Methodenartikel

Hochdurchsatz-Kardiotoxizitäts-Screening unter Verwendung von reifen, humaninduzierten pluripotenten Stammzell-Kardiomyozyten-Monoschichten

DOI:

10.3791/64364

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24. März 2023

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1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) bieten eine Alternative zur Verwendung von Tieren für das präklinische Kardiotoxizitäts-Screening. Eine Einschränkung für die weit verbreitete Einführung von hiPSC-CMs im präklinischen Toxizitätsscreening ist der unreife, fetale Phänotyp der Zellen. Hier werden Protokolle für eine robuste und schnelle Reifung von hiPSC-CMs vorgestellt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aus humanen Stammzellen gewonnene Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) werden verwendet, um die Abhängigkeit von Tieren und tierischen Zellen für präklinische Kardiotoxizitätstests zu ersetzen und zu verringern. In zweidimensionalen Monolayer-Formaten rekapitulieren hiPSC-CMs die Struktur und Funktion der adulten menschlichen Herzmuskelzellen, wenn sie auf einer optimalen extrazellulären Matrix (EZM) kultiviert werden. Eine aus humanen perinatalen Stammzellen gewonnene EZM (Maturation-inducing extracellular matrix-MECM) reift die hiPSC-CM-Struktur, -Funktion und den Stoffwechselzustand innerhalb von 7 Tagen nach der Plattierung.

Reife hiPSC-CM-Monoschichten sprechen auch auf klinisch relevante Medikamente erwartungsgemäß an, wobei ein bekanntes Risiko besteht, Herzrhythmusstörungen und Kardiotoxizität zu verursachen. Die Reifung von hiPSC-CM-Monoschichten war bisher ein Hindernis für die breite Akzeptanz dieser wertvollen Zellen für die regulatorische Wissenschaft und das Sicherheitsscreening. In diesem Artikel werden validierte Methoden für das Platting, die Reifung und die funktionelle Phänotypisierung der elektrophysiologischen und kontraktilen Funktion von hiPSC-CM vorgestellt. Diese Methoden gelten sowohl für kommerziell erhältliche gereinigte Kardiomyozyten als auch für aus Stammzellen gewonnene Kardiomyozyten, die intern mit hocheffizienten, kammerspezifischen Differenzierungsprotokollen erzeugt werden.

Die elektrophysiologische Funktion im Hochdurchsatz wird entweder mit spannungsempfindlichen Farbstoffen (VSDs; Emission: 488 nm), kalziumempfindlichen Fluorophoren (CSFs) oder genetisch kodierten Kalziumsensoren (GCaMP6) gemessen. Ein optisches Hochdurchsatz-Kartierungsgerät wird für die optische Aufzeichnung jedes Funktionsparameters verwendet, und eine spezielle Software wird für die elektrophysiologische Datenanalyse verwendet. MECM-Protokolle werden für das Medikationsscreening unter Verwendung eines positiven inotropen (Isoprenalin) und humanen Ether-a-go-go-related gene (hERG)-Kanal-spezifischen Blockers angewendet. Diese Ressourcen werden es anderen Prüfärzten ermöglichen, ausgereifte hiPSC-CMs erfolgreich für Hochdurchsatz, präklinisches Kardiotoxizitätsscreening, Wirksamkeitstests von Herzmedikamenten und kardiovaskuläre Forschung einzusetzen.

Einleitung

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Humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) wurden auf internationaler Ebene validiert und stehen für ein In-vitro-Kardiotoxizitäts-Screening zur Verfügung 1. Hochreine hiPSC-CMs können in nahezu unbegrenzter Anzahl erzeugt, kryokonserviert und aufgetaut werden. Nach dem Umplattieren reanimieren sie sich ebenfalls und beginnen sich mit einem Rhythmus zusammenzuziehen, der an das menschliche Herz erinnert 2,3. Bemerkenswert ist, dass einzelne hiPSC-CMs aneinander koppeln und funktionelle Synzytien bilden, die als ein einziges Gewebe schlagen. Heutzutage werden hiPS-Zellen routinemäßig aus Blutproben von Patienten gewonnen, so dass jede Person mit In-vitro-hiPSC-CM-Screening-Assays für die Kardiotoxizität dargestellt werden kann 4,5. Dies schafft die Möglichkeit, "klinische Studien in einer Schale" durchzuführen, bei denen verschiedene Populationen signifikant vertreten sind6.

Ein entscheidender Vorteil gegenüber bestehenden Screening-Ansätzen für die Kardiotoxizität von Tieren und tierischen Zellen besteht darin, dass hiPSC-CMs das gesamte menschliche Genom nutzen und ein In-vitro-System mit genetischen Ähnlichkeiten zum menschlichen Herzen bieten. Dies ist besonders attraktiv für die Pharmakogenomik und die personalisierte Medizin - die Verwendung von hiPSC-CMs für die Entwicklung von Medikamenten und anderen Therapien soll genauere, präzisere und sicherere Medikamentenverschreibungen ermöglichen. In der Tat haben sich zweidimensionale (2D) hiPSC-CM-Monolayer-Assays als prädiktiv für die Kardiotoxizität von Medikamenten erwiesen, wobei eine Reihe von klinisch eingesetzten Medikamenten mit einem bekannten Risiko für die Entstehung von Herzrhythmusstörungen verwendetwird 1,7,8,9. Trotz des enormen Potenzials von hiPSC-CMs und des Versprechens, die Arzneimittelentwicklung zu rationalisieren und billiger zu machen, gab es eine Zurückhaltung bei der Verwendung dieser neuartigen Assays10,11,12.

Bisher ist eine wesentliche Einschränkung der weit verbreiteten Einführung und Akzeptanz von hiPSC-CM-Screening-Assays ihr unreifes, fetales Aussehen sowie ihre Funktion. Die kritische Frage der hiPSC-CM-Reifung wurde in der wissenschaftlichen Literatur bis zum Überdruss diskutiert 13,14,15,16. Ebenso wurden viele Ansätze eingesetzt, um die hiPSC-CM-Reifung zu fördern, darunter Manipulationen der extrazellulären Matrix (EZM) in 2D-Monoschichten und die Entwicklung von 3D-manipuliertem Herzgewebe (EHTs)17,18. Derzeit herrscht die weit verbreitete Überzeugung, dass die Verwendung von 3D-EHTs im Vergleich zu 2D-Monolayer-basierten Ansätzen eine bessere Reifung bieten wird. 2D-Monolagen bieten jedoch im Vergleich zu 3D-EHTs eine höhere Effizienz der Zellnutzung und einen höheren Erfolg bei der Beschichtung. 3D-EHTs verwenden eine größere Anzahl von Zellen und erfordern oft die Einbeziehung anderer Zelltypen, die die Ergebnisse verfälschen können. Daher liegt der Fokus in diesem Artikel auf der Verwendung einer einfachen Methode zur Reifung von hiPSC-CMs, die als 2D-Monolagen aus elektrisch und mechanisch gekoppelten Zellen kultiviert werden.

Eine fortgeschrittene hiPSC-CM-Reifung kann in 2D-Monolagen mit einem ECM erreicht werden. Die 2D-Monoschichten von hiPSC-CMs können mit Hilfe eines weichen, flexiblen Polydimethylsiloxan-Deckglases gereift werden, das mit einer Basalmembranmatrix beschichtet ist, die von einer Engelbreth-Holm-Schwarm-Maussarkomzelle (Maus-EZM) sezerniert wird. Im Jahr 2016 zeigten Berichte, dass hiPSC-CMs, die unter dieser weichen EZM-Erkrankung kultiviert wurden, funktionell reiften und Aktionspotential-Leitungsgeschwindigkeiten in der Nähe von Herzwerten bei Erwachsenen (~50 cm/s) aufwiesen18. Darüber hinaus zeigten diese reifen hiPSC-CMs viele andere elektrophysiologische Eigenschaften, die an das adulte Herz erinnern, einschließlich des hyperpolarisierten Ruhemembranpotentials und der Expression von Kir2.1. In jüngerer Zeit wurde in Berichten eine aus humanen perinatalen Stammzellen gewonnene EZM-Beschichtung identifiziert, die die strukturelle Reifung von 2D-hiPSC-CMs fördert19. Hier werden einfach anzuwendende Methoden vorgestellt, um strukturell ausgereifte 2D-hiPSC-CM-Monolagen für den Einsatz in elektrophysiologischen Hochdurchsatz-Screens zu entwickeln. Darüber hinaus bieten wir die Validierung eines optischen Mapping-Instruments für die automatisierte Erfassung und Analyse der elektrophysiologischen Funktion von 2D-hiPSC-CM-Monolayern unter Verwendung spannungsempfindlicher Farbstoffe (VSDs) und kalziumsensitiver Sonden und Proteine an.

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Protokoll

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Die Verwendung von hiPSC in diesem Protokoll wurde vom HPSCRO-Komitee der Universität Michigan (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee) genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie eine Liste der Materialien und Geräte. Siehe Tabelle 1 für Medien und ihre Zusammensetzungen.

1. Auftauen und Plattieren kommerziell erhältlicher kryokonservierter hiPSC-CMs zur Reifung auf einer reifungsinduzierenden extrazellulären Matrix (MECM)

  1. Erwärmen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur und rehydrieren Sie die MECM-Platten mit Hanks balancierter Salzlösung (HBSS) oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die Kalzium und Magnesium enthält, für 1 Stunde vor der Kardiomyozytenbeschichtung (200 μl Puffer pro Vertiefung einer 96-Well-Platte).
  2. Waschen Sie die MECM-Platten 2x mit kalzium- und magnesiumhaltigem HBSS oder PBS für 1 h vor der Kardiomyozytenbeschichtung (200 μl Puffer pro Vertiefung einer 96-Well-Platte) und halten Sie die Wells hydratisiert.
  3. Bereiten Sie ein 37 °C warmes Wasserbad vor.
  4. Entfernen Sie die Kardiomyozytenröhrchen aus dem Flüssigstickstofftank, legen Sie die Röhrchen auf Trockeneis und öffnen Sie die Röhrchenkappen leicht, um den Druck abzulassen.
    HINWEIS: Das Ablassen des Drucks in den Schläuchen ist äußerst wichtig! Wenn sich in den Rohren zu viel Druck aufbaut, können sie explodieren.
  5. Verschließen Sie die Tubenkappen wieder und legen Sie sie zum Auftauen für 4 Minuten in das Wasserbad.
    Anmerkungen: Lassen Sie sie vollständig auftauen, um Zellschäden durch teilweises Auftauen zu vermeiden.
  6. Nachdem die Zellen aufgetaut sind, besprühen Sie die Röhrchen vor dem Öffnen mit 70%igem Ethanol. Übertragen Sie die Zellen mit einer 1-ml-Pipette in konische 15-ml-Röhrchen. Träufeln Sie langsam 8 ml Beschichtungsmedium ab und bewegen Sie das Röhrchen jedes Mal, wenn 1 ml hinzugefügt wird, damit sich die Zellen an Änderungen der Osmolarität anpassen können.
    1. Waschen Sie das Kryomaterial mit 1 ml Beschichtungsmedium und einer 1-ml-Glaspipette. Anschließend die Wäsche langsam in das konische 15-ml-Röhrchen tropfen.
  7. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei ~300 × g für 5 Minuten. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Beschichtungsmedium. Entfernen Sie ein Aliquot und führen Sie die Lebendzellzählung mit einem Hämozytometer durch. Fügen Sie zusätzliches Beschichtungsmedium hinzu, um 7,5 × 105 Zellen/ml zu erhalten.
    HINWEIS: Für die Aufbereitung von 96 Wells sind ca. 10 ml Zellsuspension erforderlich.
  8. Dosieren Sie 100 μl Zellsuspension pro Well einer MECM-beschichteten 96-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, eine Zellausfällung zu vermeiden und während der Beschichtung eine gleichmäßige Zelldichte in allen Vertiefungen zu erzielen.
  9. Inkubieren Sie die Zellen 2 Tage lang bei 37 °C, 5 % CO2, bevor das Medium in ein Erhaltungsmedium (200 μL/Well) umgestellt wird. Wechseln Sie das Pflegemedium am 5. Tag nach dem Auftauen. Führen Sie EP-Assays an Tag 7 oder später durch, wie zuvor beschrieben 8,9. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, wenn Sie sich für die Erweiterung der Zellkultur entscheiden.

2. herzgesteuerte HiPSC-Differenzierung und hiPSC-CM-Aufreinigung

  1. Erwärmen Sie 1x kommerziell erhältliche Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung, HBSS ohne Calcium und Magnesium (HBSS--) und 6-Well-Platten, die mit einer solubilisierten Basalmembranmatrix beschichtet sind, die von einer Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkomzelle (Maus-ECM) sezerniert wird, auf Raumtemperatur.
  2. Markieren Sie die differenzierten Kolonien durch Phasenkontrastmikroskopie und aspirieren/abtragen. Waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml HBSS--. Führen Sie zwei Waschgänge in Vertiefungen durch, die >10 Differenzierungspunkte enthalten.
  3. Saugen Sie das HBSS ab und geben Sie 1 ml EDTA-Lösung in jede Vertiefung. Die Platten bis zu 5 min bei 37 °C inkubieren. Überprüfen Sie die Platten nach 3 Minuten und suchen Sie nach durchscheinenden weißen, sichtbaren Kolonien.
  4. Saugen Sie die EDTA-Lösung an und geben Sie 1 ml in eine einzelne Vertiefung. Entfernen Sie die Zellen mit 2 ml hiPSC-Medium, indem Sie die Suspension wiederholt auf und ab pipettieren, wobei Sie eine 10-ml-Glaspipette verwenden, um alle Stammzellen aus der Vertiefung zu lösen, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein Sammelröhrchen. Wiederholen Sie das Absaugen und Lösen mit nachfolgenden Vertiefungen.
    Anmerkungen: Schwer anzuhebende Kolonien mit der Spitze der Glaspipette entfernen.
  5. Zählen Sie die Stammzellen und stellen Sie das Volumen auf Platte 8,0 × 105 Zellen/Well ein. Kultivieren Sie die Zellen auf hiPSC-Medium (2 ml/Well), bis die Stammzellen eine Konfluenz von 90% erreicht haben (dieses Mal wird von nun an als D0 bezeichnet).
  6. Bereiten Sie 2 ml Basaldifferenzierungsmedium vor, ergänzt mit 4 μM CHIR99021.
  7. Waschen Sie auf D0 jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit Stammzellen mit 1 ml HBSS pro Well. Ersetzen Sie das HBSS durch ein basales Differenzierungsmedium, das mit 4 μM CHIR99021 ergänzt wird.
  8. Tun Sie auf D1 nichts.
  9. Auf D2 wird ein basales Differenzierungsmedium hergestellt, das mit 4 μM IWP4 ergänzt wird.
  10. Ersetzen Sie das Medium durch 2 ml IWP4-supplementiertes Basaldifferenzierungsmedium pro Well.
  11. Tun Sie an D3 nichts für eine ventrikuläre Differenzierung. Für eine atrialspezifische Differenzierung wird das Medium abgesaugt und 2 ml Basalmedium, ergänzt mit 4 μM IWP4 und 1 μM Retinsäure (RA)-Lösung, pro Well hinzugefügt.
  12. Auf D4 saugen Sie das Medium ab und fügen Sie 2 ml Basalmedium pro Vertiefung hinzu, um die ventrikuläre Differenzierung zu gewährleisten. Für eine Vorhofdifferenzierung saugen Sie das Medium ab und fügen Sie 2 ml Basalmedium hinzu, das mit 1 μM RA-Lösung pro Well angereichert ist.
  13. Tun Sie auf D5 nichts.
  14. Auf D6 saugen Sie das Medium an und fügen Sie 2 ml Basalmedium pro Vertiefung hinzu (sowohl für die atriale als auch für die ventrikuläre Differenzierung).
  15. Tun Sie auf D7 nichts.
  16. Auf D8 saugen Sie das Medium an und fügen Sie 2 ml Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium hinzu. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag bis zur Zelltrennung oder befolgen Sie einen chronischen Drogenexpositionsplan.

3. hiPSC-CM-Aufreinigung mittels MACS (magnetisch aktivierte Zellsortierung)

  1. Saugen Sie das Zellkulturmedium ab und waschen Sie es mit jeweils 1 ml HBSS aus--. Dissoziieren Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml 0,25% Trypsin/EDTA und Inkubation bei 37 °C, 5% CO2 für 10 min. Resuspendieren und singularisieren Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit 2 ml Beschichtungsmedium, um das Trypsin/EDTA zu inaktivieren.
  2. Sammeln Sie die Zellen aus den sechs Vertiefungen in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit einem 70-μm-Sieb. Waschen Sie dann das Sieb mit 3 ml Beschichtungsmedium. Zählen Sie die Zellen.
  3. Zentrifugieren Sie die Suspension bei ~300 × g für 5 Minuten. Saugen Sie den Überstand ab und waschen Sie die Zellen mit 20 ml eiskaltem MACS-Trennpuffer. Dann erneut bei ~300 × g für 5 min zentrifugieren.
  4. Resuspendieren Sie das Pellet in 80 μl kaltem MACS-Trennpuffer pro 5 × 106 Zellen . Fügen Sie 20 μl kalten Cocktail zur Depletion von Nicht-Kardiomyozyten (Mensch) pro 5 × 106 Zellen hinzu. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis.
  5. Waschen Sie die Probe, indem Sie 4 ml kalten MACS-Trennpuffer pro 5 × 106 Zellen hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Probe bei ~300 × g für 5 min und saugen Sie den Überstand ab.
  6. Resuspendieren Sie das Pellet in 80 μl kaltem MACS-Trennpuffer pro 5 × 106 Zellen . Fügen Sie 20 μl kalte Antibiotin-Mikrokügelchen pro 5 × 106 Zellen hinzu. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis.
  7. Platzieren Sie während der Inkubation der Proben die Säulen mit positiver Depletion (ausgestattet mit den 30-μm-Vorseparationsfiltern) auf dem MACS-Separator und platzieren Sie die beschrifteten 15-ml-Sammelröhrchen unter den Säulen. Pro 5 × 106 Zellen wird eine Spalte benötigt.
  8. Jede Säule wird mit 3 ml kaltem MACS-Trennpuffer grundiert. Mischen Sie die mit Antikörpern behandelte Zellsuspension mit 2 ml MACS-Trennpuffer pro 5 × 106 Zellen und geben Sie sie in die Säule.
    HINWEIS: Nicht zentrifugieren! Die Zentrifugation in diesem Schritt wirkt sich nachteilig auf die Ausbeute der Kardiomyozyten aus.
  9. Geben Sie 2 ml MACS-Trennpuffer in jede Säule und sammeln Sie den Durchfluss, bis 12 ml Durchfluss-Kardiomyozyten-Suspension gesammelt sind.
    Anmerkungen: Lassen Sie die Säulen niemals vollständig trocknen.
  10. Zentrifugieren Sie die Kardiomyozyten bei ~300 × g für 5 Minuten, verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Kardiomyozyten in 1 ml Beschichtungsmedium.
  11. Zählen Sie die Zellen, um die Konzentration zu bestimmen, stellen Sie das Volumen auf die gewünschte Aussaatdichte ein und legen Sie die Zellen auf eine Platte. Die gereinigten Kardiomyozyten werden auf die MECM 96-Well-Platten gelegt, wie oben in den Schritten 1.9-1.11 beschrieben (7,5 × 105 Zellen/Well).

4. Optisches Mapping mit spannungsempfindlichen Farbstoffen (VSDs) und kalziumempfindlichen Fluorophoren (CSFs)

  1. Bereiten Sie die entsprechende Menge VSD in HBSS mit Calcium und Magnesium vor, indem Sie 1 μl VSD-Farbstoff pro ml HBSS und 10 μl Beladungsadjuvans pro ml HBSS hinzufügen.
    Anmerkungen: In der Regel erfordert eine 96-Well-Platte 10 ml VSD-Lösung.
  2. Alternativ kann HBSS mit Calcium und Magnesium zubereitet werden, ergänzt mit 5 μM Liquor. Das Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium wird abgesaugt und durch 100 μl VSD oder Liquor pro Well einer 96-Well-Platte ersetzt. Inkubieren Sie die Zellen für 30 min im Zellkultur-Inkubator.
  3. Entfernen Sie die Farbstoffe und ersetzen Sie sie durch Assaymedium oder HBSS. Äquilibrat bei 37 °C für die Erfassung der optischen Kartierung von Basisdaten mit einem optischen Kartierungsgerät mit hohem Durchsatz.
  4. Behandeln Sie die Zellen mit Medikamenten für akute Expositionstests oder kartieren Sie die Zellen, die chronisch den interessierenden Medikamenten ausgesetzt waren.
  5. Verwenden Sie für Kardiotoxizitätstests in 96-Well-Platten vier Dosen einer Verbindung mit mindestens sechs Wells pro Dosis. Verwenden Sie Dosen, die von unterhalb bis oberhalb der effektiven therapeutischen Plasmakonzentration reichen, einschließlich einer Dosis der klinisch wirksamen therapeutischen Plasmakonzentration.
  6. Verdünnen Sie die Arzneimittel in Dimethylsulfoxid, lagern Sie sie als Stammlösungen bei -20 °C und verdünnen Sie sie dann in HBSS auf die gewünschten Konzentrationen.
  7. Führen Sie vor der Anwendung des Arzneimittels grundlegende elektrophysiologische Messungen durch, wie in Abschnitt 5 beschrieben. Sobald die Medikamente aufgetragen wurden, machen Sie mindestens 30 Minuten später elektrophysiologische Aufzeichnungen für chronische Untersuchungen. In den folgenden Abschnitten finden Sie Informationen zur optischen Datenerfassung und -analyse.

5. Optische Kartierung mittels genetisch kodiertem Calciumindikator (GECI)

  1. Plattenkommerziell erhältliche oder MACS-gereinigte hiPSC-CMs, wie oben beschrieben, unter Verwendung von MECM-beschichteten 96-Well-Platten zur Herstellung reifer hiPSC-CMs. Um konfluente Monoschichten zu bilden, Platte 7,5 × 104 CMs pro Vertiefung jeder 96-Well-Platte. Verwenden Sie Beschichtungsmedium.
  2. Nach 48 h im Beschichtungsmedium auf Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium umstellen.
  3. An Tag 4 nach dem Auftauen und erneuten Auftauen wird rekombinantes Adenovirus zur Expression von GCaMP6m (AdGCaMP6m) zu den Zellen bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) = 5 hinzugefügt. Fügen Sie das Virus mit einem CM-Assay-Medium hinzu.
    HINWEIS: Hier wurden Experimente mit GCaMP6m in iCell 2-Kardiomyozyten eines kommerziellen Anbieters durchgeführt.
  4. Entfernen Sie an Tag 5 das adGCaMP6m-Medium und ersetzen Sie es durch frisches RPMI+B27 (Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium).
  5. Beobachten Sie an Tag 7 die CMs mit Hilfe der Mikroskopie oder des optischen Mapping-Imagers, um spontane Kontraktionen und entsprechende Kalziumtransienten zu visualisieren.
  6. An Tag 7 oder später werden für das Medikationsscreening 96-Well-Platten mit reifen hiPSC-CM-Monolagen, die GCaMP6m exprimieren, direkt aus dem Inkubator in den optischen Mapping-Imager übertragen, um die Baseline-Datenerfassung zu erfassen.
  7. Nach der elektrophysiologischen Datenerfassung werden die Platten der CMs zur Messung zu einem späteren Zeitpunkt in den Inkubator für Gewebekulturen zurückgebracht.
  8. Wenden Sie die Medikamente nach den Baseline-Aufzeichnungen mit mindestens vier Dosen jedes Medikaments und mindestens sechs Vertiefungen pro Dosis an. Bringen Sie die Medikamente vor der Datenerfassung mindestens 30 Minuten lang auf die Zellen. Erwärmen Sie die Well-Temperatur vor und während der Datenerfassung auf ~37 °C.
  9. Nach den Baseline-Aufzeichnungen einer gesamten Platte wird Isoproterenol (500 nM) zu jeder Vertiefung hinzugefügt, um robuste Daten zum Ansprechen auf das Arzneimittel zu erhalten. Quantifizieren Sie die Auswirkungen von Isoproterenol auf die Monolagen-Schwebungsrate, die Kontraktionsamplitude (transiente Calciumamplitude) und die transiente Calciumdauer (siehe Abbildung 6), wie in Abschnitt 5 beschrieben.

6. Erfassung optischer Kartierungsdaten und Analyse

  1. Stellen Sie sicher, dass die Kamera, der Transilluminator und die Plattenheizung des optischen Kartierungsgeräts eingeschaltet sind.
  2. Öffnen Sie die Erfassungssoftware und bestimmen Sie den Speicherort der Datei.
  3. Öffnen Sie die vordere Schublade und positionieren Sie die Platte auf der Plattenheizung.
  4. Erfassen Sie einen Dark Frame, indem Sie auf die Schaltfläche Dark Frame klicken.
  5. Wählen Sie Dauer (10-30 s) und Bildrate der Aufnahme (z. B. 100 fps; 250 fps für eine höhere zeitliche Auflösung) und klicken Sie auf Aufnahme starten.
  6. Öffnen Sie die Analysesoftware, und wählen Sie auf der Registerkarte Importieren/Filtern entweder Nach einer einzelnen Datei suchen oder Mehrere kacheln , um eine Platte zu rekonstruieren.
  7. Wählen Sie Parametermodus (APD oder CaTD), geben Sie Abstand pro Pixel ein und verwenden Sie den Well-Assistenten , um die Position der Wells im Bild zu bestimmen. Klicken Sie auf Speichern verarbeiten , um zur nächsten Registerkarte zu wechseln.
  8. Öffnen Sie die Registerkarte ROIs (Regions of Interest) und wählen Sie, ob Sie die ROIs manuell, automatisch oder überhaupt keine ROIs verwenden zeichnen möchten, wodurch dann der gesamte Brunnen für die Analyse berücksichtigt wird. Nachdem Sie die ROIs ausgewählt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Verarbeiten/Speichern, um zum nächsten Schritt zu gelangen. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Vertiefungen ausblenden und Nur gefilterte anzeigen, um die ROIs zu visualisieren.
  9. Öffnen Sie die Registerkarte " Analyse" und wählen Sie oben rechts auf dem Bildschirm jedes Well oder jeden ROI aus, um die Genauigkeit der automatischen Beat-Erkennung zu bestätigen. Füge Beats zu den Spuren hinzu oder entferne sie , indem du auf "Beat hinzufügen" bzw. "Beats speichern" drückst oder indem du einen einzelnen Beat auswählst und die Entf-Taste auf der Tastatur drückst.
  10. Optional können Sie die Funktion "Durchschnittliche Heatmaps" verwenden, um Heatmaps ausgewählter Parameter für die Platte zu erstellen.
  11. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zeit-Raum-Diagramm auf der Registerkarte Analyse , um die Daten für jedes Bohrloch oder den ROI zu visualisieren. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Beat-Erkennung korrekt ist, fahren Sie mit der Registerkarte Exportieren fort und wählen Sie Dateiformat. Klicken Sie auf Exportieren und erstellen Sie einen Ordner, in den die Daten exportiert werden sollen. Fahren Sie mit dem Öffnen der Datendateien fort und führen Sie die ausgewählte statistische Analyseroutine aus.
    HINWEIS: .xlxs-Dateien werden bevorzugt, da alle Parameter in eine einzige Datei exportiert werden. Andere Formate (.csv oder .tsv) generieren eine Datei pro Parameter.

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Ergebnisse

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hiPSC-CM-Reifung durch Phasenkontrast und konfokale Immunfluoreszenzbildgebung
Der Zeitplan für die ECM-vermittelte Reifung kommerziell erhältlicher hiPSC-CMs unter Verwendung von MECM-beschichteten 96-Well-Platten ist in Abbildung 1A dargestellt. Diese Daten werden mit kommerziell erhältlichen Kardiomyozyten gesammelt, die als kryokonservierte Zellfläschchen ins Labor kommen. Jede Durchstechflasche enthält >5 × 106 lebensfähige Kardiomyozyten. Die Zellen si...

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Diskussion

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Es gibt verschiedene Ansätze für das In-vitro-Kardiotoxizitätsscreening mit hiPSC-CMs . In einem kürzlich veröffentlichten "Best Practices"-Artikel über die Verwendung von hiPSC-CMs wurden die verschiedenen In-vitro-Assays , ihre primären Messwerte und vor allem die Granularität jedes Assays zur Quantifizierung der elektrophysiologischen Funktion des menschlichen Herzensvorgestellt 20. Neben der Verwendung von Membran-Piercing-Elektroden liefern VSDs das direkteste Maß für die el...

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Offenlegungen

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TJH ist Berater und wissenschaftlicher Berater von StemBioSys, Inc. TB ist ein Mitarbeiter von StemBioSys, Inc. AMR und JC sind ehemalige Berater von StemBioSys, Inc. TJH, TB, AMR und JC sind Aktionäre von StemBioSys, Inc.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse HL148068-04 und R44ES027703-02 (TJH) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin EDTAGibco25200-056
0,5 mg/ml BSA (7,5 &μ; mol/L)Millipore SigmaA3294
2,9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mVector biolabs1909
Albumin humanSigmaA9731-1G
alpha Actinin AntikörperThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbistatinSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/Ahttps://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021LC Laboratoriesc-6556
Clear Assay Medium (Fluorobrit)ThermoFisherA1896701Für Adenovirus Transduktion
DAPIThermoFisher62248
DMEM:F12Gibco11330-032
FBS (Fötales Rinderserum)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
iCell CM PflegemediumFUJIFILM/Cellular DynamicsM1003
iCell2 CMsFUJIFILM1434
Incucyte Zoom Sartorius
iPS DF19-9-11T. HWiCell
IsoproterenolMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
L-Ascorbinsäure 2-phosphat SesquimagnesiumsalzhydratSigmaA8960-5g
L-GlutaminGibcoA2916801
LS SäulenMiltenyii Biotec130-042-401
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker RedThermoFisherM7512
Nautilus HTS Optical Mapping CuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R KonfokalmikroskopNikon
nicht-essentielle AminosäurenGibco11140-050
VorabscheidungsfilterMiltenyii Biotec130-041-407
PSC-abgeleitetes Kardiomyozyten-Isolationskit, humanMiltenyii Biotec130-110-188
PulseCuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS Separator (Magnet)Miltenyii Biotec130-091-051
RetinsäureSigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamin)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
TnI Antikörper (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Versen (Ethylendiamintetraessigsäure - EDTA-Lösung)Gibco15040-066
Y-27632 DihydrochloridTocris1254
β-mercaptoethanolGibco21985023

Referenzen

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