Ein auf Durchflusszytometrie basierender Zelloberflächenproteinbindungsassay zur Beurteilung der Selektivität und Spezifität eines Antikrebs-Aptamers

Maryam Nakhjavani; Breanna Giles; Mia Strom; Chris Vi; Sahara Attenborough; Sarah Shigdar

doi:10.3791/64304

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Methodenartikel

Ein auf Durchflusszytometrie basierender Zelloberflächenproteinbindungsassay zur Beurteilung der Selektivität und Spezifität eines Antikrebs-Aptamers

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DOI:

10.3791/64304

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13. September 2022

Maryam Nakhjavani¹^,² , Breanna Giles¹^,² , Mia Strom¹^,² , Chris Vi¹^,² , Sahara Attenborough¹^,² , Sarah Shigdar¹^,²

¹School of Medicine, Deakin University, ²Institute for Mental and Physical Health and Clinical Translation, School of Medicine, Deakin University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein notwendiger Schritt in der Entwicklung von Antikrebs-Aptamern besteht darin, seine Bindung an das Ziel zu testen. Wir demonstrieren einen durchflusszytometrischen Assay zur Untersuchung dieser Bindung und betonen die Bedeutung der Einbeziehung eines Negativkontrollaptamers und Krebszellen, die für dieses bestimmte Protein positiv oder negativ sind.

Zusammenfassung

Eine zentrale Herausforderung bei der Entwicklung eines Antikrebs-Aptamers besteht darin, die Selektivität und Spezifität des entwickelten Aptamers für das Zielprotein effizient zu bestimmen. Aufgrund seiner zahlreichen Vorteile gegenüber monoklonalen Antikörpern hat die Aptamer-Entwicklung unter Krebsforschern enorme Popularität erlangt. Die systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) ist die gebräuchlichste Methode zur Entwicklung von Aptameren, die spezifisch für Proteine von Interesse sind. Nach SELEX beschleunigt ein schneller und effizienter Bindungsassay den Identifizierungsprozess und bestätigt die Selektivität und Spezifität des Aptamers.

Dieser Artikel erläutert einen schrittweisen durchflusszytometrischen Bindungsassay eines Aptamers, das spezifisch für epitheliale zelluläre Adhäsionsmoleküle (EpCAM) ist. Das Transmembran-Glykoprotein EpCAM wird in den meisten Karzinomen überexprimiert und spielt eine Rolle bei der Initiierung, Progression und Metastasierung von Krebs. Daher ist es ein wertvoller Kandidat für die gezielte Medikamentenabgabe an Tumore. Um die Selektivität und Spezifität des Aptamers gegenüber der membrangebundenen EpCAM zu bewerten, werden EpCAM-positive und -negative Zellen benötigt. Zusätzlich wird ein unverbindlicher EpCAM-Aptamer mit ähnlicher Länge und 2-dimensionaler (2D) Struktur wie der EpCAM-bindende Aptamer benötigt. Der Bindungsassay umfasst verschiedene Puffer (Blockierungspuffer, Waschpuffer, Inkubationspuffer und FACS-Puffer) und Inkubationsschritte.

Das Aptamer wird mit den Zelllinien inkubiert. Nach den Inkubations- und Waschschritten werden die Zellen mit einem empfindlichen Durchflusszytometrie-Assay bewertet. Die Analyse der Ergebnisse zeigt die Bindung des EpCAM-spezifischen Aptamers an EpCAM-positive Zellen und nicht an die EpCAM-negativen Zellen. In EpCAM-positiven Zellen wird dies als Bandverschiebung in der Bindung des EpCAM-Aptamers nach rechts im Vergleich zur unverbindlichen Aptamerkontrolle dargestellt. In EpCAM-negativen Zellen überlappen sich die entsprechenden Banden von EpCAM-bindenden und -nicht-bindenden Aptameren. Dies zeigt die Selektivität und Spezifität des EpCAM-Aptamers. Während sich dieses Protokoll auf den EpCAM-Aptamer konzentriert, ist das Protokoll auf andere veröffentlichte Aptamere anwendbar.

Einleitung

Krebs ist nach wie vor eine der häufigsten Todesursachen weltweit¹. Trotz der deutlichen Verbesserung der Krebsbehandlung in den letzten Jahrzehnten ist die Entwicklung von Krebsmedikamenten immer noch ein viel diskutiertes Thema. Dies liegt daran, dass die Chemotherapie als Hauptstütze der Krebsbehandlung von schwerwiegenden Nebenwirkungen begleitet wird, die die Einhaltung der Behandlung durch den Patienten einschränken. Darüber hinaus hat die durch Chemotherapie induzierte Krebsresistenz ihre Anwendung als einzige Wahl der medizinischen Intervention eingeschränkt. Die Anwendung von monoklonalen Antikörpern (mAbs) führte zu einem verbesserten....