Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

Joo-Hui Han; Rebecca E. Tweedell; Thirumala-Devi Kanneganti

doi:10.3791/64308

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Methodenartikel

Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

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DOI:

10.3791/64308

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20. Januar 2023

Joo-Hui Han¹ , Rebecca E. Tweedell¹ , Thirumala-Devi Kanneganti¹

¹Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Methode zur Beurteilung der Caspase-Aktivierung (Caspase-1, Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-11) als Reaktion auf In-vitro - und In-vivo-Modelle (in Mäusen) von Infektionen, sterilen Beleidigungen und Krebs, um die Initiierung von Zelltodwegen wie Pyroptose, Apoptose, Nekroptose und PANoptose zu bestimmen.

Zusammenfassung

Die angeborene Immunität stellt die entscheidende erste Verteidigungslinie als Reaktion auf Krankheitserreger und sterile Beleidigungen dar. Eine wichtige mechanistische Komponente dieser Reaktion ist die Einleitung des angeborenen immunprogrammierten Zelltods (PCD), um infizierte oder beschädigte Zellen zu eliminieren und Immunantworten zu verbreiten. Eine übermäßige PCD ist jedoch mit Entzündungen und Pathologien verbunden. Daher ist das Verständnis der Aktivierung und Regulation von PCD ein zentraler Aspekt bei der Charakterisierung der angeborenen Immunantwort und der Identifizierung neuer therapeutischer Ziele im gesamten Krankheitsspektrum.

Dieses Protokoll bietet Methoden zur Charakterisierung der PCD-Aktivierung des angeborenen Immunsystems durch Überwachung von Caspasen, einer Familie von Cystein-abhängigen Proteasen, die häufig mit verschiedenen PCD-Signalwegen assoziiert sind, einschließlich Apoptose, Pyroptose, Nekroptose und PANoptose. Erste Berichte charakterisierten Caspase-2, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-10 als Initiator-Caspasen und Caspase-3, Caspase-6 und Caspase-7 als Effektor-Caspasen bei Apoptose, während spätere Studien die entzündlichen Caspasen Caspase-1, Caspase-4, Caspase-5 und Caspase-11 fanden, die Pyroptose auslösen. Es ist nun bekannt, dass es eine umfangreiche Wechselwirkung zwischen den Caspasen und anderen angeborenen Immun- und Zelltodmolekülen über die zuvor definierten PCD-Signalwege gibt, was eine wichtige Wissenslücke im mechanistischen Verständnis der angeborenen Immunität und der PCD identifiziert und zur Charakterisierung der PANoptose führt. PANoptose ist ein einzigartiger angeborener immuninflammatorischer PCD-Signalweg, der durch PANoptosom-Komplexe reguliert wird, die Komponenten, einschließlich Caspasen, aus anderen Zelltodwegen integrieren.

Hier werden Methoden zur Beurteilung der Aktivierung von Caspasen als Reaktion auf verschiedene Reize bereitgestellt. Diese Methoden ermöglichen die Charakterisierung von PCD-Signalwegen sowohl in vitro als auch in vivo, da aktivierte Caspasen eine proteolytische Spaltung durchlaufen, die durch Western Blot unter Verwendung optimaler Antikörper und Blotting-Bedingungen sichtbar gemacht werden kann. Es wurden ein Protokoll und ein Western-Blotting-Workflow etabliert, die es ermöglichen, die Aktivierung mehrerer Caspasen aus derselben Zellpopulation zu bewerten und eine umfassende Charakterisierung der PCD-Prozesse zu ermöglichen. Diese Methode kann in allen Forschungsbereichen in den Bereichen Entwicklung, Homöostase, Infektion, Entzündung und Krebs angewendet werden, um PCD-Signalwege in zellulären Prozessen in Gesundheit und Krankheit zu bewerten.

Einleitung

Das angeborene Immunsystem fungiert als erste Verteidigungslinie während einer Infektion und als Reaktion auf sterile Reize wie Gewebeverletzungen und Veränderungen der Homöostase. Angeborene Immunsensoren auf der Zelloberfläche und im Zytoplasma reagieren auf pathogen- oder schädigungsassoziierte molekulare Muster (PAMPs bzw. DAMPs), um entzündliche Signalwege und zelluläre Reaktionen auszulösen. Einer der Schlüsselprozesse der angeborenen Immunantwort ist die Induktion des Zelltods, um infizierte oder beschädigte Zellen zu entfernen und weitere angeborene und adaptive Immunantworten voranzutreiben. Der programmierte Zelltod (PCD) ist ein hochkonservierter Prozess üb....