Methodenartikel

Fluoreszenzlebensdauer-Makro-Imager für biomedizinische Anwendungen

DOI:

10.3791/64321

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7. April 2023

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1School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork, 2Cancer Research@UCC, University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA), The University of Western Australia, 4Physics Department, Brookhaven National Laboratory

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines neuen, schnellen optischen Bildgebungsgeräts für die makroskopische Photolumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von Proben mit langem Zerfall. Die Integrations-, Bildaufnahme- und Analyseverfahren werden ebenso beschrieben wie die Präparation und Charakterisierung der Sensormaterialien für die Bildgebung und die Anwendung des Imagers bei der Untersuchung biologischer Proben.

Zusammenfassung

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In diesem Artikel wird ein neuer Photolumineszenz-Lifetime-Imager vorgestellt, der entwickelt wurde, um die molekulare Sauerstoffkonzentration (O2) in verschiedenen phosphoreszierenden Proben abzubilden, die vonO2-empfindlichen Festkörperbeschichtungen bis hin zu lebenden tierischen Gewebeproben, die mit löslichenO2-empfindlichen Sonden gefärbt wurden, reichen. Insbesondere wurde die nanopartikelbasierte Nahinfrarotsonde NanO2-IR verwendet, die mit einer 625 nm Leuchtdiode (LED) anregbar ist und bei 760 nm emittiert. Das Bildgebungssystem basiert auf der Timepix3-Kamera (Tpx3Cam) und dem opto-mechanischen Adapter, der auch einen Bildverstärker beherbergt. Die Phosphoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (PLIM) wird häufig für verschiedene Studien benötigt, aber die aktuellen Plattformen haben Einschränkungen in ihrer Genauigkeit, allgemeinen Flexibilität und Benutzerfreundlichkeit.

Bei dem hier vorgestellten System handelt es sich um einen schnellen und hochempfindlichen Imager, der auf einem integrierten optischen Sensor und einem Auslesechip-Modul, Tpx3Cam, aufgebaut ist. Es wird gezeigt, dass es hochintensive Phosphoreszenzsignale und stabile Lebensdauerwerte aus oberflächengefärbten Darmgewebeproben oder intraluminal gefärbten Fragmenten des Dickdarms erzeugt und die detaillierte Kartierung desO2-Spiegels im Gewebe in etwa 20 s oder weniger ermöglicht. Erste Experimente zur Bildgebung von Hypoxie in transplantierten Tumoren bei bewusstlosen Tieren werden ebenfalls vorgestellt. Wir beschreiben auch, wie der Imager für die Verwendungmit O2-empfindlichen Materialien auf Basis von Pt-Porphyrin-Farbstoffen neu konfiguriert werden kann, wobei eine 390-nm-LED für die Anregung und ein 650-nm-Bandpassfilter für die Emission verwendet werden. Insgesamt konnte festgestellt werden, dass der PLIM-Imager genaue quantitative Messungen der Lebensdauerwerte für die verwendeten Sonden und entsprechende zweidimensionale Karten derO2-Konzentration liefert. Es ist auch nützlich für die metabolische Bildgebung von Ex-vivo-Gewebemodellen und lebenden Tieren.

Einleitung

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O2 ist einer der wichtigsten Umweltparameter für lebende Systeme, und die Kenntnis der Verteilung vonO2 und seiner Dynamik ist für viele biologische Studien wichtig 1,2,3. Die Bestimmung der Sauerstoffversorgung des Gewebes mit Hilfe der phosphoreszierenden Sonden 4,5,6,7,8 und PLIM 9,10,11,12,13 erfreut sich in der biologischen und medizinischen Forschung zunehmender Beliebtheit

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Protokoll

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Alle Verfahren mit Tieren wurden im Rahmen von Zulassungen der Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irland) gemäß der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften (2010/63/EU) durchgeführt und von der Ethikkommission für Tierversuche des University College Cork genehmigt.

1. Probenvorbereitung

  1. Färbung mit der Sonde von lebenden Gewebeproben ex vivo
    1. Für Ex-vivo-Anwendungen werden frisch isolierte Gewebeproben von 4 Wochen alten weiblichen Balb/c-Mäusen verwendet.
    2. Am Tag des Experiments wird eine Maus durch Enthauptung eingeschläfert und etwa 10 mm große Fragmente d....

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Ergebnisse

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Für Ex-vivo-Bildgebungsanwendungen wurden Fragmente von Darmgewebe durch die topische Anwendung der NanO2-IR-Sonde auf der serosalen Seite des Gewebes gefärbt. Für eine tiefere Färbung wurde 1 μL der Sonde in das Lumen injiziert. In letzterem Fall schirmte die 0,2-0,25 mm dicke Darmwand die Sonde von der Kamera ab. Die beiden Färbeverfahren sind in Abbildung 2A dargestellt.

Die resultierenden Intensitäts- und PLIM-Bilder sind in

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Diskussion

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Die obigen Protokolle geben eine detaillierte Beschreibung des Zusammenbaus des neuen Imagers und seines Betriebs im Mikrosekunden-FLIM/PLIM-Modus. Die TCSPC-basierte Tpx3Cam-Kamera der neuen Generation, die über den opto-mechanischen Adapter Cricket mit dem Bildverstärker, dem Emissionsfilter und dem Makroobjektiv gekoppelt ist, ergibt ein stabiles, kompaktes und flexibles optisches Modul, das einfach zu bedienen ist. Es wurde gezeigt, dass der Imager bei einer Reihe verschiedener Proben und analytischer Aufgaben gut fu.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

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Die finanzielle Unterstützung für diese Arbeit durch die Science Foundation Ireland, die Zuschüsse SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 und 18/SP/3522 sowie Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) wird dankbar gewürdigt.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
627 nm LEDParts ExpressKann je nach Anregungswellenlänge des Sensors durch eine andere LED ersetzt werden. Verwendete 390 nm LED für Pt-Porphyrin-Farbstoffe.
760 ± 50 nm EmissionsfilterEdmund Optics84-788Kann je nach Emissionswellenlänge des Sensors durch einen anderen Filter ersetzt werden. Gebraucht 650 ± 50 nm Bandpassfilter für Pt-Porphyrin-Farbstoffe.
Balb/c MäuseEnvigo, UKBalb/c
Black BoxThorlabsXE25C9/M
Cricket AdapterPhotonisCricket-2
CT26 Zellen  ATCCCT26. WThttps://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEMSigma-AldrichD0697Andere Medien können ebenfalls verwendet
werden ImageJ SoftwareImageJKostenlose Bildanalysesoftware. Kann heruntergeladen werden unter: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 Bildverstärker mit P47 PhosphorschirmPhotonisPP0360EF
MinischüsselnSarstedt83.3900.30035 mm Durchmesser
Mylar-Kunststofffolie, 75 Mikron RS Irland785-0795ODie Kunststoffsubstrate können auch verwendet werden
NanO2-IRhausgemachtn/aDie Sonde kann nach der veröffentlichten Methode 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In-vivo-Bildgebung der Stoffwechselaktivität des Gehirns mit einer phosphoreszierenden, sauerstoffempfindlichen Sonde. J Neurosci-Methoden. 2013 Jun 15; 216(2):146-51. DOI: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178." oder von unserem Labor zur Verfügung gestellt. 
NMV-50M11" 50 mm ObjektivNavitarAndere Objektive, die mit C-Mount Adatoren kompatibel sind, können verwendet werden
Optisches SteckbrettThorlabsMB1836
PetrischalenSarstedt82.1472.00192 mm Durchmesser
NetzteilTenma72-10495
ImpulsgeberTenmaTGP110
SophyAmsterdam Scientific Instrumentsn/zZur Verfügung gestellt von ASI zusammen mit dem Tpx3Cam
Tpx3CamAmsterdam Scientific InstrumentsTPXCAM
Tri2 SoftwareUniversity of Oxfordn/aFree Time Resolved Imaging Software, kann heruntergeladen werden von: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation StageThorlabsLT3

Referenzen

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  1. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
  2. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C.

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Schlagwörter

Fluoreszenzlebensdauer BildgebungPhosphoreszenzlebensdauer BildgebungSauerstoff MappingTimepix3 KameraTCSPC ModusBildgebung von TiergewebeNanopartikel SauerstoffsondenBildverst rkerHypoxie BildgebungPlatin Porphyrin Farbstoff

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