Aptamer-basierte Target-Detektion durch eine 3-stufige isotherme G-Quadruplex-Amplifikationsreaktion

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll demonstriert die Verwendung eines schnellen, 3-stufigen, Aptamer-basierten exponentiellen Amplifikations-Assays zur Detektion von Targets. Probenvorbereitung, Signalverstärkung und Farbentwicklung werden behandelt, um dieses System zu implementieren, um das Vorhandensein von Theophyllin gegenüber dem von Koffein zu erkennen.

Zusammenfassung

Aptamere sind Zielerkennungsmoleküle, die mit hoher Affinität und Spezifität binden. Diese Eigenschaften können genutzt werden, um andere Moleküle mit der Fähigkeit zur Signalerzeugung zu steuern. Für das hier beschriebene System aktiviert die Zielerkennung durch eine aptamere Domäne, Stamm II eines modifizierten Hammerkopf-Ribozyms, das selbstspaltende Ribozym, indem das anfänglich unstrukturierte Konstrukt stabilisiert wird. Die cis-spaltende RNA wirkt an der Verbindungsstelle von Stamm III und Stamm I, wodurch zwei Spaltprodukte entstehen. Das längere Spaltprodukt führt zu einer isothermen exponentiellen Amplifikationsreaktion (EXPAR) der beiden ähnlichen katalytisch aktiven G-Quadruplexe. Diese resultierenden Amplifikationsprodukte katalysieren die Peroxidase-Reduktion, die mit der Reduktion eines kolorimetrischen Substrats mit einer Leistung gekoppelt ist, die mit bloßem Auge wahrgenommen werden kann. Das in der vorliegenden Studie beschriebene 3-teilige System verbessert Nachweismodalitäten wie Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs), indem es in nur 15 Minuten ein visuell detektierbares Signal erzeugt, das das Vorhandensein von nur 0,5 μM Theophyllin anzeigt.

Einleitung

Aptamere sind in der Regel einzelsträngige DNA oder RNA, die durch einen evolutionären Prozess mit hoher Bindungsaffinität und Spezifität für die gewünschten Ziele ausgewählt werden¹. Zusätzlich zur Bindungsfähigkeit können Aptamere mit Motiven verknüpft werden und diese mit Signalausgangsfunktionen^2,3 steuern^, wodurch das Signal verstärkt und die Empfindlichkeit des Systems verbessert wird. Das G-Quadruplex-System der isothermen exponentiellen Verstärkungsreaktion (GQ-EXPAR) ist ein dreiteiliges System (Abbildung 1), das ein visuelles Signal entwickelt, wenn aufeinanderfolgende Komponenten zu einem einzigen Reaktionsgefäß hinzugefügt werden, um einen visuellen Ausgang⁴ zu erzeugen. Dieses System ermöglicht den Nachweis eines bestimmten Ziels, hierin Theophyllin, in einer gegebenen Probe innerhalb von 15 Minuten unter Verwendung eines optimierten Arbeitsablaufs, um eine schnelle, spezifische Detektion eines Ziels von Interesse zu ermöglichen. Diese Methode muss für Proben in Betracht gezogen werden, bei denen eine spezifische Quantifizierung der Zielkonzentration weniger besorgniserregend ist als eine hohe Spezifität der Reaktion in kurzer Zeit.

Ein allosterischer Riboschalter, ein strukturwechselndes RNA-Molekül (Ribozym), das sich selbst spaltet, erzeugt das initiale Signal. Dieses Konstrukt basiert auf dem Hammerhai-Ribozym, wobei in Stamm II eine aptamere Domäne als Regulator der Spaltaktivität eingeführt wurde. Seine Selbstspaltungsfunktion wird aktiviert, wenn seine aptamere Domäne bei der Bindung an sein Ziel^{stabilisiert wird 5}. Andernfalls ist der Switch in seinem nativen Zustand inaktiv.

Die anschließende exponentielle Amplifikationsreaktion (EXPAR) nutzt die Freisetzung des selbstgespaltenen RNA-Strangs aus der ersten Stufe, um eine isotherme Amplifikationsreaktion⁶ auszulösen. Das Amplifikationsprodukt von EXPAR hat die Peroxidaseaktivität⁷, die als Grundlage für die letzte Stufe des Systems dient. Wenn einige Substrate in Verbindung mit dem Peroxidabbau oxidiert werden, erzeugen sie eine Fluoreszenzleistung, die mit verschiedenen Geräten gemessen werden kann. Andere gängige Substrate können ersetzt werden, um ein farbiges Produkt für die visuelle Detektion herzustellen. EXPAR und die Peroxidaseaktivität seiner Amplifikationsprodukte wirken als 2-stufiger Signalverstärker, der die Empfindlichkeit im Vergleich zu herkömmlichen Strategien auf höhere Konzentrationen erhöht ^7,8.

Der Nachweis von Theophyllin im Vergleich zu Koffein wird als Beispiel für die Spezifität dieser Nachweisplattform verwendet, da sie sich nur um eine einzige Methylgruppe unterscheiden (Abbildung 2). Diese Demonstration des Systems erzeugt einen kolorimetrischen Ausgang für den visuellen Nachweis von mindestens 500 nM Theophyllin.

Protokoll

Siehe Ergänzende Tabelle 1 (die Reaktionsaufbautabelle) für die Herstellung von Röhrchen, einschließlich der spezifischen Volumina und Konzentrationen der Reaktionskomponenten. Das hier demonstrierte Protokoll verwendet ein vormontiertes Detektionsplattform-Kit, wie in der Materialtabelle beschrieben. Alle Komponenten müssen auf Eis gelagert werden, sofern nicht anders angegeben.

1. Herstellung von Ribozym

HINWEIS: Die primäre Nachweiskomponente ist ein allosterisches (Aptamer-reguliertes) Ribozym, das Theophyllin erkennt (siehe Ergänzende Tabelle 2).

1. Sammeln Sie 5 U T4-Polynukleotidkinase (0,5 μl, siehe Materialtabelle) in einem PCR-Röhrchen, das zur Aktivierung der Ribozym-Spaltprodukte verwendet wird.
   Anmerkungen: Diese Komponente wird zuerst hinzugefügt, damit der Benutzer die korrekte Abgabe des Enzyms sehen kann.
2. Geben Sie 1 μl vorbereiteten 5x Ribozympuffer (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen (PCR-Röhrchen).
3. Um die Spezifität visuell nachzuweisen, werden 1,5 μl 2 mM Theophyllin (Ziel) oder 2 mM Koffein (Kontrolle) (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen als Testproben gegeben.
   HINWEIS: Für die Erstellung einer Standardkurve wird empfohlen, bei 3,125 mM Analyt zu beginnen und fünffache Verdünnungen bis 0,001 mM zu testen.
4. Mischen Sie jedes Probenröhrchen gründlich, indem Sie 5-10 Mal pipettieren.
5. Geben Sie 2 μl 600 nM RNA mit einer für das Target spezifischen aptameren Domäne (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen, um eine Endkonzentration von 240 nM in 5 μl Testlösung zu erreichen, mischen Sie dann schnell durch Pipettieren und legen Sie es auf einen kalten Block, um das Hintergrundsignal zu minimieren.
   HINWEIS: Es ist wichtig, zunächst alle Reaktionen ohne Ribozym vorzubereiten, da die Selbstspaltungsreaktion sofort beginnt, wenn Ribozym mit Ribozympuffer kombiniert wird, und einen erheblichen Hintergrund erzeugen kann.
6. Sobald alle Reaktionsgefäße vorbereitet sind, inkubieren Sie jede Probe (5 μL) bei Raumtemperatur (23 °C) genau 3 Minuten lang mit einem Timer. Legen Sie die Probenröhrchen nach der Inkubation sofort wieder in Eis (4 °C) ein.

2. GQ-EXPAR

1. Geben Sie 3,5 μl Nickase-Polymerase-Enzymgemisch (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen und mischen Sie es gut.
   HINWEIS: Die erforderlichen Enzymkonzentrationen hängen von den Erkennungssequenzen, den Enzymtypen und den Reaktionstemperaturen ab, deren Kombination empirisch bestimmt wurde.
2. Geben Sie 31,5 μl EXPAR-Reaktionsmischung mit Templat, Nukleotiden und Reaktionspuffer (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen und jede Pipette, um sie zu mischen.
   HINWEIS: Die Komponentenkonzentrationen sind auf der Grundlage der Enzyme und Sequenzen der Polymeraseprodukte optimiert.
3. Sobald alle Proben vorbereitet sind, inkubieren Sie jede vorbereitete Probe (40 μL) bei 55 °C genau 5 Minuten lang mit einem Timer. Wenn möglich, inkubieren Sie auf einem Thermocycler, obwohl ein beheizter Deckel nicht erforderlich ist.
4. Legen Sie die Probenröhrchen nach dem Inkubationsschritt sofort wieder in Eis (4 °C) ein.

3. Farbentwicklung

1. Geben Sie 2 μl Hemin-Lösung (25 μM, siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen und mischen Sie es gut.
2. Geben Sie 58 μl der handelsüblichen TMB-Lösung (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen und mischen Sie es gut.
3. Inkubieren Sie die Farbentwicklungsreaktion (100 μL) bei Raumtemperatur für mindestens 3 min und bis zu 30 min.
   Anmerkungen: (Optional) Die Farbentwicklung kann durch Zugabe von 20 μl 2 M Schwefelsäure gestoppt werden.
4. Lesen Sie die Proben qualitativ mit dem Auge ab oder quantifizieren Sie die Ergebnisse mit einem Absorptionsplatten-Lesegerät bei 450 nm, wenn die Farbentwicklungsreaktionen mit Schwefelsäure gestoppt werden.

Ergebnisse

Die in Abbildung 1 dargestellte Detektionsplattform wandelt die aptamerische Zielerkennung in kurzer Zeit in visuell deutliche Unterschiede zwischen den Probenpräparaten (Target vs. Nicht-Ziel, Abbildung 2) um. Ein allosterisches Ribozym, das von Soukup et ^al.5 identifiziert wurde, diente als Ausgangspunkt für die Erstellung einer weniger verrauschten Sequenz mit Reaktion auf das Target über die Kontroll- und Negativproben. Das optimierte...

Diskussion

Die hier vorgestellte Methode nutzt den Übergang zwischen einer anfänglich ungeordneten Sekundärstruktur in einem allosterischen Ribozym und der zusätzlichen Stabilität, die durch die Bindung des Ziels an die aptamere Domäne verliehen wird, um das cis-spaltende Hammerkopf-Ribozym zu aktivieren. Die Stabilität des Ribozyms wurde angepasst, um die katalytische Aktivität in Abwesenheit des Targets zu minimieren und gleichzeitig die Bindung des Targets zur Wiederherstellung der aktiven Struktur zu ermöglichen. Darüber hinaus...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidindihydrochlorid (TMB)-Lösung mit H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Reagenz zur Farbentwicklung. Minimieren Sie die Licht- und Atmosphäreneinwirkung. Zuvor BIOO Scientific Katalognummer 1806. Lieferung im Apta-Beacon Demonstration Kit als Röhre 3-2.
5'- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3"	Integrated DNA Technologies (IDT)	Kundenspezifisch	optimiertes QtQ47-DNA-Template für EXPAR zur Herstellung von G-Quadruplex, grundiert durch G-Quadruplex. Dies wird für den "exponentiellen" Teil von EXPAR verwendet, um die Menge an DNAzyme, die für die Farbentwicklung in Schritt 3 verwendet wird, schnell zu erhöhen. Das Template enthält ein 3'-Biotin, um eine unbeabsichtigte Verlängerung durch die Bst 2.0 DNA-Polymerase während der EXPAR. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-2 zu verhindern.
5'-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3'	Integrated DNA Technologies (IDT)	Benutzerdefinierte	Theophyllin-recognierende allosterische Ribozymsequenz (selbstspaltendes Ribozym, reguliert durch RNA-Aptamerdomäne für Theophyllin), modifiziert von Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A. und Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Geliefert im Apta-beacon Demonstrationskit als Röhrchen 1-3.
5'-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3'	Integrated DNA Technologies (IDT)	Kundenspezifisch	optimiertes P3tQ49-DNA-Template für EXPAR zur Herstellung von G-Quadruplex, grundiert mit P3-Spaltprodukt. Dies wird in Schritt 2 verwendet, um das Spaltprodukt in DNAzyme zu übersetzen, das für die Farbentwicklung in Schritt 3 verwendet wird. Das Template enthält ein 3'-Biotin, um eine unbeabsichtigte Verlängerung durch die Bst 2.0 DNA-Polymerase während der EXPAR. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-2 zu verhindern.
5x Ribozyme Puffer	Aptagen, LLC	N/A	5x Zusammensetzung: 600 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Verwendet in Schritt 1. im Apta-Beacon Demonstration Kit als Röhre 1-4 geliefert.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstrationskit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	Das Demo-Kit demonstriert die Spezifität des kolorimetrischen Assays durch den Nachweis schwieriger niedermolekularer Ziele, Theophyllin versus Koffein, die sich nur durch eine einzige Methylgruppe unterscheiden.
Bst 2.0 DNA-Polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isotherme Amplifikationspolymerase mit Strangverdrängungsaktivität. Teil des Nickase-Polymerase-Mixes, hergestellt bei 9,375 U/uL. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Puffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Kombiniert mit 2 μl 10-fachem isothermem Amplifikationspuffer und 27,5 μl nukleasefreiem Wasser, um 1,11-fachen EXPAR-Puffer in EXPAR Mix herzustellen. Dieses Produkt ersetzt das zuvor verwendete B7203SVIAL, das Teil der ursprünglichen Systementwicklung war (gleiche Zusammensetzung außer nicht-rekombinantem BSA). Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer Gegenziel (Kontrolle), hergestellt mit nukleasefreiem Wasser. Lieferung im Apta-Beacon Demonstration Kit als Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Teil des EXPAR-Reaktionsgemisches. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR Reaktionsgemisch	Aptagen, LLC	N/A	0,44 mM dNTPs, 0,38 μ M P3tQ49, 0,38 μ M QtQ47, 44,44 mM Tris-HCl (pH 8,4), 63,5 mM NaCl, 31,5 mM KCl, 6,35 mM MgCl2, 1,27 mM MgSO4, 6,35 mM (NH4)2SO4, 63,5 μ g/ml BSA, 0,0635 % Tween 20, Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspendiert in DMF auf eine Endkonzentration von 25 μM. Lieferung im Apta-Beacon Demonstration Kit als Tube 3-1.
Isothermer Amplifikationspuffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Kombiniert mit 2 μl 10x Puffer 3.1 und 27.5 µ L nukleasefreies Wasser zur Herstellung von 1,11x EXPAR Puffer im EXPAR Mix. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead-Ribozym-Cofaktor, notwendig für die Selbstspaltung. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler zur Kontrolle der Inkubationstemperaturen. Es kann jeder Thermocycler oder Heißblock verwendet werden.
N, N-Dimethylformamid (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Wird verwendet, um Hemin zu resuspendieren und die Haltbarkeit im Gefrierschrank zu maximieren. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-Polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 Einheiten/μ L) und Bst 2.0 DNA-Polymerase (0,5 Einheiten/μ L). Lieferung im Apta-Beacon Demonstration Kit als Röhre 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking-Enzym, um eine kontinuierliche isotherme Amplifikation zu ermöglichen. Teil des Nickase-Polymerase-Mixes, hergestellt bei 0,5 U/uL. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Puffer für Enzyme, die zur Entfernung von cyclischem Phosphat erforderlich sind. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4-Polynukleotidkinase	New England Biolabs	M0201S	Entfernt zyklisches Phosphat nach der Spaltung, damit das Spaltprodukt die isotherme Amplifikationsreaktion auslösen kann. Lieferung im Apta-Beacon-Demonstrationskit als PCR-Röhrchen.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plattenlesegerät zur Messung des Absorptionssignals aus den Ergebnissen von Schritt 3.
Theophyllin	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer-Target, hergestellt mit nukleasefreiem Wasser. Lieferung im Apta-Beacon Demonstration Kit als Röhrchen 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer-Bindungspuffer. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 1-4.