Eine minimal-invasive, genaue und effiziente Technik zur intrathymischen Injektion bei Mäusen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein interventionelles radiologisches Verfahren, das für die intrathymische Injektion bei Mäusen eingerichtet wurde, um das Risiko einer offenen Operation zu vermeiden und die Genauigkeit blinder perkutaner Injektionen zu verbessern.

Zusammenfassung

Die intrathymische Injektion in Mausmodellen ist eine wichtige Technik zur Untersuchung der Thymus- und Immunfunktion, einschließlich genetischer und erworbener T-Zell-Störungen. Dies erfordert Methoden zur direkten Ablagerung von Reagenzien und/oder Zellen in den Thymus lebender Mäuse. Traditionelle Methoden der intrathymischen Injektion umfassen Thoraxchirurgie oder minimalinvasive perkutane Blindinjektionen, die beide erhebliche Einschränkungen aufweisen. Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebungsgeräte haben bildgeführte perkutane Injektionen bei Mäusen ermöglicht, wodurch die Injektionsgenauigkeit des perkutanen Injektionsansatzes erheblich verbessert und die Injektion kleinerer Ziele ermöglicht wurde. Bildgeführte Injektionen sind jedoch auf die Verwendung eines integrierten Schienensystems angewiesen, was dies zu einem starren und zeitaufwändigen Verfahren macht. Hier wird eine einzigartige, sichere und effiziente Methode für perkutane intrathymische Injektionen bei Mäusen vorgestellt, wodurch die Abhängigkeit vom Schienensystem für Injektionen entfällt. Die Technik beruht auf der Verwendung einer hochauflösenden Mikroultraschalleinheit, um den Mausthymus nichtinvasiv abzubilden. Mittels Freihandtechnik kann ein Radiologe unter sonographischer Anleitung eine Nadelspitze direkt in den Mausthymus einführen. Mäuse werden vor der Bildgebung gereinigt und betäubt. Für einen erfahrenen Radiologen, der sich mit ultraschallgeführten Verfahren auskennt, ist die Lernzeit für die angegebene Technik recht kurz, typischerweise innerhalb einer Sitzung. Die Methode hat eine niedrige Morbiditäts- und Mortalitätsrate für die Mäuse und ist viel schneller als aktuelle mechanisch unterstützte Techniken zur perkutanen Injektion. Es ermöglicht dem Forscher, präzise und zuverlässige perkutane Injektionen von Thymus jeder Größe (einschließlich sehr kleiner Organe wie dem Thymus von gealterten oder immundefizienten Mäusen) mit minimaler Belastung für das Tier effizient durchzuführen. Diese Methode ermöglicht auf Wunsch die Injektion einzelner Lappen und erleichtert aufgrund der Zeitersparnis des Verfahrens groß angelegte Experimente.

Einleitung

Der Thymus spielt eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung und Immunität von T-Zellen. T-Zell-Mangel, der unter anderem durch Thymusinvolution, genetische Störungen, Infektionen und Krebsbehandlungen verursacht werden kann, führt zu hoher Mortalität und Morbidität ^1,2. Mausmodelle sind sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der translationalen Immunologieforschung unverzichtbar und werden seit Jahrzehnten zur Untersuchung der Thymusbiologie und T-Zell-Entwicklung sowie zur Entwicklung von Therapien für Menschen mit Thymusdysfunktion und ^{T-Zell-Mangel eingesetzt 3,4,5}.

Ein zentraler Bestandteil der Thymusuntersuchungen war die intrathymische Injektion von biologischem Material wie Zellen, Genen oder Proteinen in Mausmodellen 6,7,8,9,10,11,12. Konventionelle intrathymische Injektionsmethoden verwenden Thorakotomie, gefolgt von intrathymischer Injektion unter direkter Visualisierung oder durch "blinde" perkutane Injektion in das Mediastinum. Der chirurgische Ansatz erhöht unter anderem das Pneumothorax-Risiko signifikant. Darüber hinaus führt der erhöhte Stress während dieser Operation zu einer Immunsuppression, wodurch möglicherweise immunologische Daten beeinträchtigt^{werden 13}. Erfahrene Forscher können nach einiger Übung die Blindinjektionstechnik durchführen, aber dieser Ansatz ist weniger genau und beschränkt daher Versuchspersonen auf junge Mäuse mit einem großen Thymus.

Die Verwendung der Ultraschallführung wurde als präzise und minimalinvasive Alternative zu herkömmlichen intrathymischen Injektionsansätzen eingeführt¹⁴. Dieses Verfahren ist jedoch sehr zeitaufwendig, wenn anstelle der Freihandtechnik das integrierte Schienensystem verwendet wird. Die Durchführung von Injektionen mit der Injektionshalterung erfordert eine sorgfältige Optimierung der Bildgebung und Positionierung des Wandlers mit Hilfe der verschiedenen Befestigungen wie dem Wandlerständer und der Halterung, dem X-, Y- und Z-Positioniersystem sowie eine kompetente Bedienung der Mikromanipulationssteuerungen und Schienensystemerweiterungen. Eine einfache alternative Technik, die ultraschallgesteuerte Thymusinjektion, wird hier von einem Radiologen unter Verwendung eines Freihandansatzes¹⁵ vorgestellt, der sowohl eine schnelle als auch genaue minimalinvasive Alternative zu den oben beschriebenen Methoden darstellt. Wichtig ist, dass der aktuelle Ansatz mit jedem hochauflösenden Ultraschall-Bildgebungssystem durchgeführt werden kann, ohne dass eine Injektionshalterung und ein integriertes Schienensystem erforderlich sind. Es ist besonders nützlich für Studien, die die Injektion einer großen Anzahl von Mäusen^{erfordern 11}, für Experimente, bei denen beide Thymuslappen injiziert werden, oder für die genaue Injektion kleiner Thymusen in ältere, bestrahlte oder immungeschwächte Mäuse¹².

Protokoll

Alle Eingriffe wurden in Übereinstimmung mit den Tierpflegerichtlinien des Center for Discovery and Innovation (IACUC-Protokoll 290) durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden C57BL/6-Mäuse (weiblich, 4-6 Wochen alt), C57BL/6-Mäuse (weiblich, 6 Monate alt), J:NU-Weibchen, NOD scid gamma (NSG) weibliche Mäuse und B6; CAG-luc, -GFP-Mäuse wurden als junges Mausmodell, gealtertes Mausmodell, athymisches Nacktmodell, immundefizientes Modell und Biolumineszenzzellquelle verwendet. Die Mäuse wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle). Dieses Verfahren erfordert typischerweise zwei Personen (eine, um während der Durchführung der Injektionen steril zu bleiben, und eine andere, um die Mäuse zu behandeln).

1. Tierische Zubereitung

1. Induktion der Anästhesie bei den Mäusen mit 3% -4% Isoflurangas und Aufrechterhaltung der Anästhesie mit 1% -3% Isoflurangas, das über einen Nasenkegel und einen präzisionskalibrierten Vaporizer verabreicht wird (siehe Materialtabelle).
2. Bestätigen Sie die entsprechende Betäubungstiefe / Bewusstlosigkeit durch Nichtansprechbarkeit auf die Hinterpfotenklemme.
3. Entfernen Sie das Fell aus dem vorderen Brustbereich der Mäuse, indem Sie eine dünne Schicht Enthaarungscreme für weniger als 1 Minute auftragen. Verwenden Sie ein nasses Papiertuch, um die Creme zusammen mit dem losen Fell vollständig zu entfernen.
   HINWEIS: Das Auftragen von zu viel Creme führt dazu, dass sich die Haut im Brustbereich entzündet.
4. Legen Sie jeweils eine Maus, Rückenlage, mit dem Nasenkegel auf die beheizte Plattform der Ultraschall-Bildgebungsstation für Kleintiere (siehe Materialtabelle) (Abbildung 1).
5. Befestigen Sie die Maus mit medizinischem Klebeband an Hinter- und Vorderbeinen auf der Bühne (Abbildung 1).
6. Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
7. Desinfizieren Sie die fellfreie obere Thoraxhaut mit einem Chlorhexidingluconat-Applikator (siehe Materialtabelle).

2. Vorbereitung des Ultraschallgeräts und des Sterilfeldes

1. Aktivieren Sie die höchste verfügbare lineare Sonde, typischerweise die Sonde mit der höchsten räumlichen Auflösung für die Größe des abgebildeten Tieres. Aktivieren Sie die Sonde, indem Sie nach dem Startbildschirm auf die entsprechende Schaltfläche tippen.
   HINWEIS: Für diese Anwendung mit Mäusen ist die verwendete Sonde speziell für die Verwendung mit Mäusen und kleinen Ratten konzipiert (siehe Materialtabelle).
2. Optimieren Sie die Ultraschalleinstellungen für Bildgebung und Injektion, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Stellen Sie die Tiefe des Sichtfelds auf eine für das Zieltier geeignete Größe ein, indem Sie die vertikal ausgerichteten Schieberegler auf der rechten Seite des Bildschirms anpassen (Abbildung 2). Die maximale Tiefeneinstellung beträgt typischerweise etwa 6-8 mm für junge Mäuse.
   2. Passen Sie die Graustufenverstärkung an, indem Sie die Taste entlang des horizontalen Balkens am unteren Bildschirmrand schieben (Abbildung 2). Ziel ist es, mit einem Bild zu beginnen, das nur geringfügig dunkler ist als ein typisches "graues" Aussehen.
   3. Stellen Sie die Fokuszone (blauer Pfeil rechts auf dem Bildschirm, Abbildung 2) auf das erwartete Niveau des Thymus ein. Für junge Mäuse wird dies etwa eine Tiefe von 4 mm sein.
   4. Wenn eine Bildaufnahme gewünscht wird, testen Sie die Funktionalität der Schaltflächen Bild speichern und Clip speichern, um sicherzustellen, dass die Bilder während des gesamten Vorgangs ordnungsgemäß gespeichert werden können. Tippen Sie dazu unten rechts auf dem Bildschirm auf die Schaltfläche Save Clip (Clip speichern) oder auf die Schaltfläche Freeze (Stand) und dann auf Save Image (Bild speichern) (Abbildung 2).
3. Tragen Sie eine kleine Menge (~ 1 ml) Ultraschallgel auf die Oberfläche des Schallkopfes auf (siehe Materialtabelle), während es aufrecht ist, entweder im Halter des Ultraschallgeräts oder in den Händen eines Assistenten.
4. Bereiten Sie ein kleines steriles Feld neben der beheizten Plattform vor. Die optimale Positionierung hierfür liegt in der Regel zwischen der Plattform und dem Ultraschallgerät.
   1. Entleeren Sie diese Gegenstände auf das sterile Feld: eine sterile Sondenabdeckung, Gummiband, sterile Handschuhe und steriles Ultraschallgel (siehe Materialtabelle).
   2. Wenn das sterile Feld eingerichtet und die Gegenstände an Ort und Stelle sind, ziehen Sie die sterilen Handschuhe an.
   3. Legen Sie die sterile Sondenabdeckung vorsichtig über den Ultraschallwandler (sowie über das Gel, das ursprünglich auf die Sonde gelegt wurde). Bewahren Sie die Sterilität und berühren Sie nur die sterile Abdeckung, sonst nichts. Schieben Sie das sterile Gummiband über die sterile Sondenabdeckung, um es an Ort und Stelle zu halten.
      HINWEIS: Die Luftherde können unabhängig von ihrer Größe die Ultraschallbildgebung beeinträchtigen. Daher ist es wichtig, das Ultraschallgel zwischen dem Schallkopf und der sterilen Sondenabdeckung und oben auf die Sondenabdeckung aufzutragen, um eine luftfreie Schnittstelle zwischen der Ultraschallsonde und dem Tier zu gewährleisten.
   4. Geben Sie eine moderate Menge (2-3 ml) steriles Ultraschallgel auf den Schallkopf.
      HINWEIS: Der Benutzer ist jetzt bereit, eine betäubte Maus abzubilden.

3. Bildgebung und Lokalisierung des Thymus

1. Unter Beibehaltung der Sterilität platzieren Sie die Ultraschallgelsonde vertikal auf den desinfizierten Teil der vorderen Brustwand der Maus für die erste Bildgebung.
   1. Nehmen Sie sich einen Moment Zeit, um sich das Ultraschallbild anzusehen und es weiter zu optimieren. Gehen Sie zurück zu Schritt 2.2, und passen Sie es an, um ein ähnliches Erscheinungsbild wie in Abbildung 3 zu erhalten.
2. Scannen Sie die vordere Brust der Maus in einer Querebene. Führen Sie dies aus, indem Sie den Schallkopf vertikal halten und ihn in einer pinselartigen oder "schwungvollen" Bewegung vom Hals zum Bauch auf und ab bewegen.
   HINWEIS: Das Herz wird aufgrund seiner schnellen Bewegung und seines "kammerförmigen" Aussehens die bekannteste Struktur in der Brust sein. Sobald das Herz lokalisiert ist, kann dies als Referenzpunkt verwendet werden, um ein Bild des Thymus zu erhalten.
3. Wenn das Herz im Sichtfeld zentriert ist, streichen Sie den Schallkopf leicht in Richtung Hals. Gerade dem Herzen überlegen, wird normalerweise der Thymus angetroffen.
4. Visualisieren Sie den Thymus als eine zweilappige, pyramidale, reflexionsarme ("dunkel" oder "schwarz" erscheint auf dem Bildschirm) Struktur, die in der Mittellinie, vor der Aorta und hinter dem Brustbein zentriert ist (Abbildung 3A).
5. Notieren Sie sich die beiden runden gepaarten schwarzen (dh "reflexionsarmen") Strukturen auf beiden Seiten der oberen Brust.
   HINWEIS: Dies sind die bilateralen Venae cavae. Die Aorta ist eine ähnliche krummlinige echoarme Struktur in der Mittellinie zwischen den beiden Venae cavae. Diese sind leicht an ihrer pulsierenden Bewegung zu erkennen.

4. Injektion des Thymus

1. Tragen Sie bei Bedarf mehr (2-3 ml) steriles Ultraschallgel auf den Schallkopf auf.
   HINWEIS: Eine relativ große Menge sterilen Gels auf dem Schallkopf (im Vergleich zur Größe des Mausthorax) wirkt als "Gelpad" um die Brustwand der Maus. Dies reduziert die Anzahl der Ultraschallartefakte, die durch Luft innerhalb des Sichtfeldes erzeugt werden.
2. Lokalisieren Sie mit der Ultraschallsonde den breitesten Teil des Thymus, der normalerweise die ideale Zielstelle für die Injektion ist. Antizipieren Sie eine horizontale Nadelbahn an der gewählten Position.
   1. Beachten Sie, wo sich die wichtigsten Blutgefäße (SVCs und Aorta) an dieser Stelle befinden. Vermeiden Sie diese während der Injektion.
   2. Die Blutgefäße sind echoarme, pulsatile Strukturen, wie in Schritt 3.7 beschrieben. Wenn Sie sich nicht sicher sind, verwenden Sie den Farbdopplermodus, um den Durchfluss innerhalb der Behälter zu überprüfen (Abbildung 4A). Aktivieren Sie den Farbdoppler-Modus, indem Sie auf die Schaltfläche Farbe auf dem Bildschirm tippen.
   3. Wenn erwartet wird, dass eines der Hauptblutgefäße (oder das Herz) entlang der erwarteten Nadelbahn liegt, wählen Sie einen neuen Zielbereich oder suchen Sie einen anderen Ansatz / eine andere Flugbahn.
3. Halten Sie den Schallkopf in der einen Hand und eine 30 g Insulinnadel (siehe Materialtabelle) mit 10 μL Injektion in der anderen.
   HINWEIS: Das Injektat variiert je nach Versuchsdesign. Die vorliegende Studie verwendete phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Trypanblau oder D-Luciferin (0,1 μg/10 μL).
4. Um den Injektionsvorgang zu beginnen, bewegen Sie den Schallkopf seitlich, so dass der Thymus im Ultraschallsichtfeld nicht mittig ist. Stellen Sie sicher, dass die andere Seite des Sichtfeldes hauptsächlich aus Ultraschallgel besteht und sonst nichts.
5. Legen Sie die Nadelspitze in das Gel unter dem Schallkopf und bewegen Sie die Nadel langsam, bis sie neben der Hautoberfläche sichtbar ist (Abbildung 4B).
6. Während Sie die Nadel kontinuierlich unter Ultraschall abbilden, führen Sie die Nadel mit einer perkutanen Flugbahn in die Thymusdrüse ein, weg von Blutgefäßen.
   1. Verwenden Sie eine horizontale Flugbahn "Kreuzthymus", um die Nadelspitze im Thymuslappen kontralateral zur Eintrittsstelle zu platzieren. Dies erklärt potenzielle Leckagen entlang des Nadeltrakts (Abbildung 5A).
7. Sobald sich die Nadelspitze im gewünschten Teil des Thymus befindet, injizieren Sie schnell den Inhalt (z. B. 10 μL Trypanblau oder D-Luciferin, 0,1 μg / 10 μL) aus der 30-G-Spritze, während Sie die sonographische Visualisierung verwenden.
   1. Um die Spritze während des Nadeleinführens und der Injektion zu stabilisieren, halten Sie die Spritze zwischen Daumen und dritten Finger und steuern Sie den Spritzenkolben mit dem Zeigefinger.
8. Entfernen Sie die Nadel, nachdem der gesamte Inhalt abgelegt wurde.

5. Überwachung der Tiere nach der Injektion

1. Bringen Sie das Tier in einen leeren Käfig und beobachten Sie, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten.
   HINWEIS: Es wird erwartet, dass eine vollständige Erholung von der Anästhesie innerhalb von 2 Minuten eintritt.
2. Überwachen Sie das Tier für weitere 10 Minuten auf Anzeichen von Stress, Atemnot oder Blutungen.
   HINWEIS: Schmerzen nach der Injektion werden nicht erwartet, und es besteht in der Regel keine Notwendigkeit für eine Analgesie nach der Injektion.
3. Nach vollständiger Genesung und nach einer ereignislosen Beobachtungszeit nach der Injektion wird das injizierte Tier in Begleitung anderer Tiere zurückgegeben.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Implementierung dieser Technik hängt von einigen wichtigen Schritten ab, die befolgt werden müssen. Zunächst muss eine zuverlässige Identifizierung der Thymusdrüse selbst sichergestellt werden. Bei jungen Mäusen ist dies aufgrund der Größe der Drüse einfach (Abbildung 3A). Bei älteren Mäusen oder immundefizienten Mäusen kann es schwieriger sein; mit modernen Ultraschallgeräten ist es jedoch immer noch sehr gut machbar (Abbildung 3B,C).

Diskussion

Eine ultraschallgeführte Freihandinjektion ist eine hochgenaue Technik, um Studienmaterialien effizient und aseptisch an den Thymus zu liefern. Nach der ersten Sterilisation der Haut an der Injektionsstelle bleibt die Sterilität während des Verfahrens durch die Verwendung von sterilen Handschuhen, sterilen Ultraschallsondenabdeckungen und sterilem Ultraschallgel erhalten. Im Gegensatz zum blinden perkutanen Ansatz 10,17 oder dem Einsatz chirurgischer Schnitte zur direkten Visualisierung des Thymus^18,19<...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aquasonic 100 Ultraschall-Gel	Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)	01-01	Steriles Ultraschall-Übertragungsgel
B6; CAG-luc, -GFP Maus	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	025854	Biolumineszenz-Zellquelle
BD Insulinspritzen mit Nadel	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)	328431	Ultrafeine Nadel - 12,7 mm, 30 G
C57BL/6 Maus - gealtert	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	Alter 6 Monate; gealtertes Modell
C57BL/6 Maus - jung	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	Alter 4-6 Wochen; junges Modell
Chloraprep One-step 0,67 mL	CareFusion (El Paso, TX, USA)	260449	Chlorhexidingluconat-Applikator
Curity Applikator mit Wattespitze	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	A5000-2	Steril, 6"
D-Luciferin	Gold Biotechnology (St. Louis, MO, USA)	LUCK-1G
Isofluran	Henry Schein (Melville, NY, USA)	1182097
IVIS Lumina X5	PerkinElmer (Melville, NY, USA)	n/a	In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebungssystem
J:NU Maus	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	007850	Athymisches Aktmodell
Kendall Hypoallergenes Papierband	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	1914C
Kimtech Chirurgische Nitrilhandschuhe	Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)	56892	Sterile Handschuhe
Nair Haarentferner Lotion	Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)	n/a	Enthaarungsmittel
NOD scid gamma (NSG) Maus	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	005557	Immundefizientes Modell
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1x	Corning (Corning, NY, USA)	21-040-
Puralube Vet Salbe	Med Vet International	PH-PURALUBE-VET	Augensalbenscheiden
	Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)	10040	Sterile Ultraschallsondenabdeckungen
Sure-Seal Induktionskammer	Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)	EZ-17 85	Anästhesie-Induktionskammer-Schallkopf
MX550D	FUJIFILM VisualSonics ( Toronto, ON, Kanada)	n/a	Vevo 3100 Bildgebungssonde (25-55 MHz, Zentrumsübertragung: 40 MHz)
Trypanblau, 0,4%ige Lösung in PBS	MP Biomedicals (Solon, OH, USA)	91691049
Vevo 3100	Bildgebungssystem FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Kanada)	n/a	Ultraschall-Bildgebungssystem
Vevo 3100 Lab Software	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Kanada)	n/a	Version 3.2.7 für Bildgebung und Analyse
Vevo Compact Dual-Anästhesiesystem	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Kanada)	n/a	Tisch-Anästhesiegerät auf Isofluranbasis
Vevo Imaging Station	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Kanada)	n/a	Verfahrensplattform