Summary
在这里，开发了一种纳米巴支持的脂质双层系统，以提供具有定义曲率的合成膜，从而能够在 体外表征具有曲率传感能力的蛋白质。
Abstract
膜曲率在细胞的各种基本过程中起着重要作用，例如细胞迁移、细胞分裂和囊泡运输。它不仅由细胞活动被动产生，而且还主动调节蛋白质相互作用并参与许多细胞内信号传导。因此，研究膜曲率在调节蛋白质和脂质的分布和动力学中的作用具有重要价值。最近，已经开发了许多技术来研究体 外弯曲膜和蛋白质之间的关系。与传统技术相比，新开发的纳米巴支持的脂质双层（SLB）通过在具有预定义膜曲率和局部平坦控制的纳米条图案阵列上形成连续的脂质双层，在膜曲率生成方面提供了高通量和更高的精度。脂质流动性和蛋白质对弯曲膜的敏感性都可以使用荧光显微镜成像进行定量表征。本文介绍了如何在含有纳米棒阵列的人造玻璃表面上形成SLB的详细程序，以及如何在这种SLB上表征曲率敏感蛋白。此外，还涵盖了纳米芯片重用和图像处理的协议。除了纳米巴-SLB，该协议还适用于用于曲率传感研究的所有类型的纳米结构玻璃芯片。
Introduction
膜曲率是细胞的关键物理参数，发生在各种细胞过程中，例如形态发生、细胞分裂和细胞迁移1.现在人们普遍认为，膜曲率不仅仅是细胞事件的简单结果;相反，它已成为蛋白质相互作用和细胞内信号传导的有效调节剂。例如，发现参与网格蛋白介导的内吞作用的几种蛋白质优先与弯曲膜结合，导致内吞作用2的热点形成。膜变形有许多不同的原因，例如细胞骨架力拉动膜，存在不同大小头基的脂质不对称性，存在锥形跨膜蛋白，膜成形蛋白如BAR结构域蛋白（以Bin，两栖蛋白和Rvs蛋白命名）的积累，以及两亲性螺旋结构域插入膜1.有趣的是，这些蛋白质和脂质不仅使膜变形，而且还可以感知膜曲率并表现出优先积累1。因此，研究具有不同曲率的膜是否以及如何改变附着在其上的蛋白质和脂质的分布和动力学以及对相关细胞内过程的潜在影响至关重要。
已经开发了许多技术来分析活细胞和体外系统中弯曲膜和蛋白质之间的相互作用。活细胞系统提供了一个真实的细胞环境，具有丰富的脂质多样性和动态蛋白质信号传导调节2，3，4，5，6，7。然而，由于细胞内环境的不确定性和波动性，这种复杂的系统很难研究。因此，使用由已知脂质种类和纯化蛋白质组成的人造膜的体外测定已成为表征蛋白质和弯曲膜之间关系的强大重构系统。传统上，通过挤出产生不同直径的脂质体，以通过使用离心力的共沉降测定或具有密度梯度的共浮选测定来检测曲率敏感的蛋白质，以避免蛋白质聚集8，9。然而，挤出脂质体的曲率受到挤出机10中使用的膜过滤器的可用孔径的限制。单脂质体曲率（SLiC）测定已被证明可以克服这一限制，其中不同直径的脂质体被荧光标记并固定在表面上，以便曲率可以用荧光强度11标记。然而，在小囊泡中观察到脂质组成的强烈变化，这影响了曲率测量的准确性12。系绳拉动实验使用光学镊子更准确地测量从巨型单层囊泡 （GUV） 拉出的瞬态系绳上的曲率，其中曲率可以通过产生的膜张力很好地控制13，14。该方法适用于研究正曲率或负曲率传感蛋白，但受到管生成10的通量的限制。支持的膜管 （SMrT） 测定可同时生成多个膜管，这些膜管通过微流体流从同一脂质储层挤出。然而，膜曲率沿纳米管固有地变化，这损害了基于荧光强度的曲率测量的准确性15，16。相比之下，使用小的单层囊泡（SUV，直径<100nm17）在含有设计形貌的表面上形成支持的脂质双层（SLB），产生单个双层膜，其曲率由纳米制造或纳米材料预先确定，精度为18，19，20。
在这里，我们提出了一种在具有纳米棒阵列的制造纳米芯片表面上形成SLB的协议，以及如何使用它来探测 体外蛋白质的曲率敏感性。如图 1所示，该测定有六个基本组成部分：A）用微流体室清洁和组装芯片;B）制备具有确定脂质组成的SUV;C）在纳米芯片上形成SLB并与曲率敏感蛋白结合;D）在荧光显微镜下对SLB和曲率敏感蛋白进行成像和表征;e） 清洁芯片以便重复使用;F）用于定量分析蛋白质曲率传感能力的图像处理。下面将逐步介绍详细的协议。
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Protocol
1. 纳米芯片的清洗
- 将纳米芯片放入 10 mL 烧杯中，图案面朝上。
注意：该石英纳米芯片已通过电子束光刻 技术制造 ，如前所述 21.芯片上纳米结构的几何形状和排列可以定制设计。这里使用的梯度纳米棒的尺寸为长度为2000 nm，高度为600 nm，宽度为100至1000 nm（步长为100 nm）。 - 小心地向烧杯中加入 1 mL 98% 硫酸，并确保酸完全覆盖芯片的正面和背面。
注意：98%的硫酸具有极强的腐蚀性，与皮肤或眼睛接触时会导致快速的组织破坏和严重的化学灼伤。在通风橱中使用它，并提供适当的保护。 - 缓慢旋转烧杯，逐滴加入 200 μL 30% 过氧化氢，直到整个烧杯变热。确保硫酸和过氧化氢充分混合以形成食人鱼溶液，用于从纳米芯片17中去除有机分子。有替代技术可以在干净的亲水表面上产生SLB，例如前面描述的紫外线和臭氧暴露23。
注意：反应非常放热，会导致溶液沸腾，因此将过氧化氢一滴一滴地添加到硫酸中并保持旋转。 - 将烧杯放入二次玻璃容器中，并将纳米芯片浸入食人鱼溶液中过夜，以彻底清洁杂质。
注意：将烧杯放在通风橱中，没有任何盖子，以防反应产生气体。 - 取出烧杯，小心地将食人鱼溶液移入酸性废物容器中。
- 将 5 mL 去离子水装入烧杯中以稀释残留的酸并将其丢弃到酸性废物中。重复此步骤五次，并使用5 M NaOH中和酸废物。
- 用镊子抓住芯片，用连续的去离子水流清洗，彻底去除残留的酸。用 99.9% 的氮气吹干芯片以形成SLB 22。
2. 产生小的单层囊泡 （SUV）
- 将 100 μL 氯仿加入琥珀色小瓶中。
注意：氯仿是一种高度挥发的无色液体，吸入或吞咽可能有毒。戴上口罩和手套在通风橱中使用它。 - 将500μg脂质混合物溶解在氯仿中。这里使用的脂质混合物的组成是89.5摩尔%的鸡蛋磷脂酰胆碱（PC），10摩尔%的脑磷脂酰丝氨酸（PS）和0.5摩尔%的德克萨斯红1，2-二十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，三乙基铵盐（德克萨斯红DHPE）。
- 用99.9%氮气吹干小瓶中的脂质混合物，直到氯仿挥发并且脂质混合物干燥。
注意：此步骤应在通风橱中执行。吹干时避免液体飞溅。 - 将没有盖子的琥珀色小瓶中存在的脂质混合物放入铝箔覆盖的真空干燥器中。然后用泵真空干燥样品3小时，使氯仿完全挥发。
- 向小瓶中加入 250 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 缓冲液。涡旋溶液直至均匀。
注意：PBS缓冲液由150 mM NaCl组成，不含钙，镁和酚红;将pH调节至7.2，使PC和PS脂质双层。 - 在浴超声仪中以50kHz的频率超声处理脂质混合物30分钟。然后将脂质混合物转移到 1.5 mL 离心管中并用封口膜密封。
- 将脂质混合物在液氮中冷冻20秒，然后在42°C下在水浴中解冻2分钟。重复冻融循环30次。之后，脂质混合物看起来像透明液体。
注意：液氮的沸点约为-195.8°C。它可能导致冻伤或低温烧伤。戴上隔热手套在密闭空间内使用。 - 分别用乙醇，氯仿和甲醇冲洗两个玻璃气密注射器和微型挤出机的连接器。重复冲洗顺序五次以预清洁设备。将它们留在通风橱中，直到有机溶剂完全挥发。
- 组装微型挤出机设备并将 500 μL PBS 缓冲液通过连接器以预润湿设备，然后从另一个注射器中丢弃缓冲液。此步骤可去除杂质并促进挤出。
- 将微型挤出机设备与孔径为 100 nm 的聚碳酸酯过滤膜组装。
注意：滤膜的孔径决定了脂质体的直径。 - 用其中一个注射器取 500 μL PBS 缓冲液，轻轻将其推入过滤器以填充另一端的第二个空注射器。来回重复挤出三次以检查设备泄漏并从第二个注射器中丢弃缓冲液。
- 将脂质混合物通过小型挤出机以更换PBS缓冲液。然后来回挤压20次以形成SUV。囊泡的多层特征可能在挤出次数不足的情况下保留，这将影响SLB的形成23。
- 从第二个注射器中收集SUV，以减少较大颗粒的污染，并将其转移到1.5 mL离心管中。
注意：将注射器直接从连接器中取出，以防注射器断裂。 - 用铝箔包裹管以防止荧光标记的脂质漂白，并将其储存在4°C。通常，SUV 最多可以存放 7 天。
3. 在纳米芯片上形成SLB
- 用镊子小心地从去离子水中取出清洁的纳米芯片，并用99.9%的氮气吹干。
- 用空气等离子体处理对纳米芯片进行表面清洁1小时。
- 将纳米芯片组装在聚二甲基硅氧烷（PDMS）室中，该室由两片PDMS-中间PDMS和顶部PDMS组成（图1A）。中间的PDMS很薄（~0.5毫米），中心有一个大的椭圆形开口，以确保充分暴露在纳米棒图案中。顶部PDMS很厚（~4.0毫米），在椭圆形大开口内有两个小孔，作为液体处理的入口和出口。
- 将芯片放在干净的表面上，图案朝上。
- 用芯片轻轻覆盖中间的PDMS，并确保整个图案暴露在中间PDMS中椭圆形大开口的中心区域。
- 用中间的PDMS覆盖顶部的PDMS，并将其两个小孔保留在中间PDMS的大椭圆孔区域内。然后组装PDMS腔室。
注：PDMS是使用最广泛的硅基有机聚合物。它具有生物相容性、透明性和可变形性，可设计为用于芯片组装和显微镜下成像的定制形状。更重要的是，它可以在等离子体处理后共价紧紧地粘附在另一个PDMS层或玻璃上，使其适合作为制备SLB的腔室。此步骤可确保PDMS的每一层都紧密贴合，以避免间隙和泄漏。
- 用移液管将SUV从顶部PDMS上的两个小孔之一装入PDMS室，并在室温下孵育15分钟以形成SLB。
- 从小孔的一侧轻轻地将PBS缓冲液移入PDMS室，然后用棉签从另一个孔中取出废物，以洗掉未绑定的SUV。然后获取在纳米芯片上形成的SLB（通过光漂白后的荧光回收（FRAP）测试SLB的质量，如步骤4.4所示，并在代表性结果部分中讨论）。
注意：将PBS缓冲液移入腔室时，移液器吸头应充满缓冲液并与液体表面接触，以避免注入任何气泡。
4. 对SLB和曲率传感蛋白结合在纳米芯片上的成像
注意：本节将取决于可用于实验的显微镜系统。在这里，将描述有关如何执行成像的总体指南。详细设置可以在不同的显微镜设置之间更改。
- 使用100倍（N.A.1.4）油物镜设置激光扫描共聚焦显微镜。打开ZEN软件，选择可以激发脂质和蛋白质荧光的激发激光功率。选择 采集模式>智能设置>德州红DHPE / EGFP。
- 使用对焦旋钮调整焦点以定位芯片上的纳米棒，直到纳米条边缘在脂质通道下方清晰。
- 在添加蛋白质之前，设置如下扫描参数以获得脂质通道的对照图像：帧大小 = 512 像素 x 512 像素（512 像素 x 512 像素，像素大小为 124 nm）， 每像素位数 = 16（16 位深度）， 扫描速度 = 5， 平均 = 4 （平均模式为四次/行）。
- 通过在随机的单个纳米巴区域漂白荧光标记的脂质双层来进行FRAP测定。
- 选中“ 实验区域 ”和 “漂白” 复选框。绘制一个直径为5μm的圆形区域，该区域的中心可以包括整个纳米棒（纳米棒尺寸为2μm）并添加到 实验区域。输入延时成像参数，如以下示例所示：选择 扫描速度 = 9 和 平均 = 1。选择 时间序列>持续时间 = 100 个周期 和 间隔 = 2 秒。输入漂白参数，如以下示例所示：选中“ 在 # 图像之后开始” 复选框，然后选择 三个 图像。
- 选中执行 FRAP 的激光复选框并将功率更改为 100.0%。单击 FRAP 实验的开始实验 。
注意：FRAP是表征细胞分子迁移率的常用方法。如果SLB具有良好的流动性，则漂白区域的荧光将逐渐恢复，因为漂白荧光团扩散出来，而来自其他区域的未漂白荧光团将扩散进来。
- 将蛋白质溶液加载到PDMS室中并在室温下孵育5分钟，以使蛋白质与SLB结合。
注意：图2G，H中用于证明脂质组成促进蛋白质在纳米条弯曲SLB上的结合的蛋白质为74μM GFP和79μM GFP-His。这两种蛋白质是没有或带有His标签的绿色荧光蛋白质。图4和图5中用于曲率传感研究的蛋白质为16 μM F-BAR、16 μM IDR FBP17和16 μM FBAR+IDRFBP17。这三种蛋白质是FBP17的结构域，FBP17是一种典型的BAR蛋白，直观地假设为曲率发生器和传感器。每个蛋白质体积为 20 μL。 - 重新聚焦纳米棒并重复步骤4.3，拍摄脂质和蛋白质通道的图像，以进行蛋白质曲率传感检测。
- 重复步骤4.4，对脂质和蛋白质通道进行FRAP测定，并进行延时成像以表征曲率传感蛋白的迁移率。
5. 纳米芯片的再利用
- 用镊子抓住纳米芯片，小心地将其从 PDMS 室中分离到装满去离子水的 50 mL 烧杯中。
注意：这是一个关键步骤。防止镊子接触纳米结构，不要强迫芯片分离，以免出现裂纹。 - 用无水乙醇彻底清洗纳米芯片，以去除附着在表面上的有机残留物。
注意：用无水乙醇洗涤之前，请使用干净的薄纸去除表面上的水。
注意：无水乙醇是一种高度挥发且略带危险的化学品。避免接触皮肤和眼睛。戴上口罩和手套在通风橱中使用它。 - 用大量去离子水彻底清洗芯片以去除残留的乙醇。然后用99.9%的氮气吹干芯片。
注意：在继续下一步之前，去除芯片上的所有乙醇痕迹很重要，因为食人鱼酸会与有机溶剂发生剧烈反应并可能导致爆炸。 - 将芯片放入干净的 10 mL 烧杯中，图案面朝上，并用食人鱼溶液清洁芯片以供重复使用，其步骤与“清洁纳米芯片”的步骤相同。
6. 图像量化
- 旋转显微镜获取的图像，使纳米棒阵列处于垂直位置，以便在斐济软件中进行后续分析。
- 使用自定义编写的 MATLAB 代码“c_pillarmask_averaging”通过脂质通道和蛋白质通道中的方形掩模（51 像素 x 51 像素）定位单个纳米棒。
注意：此 MATLAB 代码是专门为纳米芯片设计的。它可以通过链接在GitHub上获得：https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX。 - 通过 MATLAB 代码“BarGra_avg”中的网格函数，用图像角落处的三个 ROI（5 像素 x 5 像素）减去每个图像的背景信号。该操作旨在纠正由显微镜设置或显微镜载物台上的芯片调平引起的潜在不均匀背景噪声。
- 使用 MATLAB 代码“BarGra_avg”生成相同大小的纳米条的平均图像，其中每个点是所有单个纳米巴方形掩码中该点的值的平均值。在斐济软件中生成平均图像的3D表面图，以直观地显示纳米棒周围的平均信号分布。选择 分析>面图> 输入 100 作为 面乘数，然后选择 阴影、绘制轴和 平滑复选框。
- 将每个纳米棒分成三个区域，其中包括两个纳米条端区域和一个纳米条中心区域，以分别通过MATLAB代码“avg_nanobar_quantification”提取其荧光强度。使用“位置”文件根据纳米棒的尺寸调整纳米棒ROI的大小。
- 将蛋白质强度除以从 MATLAB 代码“avg_nanobar_quantification”中提取的脂质强度，以获得不包括表面积效应的纳米条端密度。
- 在GraphPad Prism中绘制不同浓度的纳米条端密度以获得结合曲线。打开 分析 菜单。选择非线性 回归（曲线拟合）>绑定 - 饱和度>与希尔斜率函数的特定绑定 ，以使用希尔方程拟合曲线，然后计算 KD 和希尔系数值。
- 脂质和蛋白质强度在600 nm纳米巴中心使用MATLAB代码“avg_nanobar_quantification”采集到其相应的强度。
- 使用纳米条端面积除以条中心面积处归一化蛋白质强度的最亮九个像素来量化具有相同大小的纳米条的蛋白质曲率传感，该值称为“端心比”。使用归一化蛋白质强度的比率来归一化脂质强度，以量化不同尺寸的纳米棒的蛋白质曲率感应范围，该值称为“归一化纳米巴末端密度”。这些值由 MATLAB 代码“avg_nanobar_quantification”计算得出。
- 在斐济软件中加载 FRAP 堆栈映像。选择 FRAP 区域并生成投资回报率。选择 “更多>多重测量 ”功能以每次测量 FRAP 区域的强度。在 GraphPad Prism 中绘制强度以生成 FRAP 恢复曲线。
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Representative Results
建议使用纳米棒设计来探测正曲率传感蛋白，其两端包含一个半圆，曲率由纳米条宽度定义，中心局部有一个平坦/零曲率控制（图 2A，B）。在纳米棒上成功形成SLB会导致脂质标记信号均匀分布在整个纳米棒表面上，如图 2C所示。来自多个纳米棒的信号可以通过平均单个纳米棒图像来组合（图2D），以便可以最小化不同纳米棒之间的随机变化。早期的电子显微镜研究表明，细胞质膜在整个纳米结构周围形成保形涂层24。因此，合成脂质双层被认为也紧密附着在纳米结构表面上，这在200nm纳米条上产生衍射极限线，如图 4E所示。此外，纳米巴弯曲SLB上的膜流动性也可以通过FRAP测定来表征，其中单个纳米巴上的荧光信号可以单独漂白以进行膜流动性表征（图2E，F）。
在纳米棒上形成SLB需要产生SUV，类似于前面报道的平坦表面上的SLB形成17。SUV的脂质组成决定了纳米条弯曲SLB的表面化学性质，可以改变其用于膜标记和不同的蛋白质结合机制。例如，德克萨斯红DHPE可以在SUV中以~0.5摩尔%添加，以便可以通过荧光显微镜轻松成像纳米棒上膜表面积的富集（图2C）。除了可视化之外，还可以改变脂质组成以促进蛋白质在纳米条弯曲的SLB上的结合。例如，为了促进His标记蛋白的锚定，通过将1，2-二油酰基-sn-甘油-3-[（N-（5-氨基-1-羧基戊基）亚氨基二乙酸）琥珀酰]（镍盐）（18：1 DGS-NTA（Ni））掺入SUV（~1mol%）25，可以将镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）带到纳米棒上的SLB。如果没有脂质上的这个官能团，绿色荧光蛋白（GFP）就不能与带负电荷的PS结合，由于溶液中GFP信号的体积消耗，导致每个纳米条位置出现一个较暗的条形孔（图2G）。相比之下，通过在SLB中添加1摩尔%的18：1 DGS-NTA（Ni），标记的His标签GFP可以牢固地锚定在膜上，以清楚地遵循由纳米棒弯曲的SLB形状（图2H）。脂质扩散在通过FRAP测定探测的蛋白质结合时没有显示出可检测的差异（补充图1）。值得注意的是，FRAP测量仅基于SLB中0.5摩尔%德克萨斯红DHPE的强度，这可能不代表用于结合His标签蛋白的1摩尔%DGS-NTA（Ni）。此外，带电脂质（如PS）可以通过静电相互作用增强蛋白质结合26，而信号脂质如磷脂酰肌醇（4，5）-二磷酸（PIP2）也可以整合到SUV中以促进特异性蛋白质结合（例如FCHo2，PIP2对其膜曲率传感至关重要27）。
SLB在表面均匀性和膜流动性方面的形成质量对于探测纳米棒上的蛋白质曲率传感能力至关重要。有三个典型问题可能会影响SLB的均匀性和流动性。一种是由于低效洗涤导致多余的 SUV 在 SLB 上的结合，这会在纳米棒和纳米棒之间的平板膜上产生点状物（图 3A，B）。它显着影响纳米棒上弯曲或平坦表面上蛋白质结合的定量，以进行曲率传感评估。另一个问题是在洗涤步骤中PDMS腔室内意外引入气泡，这可能会破坏沿气液界面轨迹的SLB，并在纳米棒表面上留下极低脂质信号易于识别的划痕状特征（图3C，D）。此外，清洁不当的纳米巴基底会在表面上留下随机分布的化学残留物，从而阻止脂质吸附以形成SLB。它会导致膜缺陷的产生，这些缺陷可能高于也可能不高于显微镜可视化的光学分辨率（图3E）。然而，膜流动性将受到膜缺陷形成28 的敏感影响，因此FRAP测定可用于验证表面清洁度（图3F，G）。
为了证明使用纳米巴阵列表征曲率传感蛋白，将典型的F-BAR结构域与最近发现的FBP17（IDRFBP17）中固有无序区域进行了比较。F-BAR用Alexa Fluor 488四氟苯酯染料荧光标记，而IDRFBP17 用Alexa Fluor 647 C2马来酰亚胺标记。如图 4A所示，两个蛋白质结构域在SLB包被的单个纳米棒上具有300nm宽度的积累增加。在这里，SLB含有10%的PS，以静电增强蛋白质结合。蛋白质的曲率传感能力可以通过弯曲纳米棒末端的优先富集来识别，荧光强度高于平坦纳米棒中心的信号，这在图像平均超过100纳米巴后更明显地显示（图4B）。曲率传感能力可以通过计算每个纳米棒的端心比（即纳米巴端与纳米巴中心的荧光强度）来定量反映。如图 4C所示，两种蛋白质的端中心比脂质高，约为1。在比较 IDR FBP17 和 F-BAR 时，可以看出 IDRFBP17 的端中心比（1.385 ±0.011，平均± SEM）表明曲率传感比 F-BAR（1.144 ± 0.004，平均± SEM）更强。
为了检查蛋白质可以感应的曲率范围，在梯度宽度为200nm至600nm的纳米条阵列上生成SLB（图4D），其中脂质在不同尺寸的纳米棒上显示出均匀的涂层（图4E）。将三种蛋白质（IDR FBP17、F-BAR和F-BAR+IDRFBP17）在梯度纳米棒阵列上孵育，当曲率减小到直径400 nm以下时，它们均在纳米条末端弯曲膜位点表现出优先积累（图4E，F）。在这三个蛋白质结构域中，IDRFBP17 的纳米巴端密度最高，表明其曲率传感能力最强，而 F-BAR 的弧率传感能力最低（图 4F）。此外，还可以通过逐渐增加蛋白质浓度来绘制曲率传感蛋白的结合曲线（图4G），这表明IDRFBP17具有很强的协同曲率传感能力。当将其结合曲线拟合到希尔方程时，KD在μM范围内（0.6±0.1μM），希尔系数（H）在2和3之间，表明IDRFBP17与纳米巴诱导的膜曲率的超灵敏结合。曲率越尖锐，平衡时的结合能力越高。
曲率传感蛋白在纳米巴形SLB位点周围的动态膜扩散和膜缔合也可以通过FRAP进行研究。与纳米棒上脂质信号的快速恢复（图5A，E）相比，F-BAR无法在2分钟内恢复（图5B，E），这表明其在弯曲膜位点的膜迁移率和缔合动态显着降低。令人惊讶的是，与F-BAR的行为不同，IDR FBP17信号在同一时间范围内表现出明显的恢复（图5C，E），表明IDRFBP17在弯曲膜上积累的动态性质。然而，在洗去溶液中未结合的IDR FBP17后，无法观察到与以前相同的IDRFBP17通道恢复（图5D，E）。这表明回收主要是与含有IDRFBP17分子的溶液交换，而较少由膜结合分子的横向扩散。
总体而言，这些结果表明，这种纳米巴-SLB系统是在 体外表征膜曲率敏感蛋白的有力工具。
图 1：纳米棒-SLB 系统的示意图 。 （A）PDMS室由顶层和中间层组成，上面组装有清洁的纳米芯片。（B）德克萨斯红色DHPE标记的SUV与放大细节。（C）纳米巴-SLB体系的完整模型和放大区域表明，SLB在具有均匀单层脂质双层的纳米棒上形成。（D）激光扫描共聚焦显微镜下的成像和表征过程。（E） 清洁纳米芯片以便进一步重复使用。（F）用于蛋白质曲率传感定量的成像处理。 请点击此处查看此图的大图。
图2：在具有蛋白质结合的纳米棒上形成弯曲的SLB 。 （A）单个纳米棒的SEM图像。（B）纳米巴-SLB系统的示意图。（C）纳米芯片上标有德克萨斯红DHPE的SLB的荧光图像。（D）纳米棒上SLB分布的平均图像（顶部）和平均图像的3D表面图（底部）。此图由Su等人修改，22 经许可转载。（E）纳米棒上SLB FRAP的延时成像。漂白区域由黄色虚线圆圈表示。（F） 通过 FRAP 测量归一化纳米棒强度图。（G）GFP的示意图描述不能与SLB结合，10mol%负电荷PS（左）和右侧的相应代表性图像。（H） 用 1 mol% DGS-NTA（Ni） 结合到SLB的His标签GFP的示意图（左）和右侧的相应代表性图像。比例尺：2 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：影响 SLB 质量的典型问题 。 （A）未有效洗涤的SLB制备示意图。（B）SLB与过剩SUV绑定的代表性图像。黄色箭头表示点，这是SLB表面上多余的SUV。（C）注入气泡的SLB制备示意图。（D）被气液界面轨迹破坏的SLB的代表性图像。黄色箭头表示基板上不完整的SLB。（E）使用未清洁的纳米棒基底制备SLB的示意图。放大区域显示不连续的脂质双层，因为表面残留物阻止了脂质吸附。（F）在未清洁的纳米棒衬底上SLB FRAP分析的延时成像。漂白区域由黄色虚线圆圈表示。（G） 通过 FRAP 测量归一化纳米棒强度图。比例尺：2 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：通过 nanobar-SLB 系统表征蛋白质曲率传感。 （A） F-BAR（左）和 IDRFBP17（右）的荧光图像累积在 SLB 包被的纳米棒（10% PS 和 90% PC）上。比例尺：2μm。 （B）F-BAR（左上）和IDRFBP17（左下）的平均图像累积在纳米棒和相应的3D表面图（分别为右上和右下）。比例尺：2μm。 （C）脂质双层，F-BAR和IDRFBP17荧光强度的端中心比围绕300nm宽度的纳米巴。进行韦尔奇t检验进行统计分析。p < 0.0001。（n = 3）（D）宽度为200 nm至600 nm的梯度纳米棒阵列的SEM图像。比例尺：5μm。 （E）蛋白质构建体的注释（顶部），脂质双层的平均图像，IDR FBP17，F-BAR和F-BAR + IDRFBP17在宽度范围为200nm至600nm的梯度纳米条上（中）和沿每个平均图像的纳米条的强度分布（底部）。比例尺：2 μm。 （F） IDR FBP17、F-BAR 和 F-BAR+IDRFBP17 分别用不同宽度的纳米条量化标准化纳米棒端密度。每个数据显示为SEM±平均值（n≥60）。（G）用希尔方程拟合的IDRFBP17结合曲线。每个数据显示为 SEM ±平均值 （n = 3）。此图由Su等人修改，22经许可转载。请点击此处查看此图的大图。
图 5：纳米棒周围曲率传感蛋白的膜结合动力学。 （公元至日）脂质双层 （A）、F-BAR （B）、IDR FBP17 （C） 和 IDRFBP17 的延时成像在纳米棒上洗掉 （D） FRAP 分析。漂白区域由红色虚线圆圈表示。比例尺：5 μm。 （E） 通过 FRAP 测量归一化纳米条强度图。此图由Su等人修改，22经许可转载。请点击此处查看此图的大图。
补充图1：添加蛋白质前后的膜扩散。 （A）在添加GFP-His蛋白之前（顶部）和之后（底部）在纳米棒周围用1摩尔%18：1 DGS-NTA（Ni）和0.5摩尔%德克萨斯红DHPE在POPC脂质双层上进行FRAP测试的延时成像。漂白区域由黄色虚线圆圈表示。（B） 通过 FRAP 测量归一化纳米条强度图。比例尺：2 μm。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
这里描述的纳米棒-SLB系统提供了几种现有体外测定中优势的独特组合。作为脂质体漂浮或沉降测定，它有效地揭示了蛋白质与高度弯曲的膜的优先结合，但需要的样品要少得多，并且在单个纳米棒8，29上提供更精确定义的曲率。它还提供广泛的精确控制曲率，可与SLiC测定同时进行比较，较少关注不同曲率下的脂质组成变化，以及随着尺寸低于光的衍射极限而检测不到的形态或曲率变化，因为SLB是移动的，并且连续紧密地覆盖所有尺寸的纳米棒30.Nanobar-SLB还允许观察弯曲膜上蛋白质的动态行为作为系绳拉动测定，但不受管生成的吞吐量和光学捕获操作经验的限制13。尽管 SMrT 测定生成高通量的膜管，但膜曲率沿纳米管变化，这使得研究蛋白质的曲率灵敏度变得更加困难16。更有趣的是，与图案衬底18，19，20，27上其他基于SLB的系统相比，nanobar-SLB在棒端的定义曲率旁边提供了一个扁平的棒状中心，有效地作为零曲率的局部控制，以最大限度地减少表面密度变化对定量分析的影响。使用高分辨率电子束光刻技术定制曲率组合的能力不仅可以产生局部零曲率控制，还可以产生正曲率和负曲率，如前面在活细胞研究中证明的那样2。
使用此方法时存在值得注意的潜在限制。首先，芯片上的纳米制造是一个相对复杂的过程，需要洁净室设施和专用设备（特别是电子束写入器）。如此高昂的成本导致我们重复使用芯片;与一次性使用相比，这导致清洁芯片表面和使用PDMS组装芯片的时间更长。纳米芯片的可用性是另一种类型的限制。使用芯片时操作不当，例如面向工作台的表面可能会导致纳米结构磨损，特别是对于高纵横比结构。而且，在基底上形成的脂质双层是连续的膜;这种紧张很容易蔓延到任何地方。对于需要操纵膜张力的研究， 诸如通过 连接的微量移液器系统从GUV中提取系绳之类的技术提供了更方便的解决方案10。
为了获得最佳结果，以下步骤也很关键。（i）囊泡大小对于SLB的形成至关重要31，32。以前的文献表明，与使用带耗散的石英晶体微量天平 （QCM-D） 测试32 相比，较小尺寸囊泡 （< 90 nm） 的融合倾向更高。因此，与 300 nm 的 LUV 相比，~50 nm 的直径将更容易形成 SLB。考虑到这个问题，在冻融和挤出步骤中至少需要20次才能形成用于SLB形成的均质SUV。在每个实验中，FRAP测试也是必要的，以验证膜迁移率。（ii）在SUV准备过程中，所有设备应保持清洁，避免灰尘状小颗粒的污染。特别是对于小型挤出机，针头在肮脏的环境中很容易堵塞。（iii）为了制备高质量的SUV，需要完全去除脂质混合物中的氯仿，以避免破坏脂质囊泡。（iv） 在SLB形成之前，需要对芯片进行新鲜的等离子清洗，以确保高度亲水的表面，以便有效地破坏SUV以形成连续的双层。等离子体处理后长时间暴露在环境中可能会导致粉尘颗粒或有机残留物与芯片表面的非特异性结合，从而影响表面的亲水性。（v） 为了组装用于SLB形成和蛋白质孵育的PDMS室，每个PDMS片段的清洁度和平整度对于确保流体通道的良好密封非常重要。腔室的任何泄漏都可能导致SLB变干或改变蛋白质浓度。（vi）成像焦点调整对于确保一致的强度测量至关重要，因为纳米巴（600nm）的高度与z轴33中激光扫描共聚焦显微镜的焦深相当。每次阵列水平移动时，都应重新调整焦点，以保持图像中纳米条边缘的清晰度。
最重要的是，这里介绍的纳米巴-SLB系统提供了一种研究膜曲率传感蛋白的强大方法。影响蛋白质与弯曲膜相互作用的各种参数可以在一系列曲率范围内定量研究，例如蛋白质8，30的曲率敏感结构域（例如BAR结构域和两亲螺旋），膜27，34的脂质组成（例如PS和PIP2），pH，离子强度和环境温度35，36，以及复合物形成的蛋白质-蛋白质相互作用（例如，CHMP2B 和 CHMP2A 可能对 ESCRT-III 催化的膜重塑过程有不同的贡献）37，38。还可以使用nanobar-SLB系统进行动态研究，以探测膜结合动力学11、膜蛋白扩散或组装39，以及酶促反应40或相分离行为13，41，42。此外，人造脂质双层通常被认为是对称的，每个脂质单层含有相同的脂质组成，这与活细胞膜43有很大不同。诱导不对称双层以更好地模拟质膜可以通过改变表面的材料、缓冲条件、脂质组成或温度44，45，46，47来获得。验证纳米巴-SLB体系上能否形成不对称双层以研究蛋白质在弯曲膜上的行为具有重要价值，值得进一步研究。
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Disclosures
作者声明在这项工作中没有竞争性的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢南洋理工大学（NTU）南洋纳米制造中心（N2FC）和颠覆性光子技术中心（CDPT）支持纳米结构制造和SEM成像，感谢南洋理工大学生物科学学院蛋白质生产平台（PPP）用于蛋白质纯化，感谢南洋理工大学化学与生物医学工程学院的共聚焦显微镜。这项工作由新加坡教育部（W. Zhao，RG112/20，RG95/21和MOE-T2EP30220-0009），数字分子分析与科学研究所（IDMxS）资助，由教育部资助的卓越研究中心计划（W. Zhao），人类前沿科学计划基金会（W. Zhao，RGY0088 / 2021），NTU启动基金（W. Zhao）， 南洋理工大学化学与生物医学工程学院研究奖学金（苗X.）和中国国家留学基金委研究奖学金（吴杰）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
| Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
| 10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Cotton buds | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
| Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
| F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
| Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
| Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
| Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
| Water Bath | Julabo | TW8 |
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