weerspiegelen.
Het systeem is uitgerust met 96-well platen voor high throughput analyse van humane iPSC-CMs voor preklinische cardiale veiligheid farmacologische en toxicologische studies, en biedt dus een voordeel ten opzichte van momenteel gebruikte 3D-benaderingen zoals Langendorff hart of hart plakjes12,13.
In detail bestaat het hybride systeem uit twee modules, hetzij voor de beoordeling van cardiale contractiliteit onder fysiologische omstandigheden, hetzij voor de analyse van real-time cellulaire structurele toxiciteit 6,14. Beide modules werken met gespecialiseerde 96-well platen met hoge doorvoer voor snelle en kosteneffectieve gegevensverzameling.
Zonder de noodzaak van een 3D-constructie, maakt de contractiliteitsmodule gebruik van speciale platen die flexibele siliconenmembranen bevatten als substraat voor de cellen in plaats van het stijve glas of plastic waaruit reguliere celkweekplaten meestal bestaan. De membranen weerspiegelen typische menselijke biomechanische harteigenschappen en bootsen daarom in vivo omstandigheden na op een manier met een hoge doorvoer. Hoewel menselijke iPSC-CM's vaak geen volwassen cardiomyocytengedrag vertonen met betrekking tot door verbindingen geïnduceerde positieve inotropie in andere celgebaseerde assays14, kan een meer volwassen-achtige reactie worden beoordeeld wanneer de cellen worden gekweekt op de platen van de contractiliteitsmodule. In eerdere studies is aangetoond dat iPSC-CM's positieve inotrope effecten vertonen bij behandeling met verbindingen zoals isoproterenol, S-Bay K8644 of omecamtiv mecarbil 6,15. Hier kunnen meerdere contractiliteitsparameters worden beoordeeld, zoals primaire parameters zoals de amplitude van contractiekracht (mN / mm2), beatduur en beatsnelheid, evenals secundaire parameters van de contractiecyclus zoals gebied onder de curve, contractie- en ontspanningshellingen, beat rate-variaties en aritmieën (aanvullende figuur 1) 16 . Geneesmiddel-geïnduceerde veranderingen in alle parameters worden niet-invasief beoordeeld door capacitieve afstandsdetectie. De ruwe data wordt vervolgens geanalyseerd door gespecialiseerde software.
De structurele toxiciteitsmodule voegt zijn unieke impedantie- en EFP-parameters toe als een uitlezing voor structurele cellulaire toxiciteit en de analyse van elektrofysiologische eigenschappen17,18. De elektrische impedantiespectroscopietechnologie onthult samengestelde veranderingen in celdichtheid of cel- en monolaagintegriteit die in realtime wordt bewaakt, zoals aangetoond met menselijke iPSC-CM's die zijn behandeld met bekende cardiotoxische verbindingen13. Met impedantie-uitlezingen op verschillende frequenties (1-100 kHz) is het mogelijk om een fysiologische respons verder te ontleden, en zo is het onthullen van veranderingen in membraantopografie, cel-cel of cel-matrix juncties haalbaar. De aanvullende EFP-registratie van humane iPSC-CM's maakt verder de analyse mogelijk van elektrofysiologische effecten die worden veroorzaakt door samengestelde behandeling, zoals werd aangetoond in het licht van de CiPA-studie17,19.
In deze studie werden humane iPSC-CMs gebruikt, behandeld met epirubicine en doxorubicine, beide goed beschreven als cardiotoxische anthracyclines, en erlotinib, een tyrosinekinaseremmer (TKI) met een vrij laag risico op cardiovasculaire toxiciteit. Chronische beoordeling met epirubicine, doxorubicine en erlotinib werd gedurende 5 dagen uitgevoerd. Het resultaat toont kleine veranderingen in contractiliteit en base impedantie wanneer cellen werden behandeld met erlotinib, maar een tijd- en dosisafhankelijke toxische afname van contractieamplitude en base impedantie bij behandeling met respectievelijk epirubicine en doxorubicine. Acute metingen werden uitgevoerd met calciumantagonist nifedipine en tonen een afname van de amplitude van de contractie, de duur van het veldpotentiaal en de basisimpedantie, wat cardiotoxische bijwerkingen van deze verbinding op zowel functioneel als structureel niveau aantoont.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De workflow voor contractiliteit en impedantie/FPW-meting is weergegeven in aanvullende figuur 2.
1. Plaatcoating
- Open de vacuümverzegelde verpakking en haal de 96-wells plaat eruit. De procedures voor 96-well platen van beide modules zijn hetzelfde. Laat de contractieplaat afgedekt door de extra meegeleverde membraanafscherming tot de meting in de contractiliteitsmodule.
- Bedek de flexibele 96-well platen voor het zaaien van cardiomyocyten.
- Bereid een verdunde EHS-gelcoatingoplossing door 2,75 ml ehs-gel kant-en-klare oplossing over te brengen in een steriele centrifugebuis. Voeg vervolgens 8,25 ml DPBS toe met Ca2+ en Mg2+. Meng de oplossing zorgvuldig.
OPMERKING: Optioneel kan fibronectine ook worden gebruikt voor het coaten van de putten: bereid 13 ml fibronectinecoatingoplossing in een steriele centrifugebuis door 650 μL fibronectine-stamoplossing (1 μg / ml) in 13 ml DPBS te verdunnen met Ca2 + en Mg2 +, wat resulteert in een werkoplossing van 50 μg / ml. Meng de oplossing zorgvuldig.
- Bereid een verdunde EHS-gelcoatingoplossing door 2,75 ml ehs-gel kant-en-klare oplossing over te brengen in een steriele centrifugebuis. Voeg vervolgens 8,25 ml DPBS toe met Ca2+ en Mg2+. Meng de oplossing zorgvuldig.
- Breng de coatingoplossing over in een steriel reagensreservoir dat in de laboratoriumautomatiseringsrobot is geplaatst.
- Voeg 100 μL van de coatingoplossing per put toe met de laboratoriumautomatiseringsrobot met behulp van het programma "ADD100μL". Plaats het deksel terug op de 96-well plaat en incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C.
OPMERKING: Het programma voor de labautomatiseringsrobot moet vooraf handmatig worden ingesteld.
2. Zaaien van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten in flexibele 96-well platen (dag 0)
- Ontdooi de cellen volgens de richtlijnen van de fabrikant.
- Tel de cellen met een handmatige telkamer en pas de cellen in het aanbevolen platingmedium aan volgens de instructies van de celfabrikant (bijv. 1 x 105 cellen / put), wat resulteert in 11 x 106 cellen / 11 ml voor het zaaien van een volledige 96-well plaat.
- Verwijder de EHS-geloplossing uit de putten met de laboratoriumautomatiseringsrobot met behulp van het programma "REMOVE100μL". Verwijder het reagensreservoir met de gedoseerde coatingoplossing uit de robot.
- Breng de celsuspensie (11 ml totaal) over in een steriel reagensreservoir dat in de laboratoriumautomatiseringsrobot is geplaatst en zaai de cellen met 100 μL / put met behulp van het programma "CELLS_ADD100 μL".
- Breng onmiddellijk na het zaaien van de cel de flexibele 96-well plaat over in de incubator (37 °C, 5% CO2, vochtigheidsgestuurd) en laat de cellen een nacht bezinken.
3. Gemiddelde uitwisseling van flexibele 96-well platen (dag 1)
- Verwarm ten minste 22 ml cardiomyocytenonderhoudsmedium per plaat tot 37 °C in een centrifugebuis van 50 ml, 18-24 uur na het zaaien van de platen.
- Breng het verse medium (ten minste 22 ml) over in een steriel reagensreservoir en laat het vlak naast de laboratoriumautomatiseringsrobot staan. Plaats een leeg reagensreservoir in de robot en voer mediumverwijdering uit met het programma "REMOVE100μL". Verwissel daarna het reagensreservoir dat het afvalmedium bevat met het reagensreservoir dat het verse medium bevat en doseer 200 μL van het verse medium per put met het programma "ADD100μL". Voer deze stap twee keer uit om 200 μL/put te bereiken.
- Breng onmiddellijk na mediumuitwisseling de plaat terug in de incubator.
- Voer om de dag een mediumuitwisseling (200 μL/put) uit tot toevoeging van de verbinding.
4. Laatste mediumuitwisseling vóór samengestelde toevoeging (dag 5-7)
- Voer een laatste mediumverandering 4-6 uur uit voordat u de verbinding toevoegt.
- Verwarm ten minste 22 ml testbuffer voor één flexibele 96-well plaat. De testbuffer bestaat uit onderhoudsmedium of derivaten daarvan (bijv. laag/geen serummedia, fenolrode vrije media of andere isotone buffers).
- Breng het verse medium over in een steriel reagensreservoir en laat het vlak naast de laboratoriumautomatiseringsrobot staan. Plaats een leeg reagensreservoir in de robot en voer mediumverwijdering uit. Verwissel daarna het reagensreservoir dat het afvalmedium bevat met het reagensreservoir dat het verse medium bevat en doseer 200 μL/put van het verse medium.
- Breng onmiddellijk na mediumuitwisseling de flexibele plaat terug in de incubator.
5. Samengestelde toevoeging en gegevensregistratie (dag 5-7)
OPMERKING: Een voorbeeld van een meetplan voor het experiment wordt gegeven in aanvullende figuur 3.
- Bereid de werkoplossing per verbinding in 4x de concentratie in de laminaire stromingskap met behulp van een steriele gewone putplaat van 96 diep. De samengestelde oplossing is gebaseerd op de testbuffer die in stap 4 is gebruikt. Breng de 96-diepe putplaat met de samengestelde oplossing gedurende ten minste 1 uur over in de incubator om deze aan te passen aan dezelfde toestand als de flexibele plaat.
OPMERKING: De 1x-concentratie van elk medicijn dat voor elk experiment wordt gebruikt, wordt vermeld in de cijfers en legenda's. - Breng de plaat 1 uur voordat u een nulmeting uitvoert over naar het betreffende meetapparaat.
- Open Edit Protocol in de besturingssoftware (onderdeel van het hybride celanalysesysteem) en selecteer de respectievelijke meetmoduscontractiliteit of impedantie/EFP.
- Definieer de sweep-duur (lengte van één meting; bijvoorbeeld 30 s) en het herhalingsinterval (tijd tussen metingen; bijvoorbeeld 5 minuten) en sla het protocolnummer op.
- Selecteer Startprotocol > Doorgaan en vul de gevraagde velden in.
- Selecteer ten slotte Meting starten. Voer minimaal drie nulmetingen (sweeps) uit in intervallen van 5 minuten kort voordat de verbinding wordt toegevoegd.
OPMERKING: Voorbeeldgegevens van een contractiliteitsbasismeting met behulp van de contractiliteitsmodule voordat samengestelde optelling wordt weergegeven in aanvullende figuur 4 - Verwijder 50 μL van de testbuffer uit elke put zonder de flexibele 96-wellsplaat uit het meetapparaat te verwijderen.
- Voeg 50 μL van de 4x geconcentreerde samengestelde oplossing toe aan elke put van de plaat, volgens het meetplan.
- Selecteer Regiomarkering toevoegen en definieer de lay-out van de samengestelde plaat en het volume van de samengestelde oplossing na toevoeging van de samengestelde verbinding.
- Selecteer ten slotte Doorgaan met standaardmeting of Doorgaan met meetreeksen volgens het experimentele plan.
6. Data-analyse
- Met opnamesoftware meet u sweeps, waarvan de lengte en het herhalingsinterval door de gebruiker worden gedefinieerd.
- Met analysesoftware kunt u de vorm van het signaal vastleggen door parameters zoals amplitude, beatsnelheid, pulsbreedte, enzovoort automatisch uit te lezen.
OPMERKING: Een gemiddeld signaal inclusief de standaarddeviatie, de zogenaamde gemiddelde beat, wordt automatisch berekend op basis van de gegevens van één sweep. De gebruiker kan de contractiliteit/IMP/EFP-parameters definiëren die de software berekent en weergeeft. - Bereken met analysesoftware de dosis-responscurve en IC50/EC50 voor elke verbinding.
OPMERKING: De onbewerkte gegevens en de analyseresultaten die met de analysesoftware worden gegenereerd, kunnen eenvoudig in verschillende indelingen worden geëxporteerd. Ten slotte worden de gegevensrapporten automatisch gegenereerd om de experimentele resultaten samen te vatten en te archiveren. Een uitgebreide beschrijving van wat en hoe een EFP-signaal wordt gemeten, wordt besproken in 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De effecten van kinaseremmer erlotinib op de contractiliteit van hiPSC-CMs zijn weergegeven in figuur 1. De cellen werden behandeld met concentraties variërend van 10 nM tot 10 μM gedurende 5 dagen en de beatparameters werden dagelijks geregistreerd. Erlotinib, een EGFR (epidermale groeifactorreceptor) en tyrosinekinaseremmer met een vergelijkbaar laag risico op cardiotoxiciteit, had een kleine dosis en tijdsafhankelijk effect op hiPSC-CM's alleen bij concentraties in het micromolaire bereik. Bij de laagste concentratie (10 nM) veroorzaakte erlotinib een statistisch onbeduidende afname van de amplitude bij de eerste meting na toediening van de verbinding (1 uur). Bij alle daaropvolgende metingen werd bij deze concentratie geen vergelijkbaar effect gemeten. De voorbijgaande afname kan het gevolg zijn van een samengesteld effect, maar ook het gevolg zijn van een voorbijgaande vervorming van het ritmepatroon tijdens de samengestelde toevoegingsprocedure, bijvoorbeeld van thermische of mechanische aard. Micromolaire concentraties van erlotinib vertoonden lichte maar significante tijd- en dosisafhankelijke cardiotoxische effecten. Het begin van het effect werd waargenomen vanaf 96 h met 1 μM erlotinib, terwijl 10 μM resulteerde in een significante afname slechts 24 uur na toevoeging van de verbinding.
Chemotherapiemiddel epirubicine had zowel een tijd- als dosisafhankelijk effect op hiPSC-CM's (figuur 2). De cellen stopten met kloppen binnen 24 uur na het aanbrengen van 10 μM epirubicine. Met 1 μM werd een drastische afname van de amplitude tot 44% ± 2% van de controle na 24 uur gevolgd door volledige beat-stopzetting tot 48 uur na toevoeging van de verbinding. Bij 100 nM werd een tijdsafhankelijke afname van de beatamplitude gedurende een periode van 5 dagen waargenomen met een resterende amplitude van 25% ± 3% op dag 5. Bij de laagste concentratie van 10 nM was het effect van epirubicine alleen dosisafhankelijk maar niet tijdsafhankelijk, beginnend bij de eerste meting (1 uur na toevoeging van de verbinding). De amplitude schommelde gestaag tussen 60%-80% van de controle over de periode van 5 dagen. De afwijkingen in deze groep waren groter in vergelijking met de hogere concentraties. Een mogelijke reden zou het feit kunnen zijn dat deze concentratie slechts een meetbaar effect had op een deel van de putten.
Doxorubicine is een andere anthracyclineklasse van medicatie en de celvitaliteit van hiPSC-CM's werd onderzocht door de basisimpedantie in de loop van de tijd te monitoren. Figuur 3 laat zien dat een blootstelling van 24 uur aan 300, 1, 3 en 10 μM doxorubicine de levensvatbaarheid van de cel op een concentratie- en tijdsafhankelijke manier vermindert.
Nifedpinie is een dihydropyridine calciumkanaalblokker die voornamelijk L-type calciumkanalen blokkeert. Langdurige monitoring gedurende 24 uur van de levensvatbaarheid van de cellen onthult een tijd- en concentratieafhankelijke afname van de basisimpedantie die wordt gebruikt als een maat voor toxiciteit (figuur 4A). Bij toepassing van toenemende nifedipineconcentraties (3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM) laten veldpotentiaalregistraties op hiPSC-CM's een concentratieafhankelijke verkorting zien van de genormaliseerde veldduur (FPD) zoals verwacht (figuur 4B,C). Nifedipinebeoordeling met betrekking tot cardiale contractiliteit toonde ook een significante concentratieafhankelijke amplitudeafname bij acute meting met 10 nM- en 30 nM-concentraties (figuur 5).
De resultaten verkregen met het hybride celanalysesysteem tonen aan dat drie cardiale eindpunten (contractiliteit, structuur en elektrofysiologie) van hiPSC-CM's kunnen worden beoordeeld met behulp van één systeem.
Figuur 1: Contractiliteitsbeoordeling van van humane iPSC afgeleide cardiomyocyten die gedurende 5 dagen met erlotinib zijn behandeld. De x-as toont de tijd in uren, y-as plots parameter amplitude in termen van percentage. Sterretjes vertegenwoordigen statistische significantie met p < 0,05 (*) of p < 0,01 (**) (Wilcoxon Mann Whitney-test, n = 4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Contractiliteitsbeoordeling van van humane iPSC afgeleide cardiomyocyten behandeld met cardiotoxisch anthracycline-epirubicine gedurende 5 dagen. De x-as toont de tijd in uren, y-as plots parameter amplitude in termen van percentage. Sterretjes vertegenwoordigen statistische significantie met p < 0,05 (*) of p < 0. 01 (**) (Wilcoxon Mann Whitney-test, n = 4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Basisimpedantie van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten na behandeling met doxorubicine. Tijdsverloop van de basisimpedantie van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten gedurende 24 uur blootstelling aan 300, 1, 3 en 10 μM doxorubicine (n = 5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Impedantie- en EFP-opnames van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten. (A) Tijdsverloop van de basisimpedantie van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten gedurende 24 uur, bij blootstelling aan 3, 10, 30 en 100 nM nifedipine (n = 5). (B) Tijdsverloop van de veldpotentiaalduur van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten gedurende 1 uur, bij blootstelling aan 3, 10, 30 en 100 nM nifedipine (n = 5). (C) Elektrode lay-out van de impedantie/EFP plaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Contractiliteitsbeoordeling (contractiliteitsmodule) van humane iPSC-afgeleide cardiomyocyten behandeld met nifedipine gedurende 20 minuten. De x-as toont de tijd in min, Y-as plots parameter amplitude in termen van percentage. Sterretjes vertegenwoordigen statistische significantie met p < 0. 05 (*) of p < 0,01 (**) (Wilcoxon Mann Whitney-test, n = 4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Contractiliteitsparameters en ruwe gegevens beoordeeld met de contractiliteitsmodule. (Links) Parameters beoordeeld met de contractiliteitsmodule. Parameters: Amplitude van contractiekracht (mN/mm2), beatduur, upstroke en downstroke velocity, upstroke en downstroke area under curve (AUC), beat rate, beat rate variaties, aritmische gebeurtenissen. (Rechts) Contractiliteit ruwe gegevensregistraties van één put met onbehandelde cardiomyocyten (A) beat rate, (B) beat rate variaties, (C) vroeg na contracties, en (D) aritmische gebeurtenissen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Workflow voor contractiliteit en impedantie/EFP-meting. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Voorbeeld lay-out van een meetplan voor een 96-well plaat. Vier verbindingen (gemarkeerd in rood, lichtgroen, bruin en donkergroen) met vier concentraties en vier replica's zijn afgebeeld. Positieve en negatieve controles (bijv. pre-kweekomstandigheden en DMSO) zijn geel gemarkeerd. Back-upcellen zijn blauw gemarkeerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 4: Voorbeeldgegevens van een contractiliteitsbasismeting met behulp van de contractiliteitsmodule vóór toevoeging van de verbinding. In elke grafiek wordt het gemiddelde van alle krimpcycli van één sweep weergegeven. Om de beat rate te visualiseren, worden twee opeenvolgende weeën getoond. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het impedantie/FPW/contractiliteit hybride systeem is een uitgebreide methodologie voor high throughput veiligheid farmacologische en toxicologische beoordeling van cardiale aansprakelijkheden voor preklinische geneesmiddelenontwikkeling. Het biedt een moderne aanpak voor preklinische veiligheidstests zonder het gebruik van diermodellen, maar met hogere doorvoermogelijkheden die tijd en kosten aanzienlijk verminderen. Dit systeem heeft het potentieel om te worden gebruikt als een aanvullende benadering voor het Langendorff-hart en andere diermodellen voor preklinische functionele en structurele toxiciteitsbeoordeling.
Als diervrije aanpak worden menselijke iPSC-CMs gebruikt voor het hybride systeem20. Hier bieden de speciale flexibele 96-well platen met het pro-rijpingseffect op menselijke iPSC-CM's een belangrijk voordeel in vergelijking met andere celgebaseerde assays21,22, omdat doorvoer en een fysiologische omgeving op unieke wijze worden gecombineerd voor meer volwassen-achtige menselijke cardiale risicobeoordeling 6,15.
De meest kritische stap in het protocol is de toepassing van de verbinding, vooral wanneer acute effecten moeten worden onderzocht. Aangezien de cellen worden gekweekt op zachte substraten die mechanische krachten uitvoeren, kan overmatige versnelling tijdens het hanteren van de plaat en het toepassen van schuifkrachten tijdens het pipetteren leiden tot voorbijgaande (5-10 min) veranderingen van de contractieparameters en moet worden vermeden. Over het algemeen moet tijdens mediavervangingen voorzichtig zijn om verstoring van de membranen te voorkomen. Het gebruik van laboratoriumautomatiseringsapparatuur wordt aanbevolen.
Voordat de samengestelde analyse wordt uitgevoerd, is een pre-kweekstap van 5-7 dagen vereist, zodat menselijke iPSC-CM's, meestal verkregen in een cryo-geconserveerde toestand, kunnen herstellen van de ontdooiprocedure en een goed syncytium kunnen bouwen. Voor beide modules geven de contractieamplitude, evenals de slagsnelheid, inzicht in het ideale startpunt van de meting die meestal plaatsvindt tussen dag 5-7. De nulmeting is een cruciale stap om functionele basislijnkenmerken te identificeren die worden gebruikt als inclusiecriteria voor de onderzochte hiPSC-CM's3. De uitgangswaarden moeten vlak voor de samengestelde behandeling worden geregistreerd, zodat veranderingen in contractiegedrag kunnen worden vergeleken met niet-behandelingscondities (aanvullende figuur 3).
Rekening houden met variabiliteiten en het hebben van gedefinieerde basislijnkenmerken is de sleutel tot succesvolle metingen van hiPSC-CM en gegevensinterpretatie. Om deze reden worden best practice aanbevelingen van Gintant et al., gevolgd met behulp van het hybride celanalysesysteem; de uitgangswaarde moet bijvoorbeeld worden geregistreerd vóór de toevoeging van de verbinding en de basisregistratie moet aan bepaalde voorwaarden voldoen3.
Hoewel de flexibele 96-well platen zijn uitgerust met fragiele membranen, zal een meegeleverde beschermplaat in combinatie met voorzichtige behandeling schade voorkomen. De membranen zijn voorbehandeld om een stabiele hechting van cellen aan het siliconensubstraat mogelijk te maken, dat een lage intrinsieke biocompatibiliteit heeft. De behandeling is stabiel gedurende ten minste 6 maanden. Terwijl de cellen constant op 37 °C worden gehouden, zijn de mechanische eigenschappen van siliconenmaterialen stabiel bij een breed temperatuurbereik. Bovendien beïnvloeden noch geneesmiddelen noch oplosmiddelen de eigenschappen van de siliconen bij concentraties die worden gebruikt in celgebaseerde testen (dmso-concentraties blijven bijvoorbeeld onder 0,1%).
Het systeem werd gevalideerd en geoptimaliseerd met een breed scala aan in de handel verkrijgbare hiPSC-CM's. Bij het gebruik van op maat gemaakte cellen wordt het testen van standaard extracellulaire matrix (ECM) eiwitten voor optimale celaanhechting aanbevolen (bijv. Fibronectine, EHS-matrix en poly-L-lysine 6,15).
Elektrofysiologie, calciumsignalering en contractiliteit zijn de drie belangrijkste cardiale eindpunten die worden aangepakt in de preklinische ontwikkeling. Het hybride systeem is momenteel beperkt tot het analyseren van twee van deze cardiale eindpunten- contractiliteit en elektrofysiologie. Calciumsignalering in cardiomyocyten kan niet direct worden geanalyseerd, maar tangentieel worden gedetecteerd via contractiliteit en elektrofysiologische eigenschappen.
Zowel de impedantie/EFP als de contractiekrachtmeting worden uitgevoerd met monolagen van cardiomyocyten. Ondanks het voordeel van een fysiologische mechanische substraatstijfheid tijdens contractiemeting, ervaren de cellen niet de driedimensionale omgeving van echt menselijk weefsel. Aan de andere kant maakt dit het gebruik mogelijk van slechts een fractie van de dure van stamcellen afgeleide celmodellen met standaard laboratoriumapparatuur. Vandaar dat deze applicatie een gunstige relatie belooft te hebben tussen kosten, robuustheid en voorspelbaarheid in vergelijking met in vivo / ex vivo of 3D-modellen. Toekomstige toepassingen van het hybride systeem kunnen de analyse van andere contractiele celtypen zoals gladde spiercellen omvatten. Bij de regulatie van cardiovasculaire homeostase spelen deze cellen een belangrijke rol als tegenhangers van cardiomyocyten. Het hybride systeem biedt ook add-ons voor specifieke projecten, zoals optische stimulatie van menselijke iPSC-CM's. Voor dit doel kan een speciaal optisch deksel worden aangebracht op beide modules voor de stimulatie van menselijke iPSC-CM's die tijdens de precultuurtijd werden getransfecteerd met Channelrhodopsin-2.
Het hybride systeem impedantie/EFP/contractiliteit maakt dus een moderne preklinische veiligheids- en toxiciteitsbeoordeling mogelijk door drie verschillende cardiale eindpunten (contractiliteit, structurele veranderingen en elektrofysiologie) binnen één methodologie te analyseren. Het voordeel van het aanpakken van deze eindpunten met een op mensen gebaseerd hartcelmodel op een hoog doorvoerniveau tilt dit hybride systeem verder dan de huidige perspectieven van preklinische cardiale risicobeoordeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.L., M.Go. en P.L. zijn werkzaam bij innoVitro GmbH, fabrikant van de flexibele platen. U.T., E.D., M.L., M.Ge., N.F. en S.S. zijn werkzaam bij Nanion Technologies GmbH, fabrikant van het hybride apparaat.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Duitse federale ministerie van Economische Zaken en Klimaatactie (ZIM) en van het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (KMUinnovativ). Wij danken FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) voor het verstrekken van cardiomyocyten en Ncardia B.V. (Leiden, Nederland) voor het vriendelijk verstrekken van cardiomyocyten, gebruikt in deze studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
- Weaver, R. J., Valentin, J. -P. Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
- Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
- Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
- Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
- Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
- Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
- Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
- Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
- Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
- Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).
