Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Detección de cardiotoxicidad de alto rendimiento utilizando monocapas maduras de cardiomiocitos derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64364
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1
1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

Summary

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) ofrecen una alternativa al uso de animales para la detección preclínica de cardiotoxicidad. Una limitación para la adopción generalizada de hiPSC-CM en la detección de toxicidad preclínica es el fenotipo inmaduro de las células. Aquí se presentan protocolos para la maduración robusta y rápida de hiPSC-CM.

Abstract

Los cardiomiocitos derivados de células madre inducidas humanas (hiPSC-CM) se utilizan para reemplazar y reducir la dependencia de animales y células animales para pruebas preclínicas de cardiotoxicidad. En formatos monocapa bidimensionales, los hiPSC-CM recapitulan la estructura y función de las células del músculo cardíaco humano adulto cuando se cultivan en una matriz extracelular óptima (ECM). Una ECM (matriz extracelular inductora de maduración-MECM) derivada de células madre perinatales humanas madura la estructura, función y estado metabólico de hiPSC-CM en 7 días después de la placa.

Las monocapas maduras de hiPSC-CM también responden como se espera a los medicamentos clínicamente relevantes, con un riesgo conocido de causar arritmias y cardiotoxicidad. La maduración de las monocapas hiPSC-CM fue un obstáculo para la adopción generalizada de estas valiosas células para la ciencia regulatoria y la detección de seguridad, hasta ahora. Este artículo presenta métodos validados para el recubrimiento, la maduración y el fenotipado funcional de alto rendimiento de la función electrofisiológica y contráctil de hiPSC-CM. Estos métodos se aplican a los cardiomiocitos purificados disponibles comercialmente, así como a los cardiomiocitos derivados de células madre generados internamente utilizando protocolos de diferenciación altamente eficientes y específicos de la cámara.

La función electrofisiológica de alto rendimiento se mide utilizando colorantes sensibles al voltaje (VSD; emisión: 488 nm), fluoróforos sensibles al calcio (CSF) o sensores de calcio codificados genéticamente (GCaMP6). Se utiliza un dispositivo de mapeo óptico de alto rendimiento para las grabaciones ópticas de cada parámetro funcional, y se utiliza un software dedicado personalizado para el análisis de datos electrofisiológicos. Los protocolos MECM se aplican para la detección de medicamentos utilizando un inotrópico positivo (isoprenalina) y bloqueadores específicos del canal del gen humano relacionado con Ether-a-go-go (hERG). Estos recursos permitirán a otros investigadores utilizar con éxito hiPSC-CM maduros para la detección de cardiotoxicidad preclínica de alto rendimiento, pruebas de eficacia de medicamentos cardíacos e investigación cardiovascular.

Introduction

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) han sido validados a escala internacional y están disponibles para el cribado de cardiotoxicidad in vitro 1. Los hiPSC-CM de alta pureza pueden generarse en cantidades prácticamente ilimitadas, criopreservarse y descongelarse. Al rechapar, también se reaniman y comienzan a contraerse con un ritmo que recuerda al corazón humano 2,3. Sorprendentemente, los hiPSC-CM individuales se acoplan entre sí y forman una sincitia funcional que late como un solo tejido. Hoy en día, las hiPSCs se derivan rutinariamente de muestras de sangre de pacientes, por lo que cualquier persona puede ser representada utilizando ensayos de detección de cardiotoxicidad hiPSC-CM in vitro 4,5. Esto crea la oportunidad de realizar "Ensayos Clínicos en un Plato", con representación significativa de diversas poblaciones6.

Una ventaja crítica sobre los enfoques existentes de detección de cardiotoxicidad de células animales y animales es que los hiPSC-CM utilizan el genoma humano completo y ofrecen un sistema in vitro con similitudes genéticas con el corazón humano. Esto es especialmente atractivo para la farmacogenómica y la medicina personalizada: se prevé que el uso de hiPSC-CM para el desarrollo de medicamentos y otras terapias proporcionará prescripciones de medicamentos más precisas, precisas y seguras. De hecho, los ensayos bidimensionales (2D) de monocapa hiPSC-CM han demostrado ser predictivos de cardiotoxicidad de medicamentos, utilizando un panel de medicamentos clínicamente utilizados con un riesgo conocido de causar arritmias 1,7,8,9. A pesar del vasto potencial de los hiPSC-CM y la promesa de racionalizar y abaratar el desarrollo de fármacos, ha habido una renuencia a utilizar estos nuevos ensayos10,11,12.

Hasta ahora, una limitación importante de la adopción y aceptación generalizadas de los ensayos de detección de hiPSC-CM es su apariencia inmadura, similar a la fetal, así como su función. El tema crítico de la maduración de hiPSC-CM ha sido revisado y debatido en la literatura científica hasta la saciedad13,14,15,16. Del mismo modo, se han empleado muchos enfoques para promover la maduración de hiPSC-CM, incluyendo manipulaciones de matriz extracelular (ECM) en monocapas 2D y el desarrollo de tejidos cardíacos diseñados en 3D (EHT)17,18. Por el momento, existe la creencia generalizada de que el uso de EHT 3D proporcionará una maduración superior en relación con los enfoques basados en monocapa 2D. Sin embargo, las monocapas 2D proporcionan una mayor eficiencia de utilización celular y un mayor éxito en el recubrimiento en comparación con los EHT 3D; Los EHT 3D utilizan un mayor número de células y, a menudo, requieren la inclusión de otros tipos de células que pueden confundir los resultados. Por lo tanto, en este artículo, la atención se centra en el uso de un método simple para madurar hiPSC-CM cultivados como monocapas 2D de células acopladas eléctrica y mecánicamente.

La maduración avanzada de hiPSC-CM se puede lograr en monocapas 2D utilizando un ECM. Las monocapas 2D de hiPSC-CM pueden madurarse utilizando un cubreobjetos de polidimetilsiloxano suave y flexible, recubierto con una matriz de membrana basal secretada por una célula de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de ratón). En 2016, los informes mostraron que los hiPSC-CM cultivados en esta condición de ECM blanda maduraron funcionalmente, mostrando velocidades de conducción potenciales de acción cercanas a los valores cardíacos adultos (~ 50 cm / s)18. Además, estos hiPSC-CM maduros mostraron muchas otras características electrofisiológicas que recuerdan al corazón adulto, incluido el potencial de membrana en reposo hiperpolarizado y la expresión de Kir2.1. Más recientemente, los informes identificaron un recubrimiento ECM derivado de células madre perinatales humanas que promueve la maduración estructural de 2D hiPSC-CMs19. Aquí, se presentan métodos fáciles de usar para monocapas 2D hiPSC-CM estructuralmente maduras para su uso en pantallas electrofisiológicas de alto rendimiento. Además, proporcionamos validación de un instrumento de mapeo óptico para la adquisición y análisis automatizados de la función electrofisiológica monocapa 2D hiPSC-CM, utilizando colorantes sensibles al voltaje (VSD) y sondas y proteínas sensibles al calcio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

El uso de hiPSC en este protocolo fue aprobado por el Comité HPSCRO de la Universidad de Michigan (Comité de Supervisión de Células Madre Pluripotentes Humanas). Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de materiales y equipos. Ver Tabla 1 para los medios y sus composiciones.

1. Descongelación y recubrimiento de hiPSC-CM criopreservados disponibles comercialmente para la maduración en una matriz extracelular inductora de maduración (MECM)

  1. Calentar todos los reactivos a temperatura ambiente y rehidratar las placas MECM con solución salina balanceada de Hank (HBSS) o solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga calcio y magnesio, durante 1 h antes del recubrimiento de cardiomiocitos (200 μL de tampón por pocillo de una placa de 96 pocillos).
  2. Lave las placas MECM 2x con HBSS o PBS que contengan calcio y magnesio durante 1 h antes del recubrimiento de cardiomiocitos (200 μL de tampón por pocillo de una placa de 96 pocillos) y mantenga los pocillos hidratados.
  3. Preparar un baño maría a 37 °C.
  4. Retire los tubos de cardiomiocitos del tanque de nitrógeno líquido, transfiera los tubos a hielo seco y abra ligeramente las tapas del tubo para liberar presión.
    NOTA: ¡Liberar presión en los tubos es extremadamente importante! Si se acumula demasiada presión dentro de los tubos, podrían explotar.
  5. Vuelva a sellar las tapas de los tubos y colóquelos en el baño de agua para descongelar durante 4 minutos.
    NOTA: Deje que se descongelen completamente, para evitar el daño celular debido a la descongelación parcial.
  6. Después de que las células se descongelen, rocíe los tubos con etanol al 70% antes de abrirlos. Transfiera las células en tubos cónicos de 15 ml con una pipeta de 1 ml. Gotea lentamente 8 ml de medio de recubrimiento, agitando el tubo cada vez que se agrega 1 ml, para permitir que las células se ajusten a los cambios en la osmolaridad.
    1. Lave el criovial con 1 ml de medio de recubrimiento con una pipeta de vidrio de 1 ml. Luego, gotee lentamente el lavado en el tubo cónico de 15 ml.
  7. Centrifugar los tubos a ~300 × g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio de recubrimiento. Retire una alícuota y realice el recuento de células vivas con un hemocitómetro. Añadir un medio de recubrimiento adicional para obtener 7,5 × 105 células/ml.
    NOTA: Se requieren aproximadamente 10 ml de suspensión celular para preparar 96 pocillos.
  8. Dispensar 100 μL de suspensión celular por pocillo de una placa de 96 pocillos recubierta con MECM utilizando una pipeta multicanal.
    NOTA: Asegúrese de evitar la precipitación celular y obtener una densidad celular uniforme en todos los pozos durante el enchapado.
  9. Incubar las células a 37 °C, 5% deCO2 durante 2 días antes de cambiar el medio a medio de mantenimiento (200 μL/pocillo). Cambie el medio de mantenimiento el día 5 después de la descongelación. Realizar ensayos de electrofisiología el día 7 o más tarde, como se describió anteriormente 8,9. Cambie el medio cada dos días cuando opte por extender el cultivo celular.

2. Diferenciación dirigida al corazón hiPSC y purificación de hiPSC-CM

  1. Solución caliente 1x de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) disponible comercialmente, HBSS sin calcio y magnesio (HBSS--), y placas de 6 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal solubilizada secretada por una célula de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de ratón) a temperatura ambiente.
  2. Marque las colonias diferenciadas mediante microscopía de contraste de fase y aspirado/ablación. Lave cada pocillo con 1 ml de HBSS--. Realice dos lavados en pozos que contengan >10 puntos de diferenciación.
  3. Aspire el HBSS y agregue 1 ml de solución de EDTA a cada pocillo. Incubar las placas durante un máximo de 5 min a 37 °C. Revise las placas después de 3 minutos y busque colonias blancas translúcidas y visibles.
  4. Aspire la solución de EDTA y agregue 1 ml a un solo pocillo. Desaloje las células con 2 ml de medio hiPSC pipeteando la suspensión hacia arriba y hacia abajo repetidamente, usando una pipeta de vidrio de 10 ml para separar todas las células madre del pozo y transfiera la suspensión celular a un tubo de recolección. Repita la aspiración y el desalojo con pozos posteriores.
    NOTA: Desaloje las colonias difíciles de levantar con la punta de la pipeta de vidrio.
  5. Cuente las células madre y ajuste el volumen a la placa 8.0 × 105 células/pocillo. Cultivar las células en medio hiPSC (2 mL/pocillo) hasta que las células madre alcancen el 90% de confluencia (esta vez se denomina a partir de ahora D0).
  6. Preparar 2 mL de medio de diferenciación basal suplementado con 4 μM de CHIR99021.
  7. En D0, lave cada pocillo de una placa de 6 pocillos de células madre con 1 ml de HBSS por pocillo. Sustituir el HBSS por medio de diferenciación basal suplementado con 4 μM de CHIR99021.
  8. En D1, no hagas nada.
  9. En D2, preparar un medio de diferenciación basal suplementado con 4 μM de IWP4.
  10. Reemplace el medio con 2 ml de medio de diferenciación basal suplementado con IWP4 por pocillo.
  11. En D3, no hacer nada para una diferenciación ventricular específica. Para una diferenciación auricular específica, aspirar el medio y añadir 2 ml de medio basal suplementado con 4 μM de IWP4 y 1 μM de solución de ácido retinoico (AR) por pocillo.
  12. En D4, aspirar el medio y añadir 2 mL de medio basal por pocillo para la diferenciación ventricular. Para una diferenciación auricular, aspirar el medio y añadir 2 ml de medio basal suplementado con 1 μM de solución de AR por pocillo.
  13. En D5, no hagas nada.
  14. En D6, aspirar el medio y añadir 2 ml de medio basal por pocillo (para diferenciación auricular y ventricular).
  15. En D7, no hagas nada.
  16. En D8, aspirar el medio y añadir 2 mL de medio de mantenimiento de cardiomiocitos. Cambie el medio cada dos días hasta la separación celular, o siga un plan de exposición crónica a medicamentos.

3. purificación hiPSC-CM a través de MACS (clasificación celular activada magnéticamente)

  1. Aspirar el medio de cultivo celular y lavar cada pocillo con 1 ml de HBSS--. Disociar las células añadiendo 1 mL de tripsina/EDTA al 0,25% e incubando a 37 °C, 5% deCO2 durante 10 min. Resuspender y singularizar las células en cada pocillo con 2 mL de medio de recubrimiento para inactivar la tripsina/EDTA.
  2. Recolectar las células de los seis pocillos en un tubo cónico de 50 ml con un colador de 70 μm. Luego, lave el colador con 3 ml de medio de recubrimiento. Cuenta las celdas.
  3. Centrifugar la suspensión a ~300 × g durante 5 min. Aspire el sobrenadante y lave las células con 20 ml de tampón de separación MACS helado. Luego, centrifugar nuevamente a ~ 300 × g durante 5 min.
  4. Resuspender el pellet en 80 μL de tampón de separación MACS frío por 5 × 106 células. Añadir 20 μL de cóctel frío de agotamiento no cardiomiocitario (humano) por 5 × 106 células. Mezclar suavemente la suspensión celular e incubar en hielo durante 10 min.
  5. Lave la muestra añadiendo 4 ml de tampón de separación MACS frío por 5 × 106 células. Centrifugar la muestra a ~300 × g durante 5 min y aspirar el sobrenadante.
  6. Resuspender el pellet en 80 μL de tampón de separación MACS frío por 5 × 106 células. Añadir 20 μL de microperlas antibiotina frías por 5 × 106 células. Mezclar suavemente la suspensión celular e incubar durante 10 minutos en hielo.
  7. Mientras las muestras se están incubando, coloque las columnas de agotamiento positivo (equipadas con los filtros de preseparación de 30 μm) en el separador MACS y coloque los tubos de recolección de 15 ml etiquetados debajo de las columnas. Se necesita una columna por cada 5 × 106 celdas.
  8. Prepare cada columna con 3 ml de tampón de separación MACS frío. Mezclar la suspensión celular tratada con anticuerpos con 2 ml de tampón de separación MACS por 5 × 106 células, y añadir a la columna.
    NOTA: ¡No centrifugar! La centrifugación en este paso tiene efectos perjudiciales sobre el rendimiento de los cardiomiocitos.
  9. Agregue 2 ml de tampón de separación MACS a cada columna y recoja el flujo hasta que se recojan 12 ml de suspensión de cardiomiocitos de flujo continuo.
    NOTA: Nunca permita que las columnas se sequen completamente.
  10. Centrifugar los cardiomiocitos a ~300 × g durante 5 min, desechar el sobrenadante y suspender los cardiomiocitos en 1 ml de medio de recubrimiento.
  11. Cuente las celdas para determinar la concentración, ajuste el volumen a la densidad de siembra deseada y coloque las celdas. Colocar en placa los cardiomiocitos purificados en las placas MECM de 96 pocillos, como se describió anteriormente en los pasos 1.9-1.11 (7,5 × 105 células/pocillo).

4. Mapeo óptico utilizando colorantes sensibles al voltaje (VSD) y fluoróforos sensibles al calcio (CSF)

  1. Preparar la cantidad adecuada de CIV en HBSS con calcio y magnesio, añadiendo 1 μL de colorante VSD por ml de HBSS y 10 μL de adyuvante de carga por ml de HBSS.
    NOTA: Normalmente, una placa de 96 pocillos requiere 10 ml de solución VSD.
  2. Alternativamente, prepare HBSS con calcio y magnesio suplementado con 5 μM de LCR. Aspirar el medio de mantenimiento de cardiomiocitos y reemplazar con 100 μL de CIV o LCR por pocillo de una placa de 96 pocillos. Incubar las células durante 30 minutos en la incubadora de cultivo celular.
  3. Retire los tintes y reemplácelos con medio de ensayo o HBSS. Equilibre a 37 °C para la adquisición de mapas ópticos de datos de referencia con un dispositivo de mapeo óptico de alto rendimiento.
  4. Trate las células con medicamentos para pruebas de exposición aguda, o mapee las células que fueron expuestas crónicamente a medicamentos de interés.
  5. Para pruebas de cardiotoxicidad en placas de 96 pocillos, use cuatro dosis de un compuesto con al menos seis pocillos por dosis. Use dosis que oscilen entre abajo y por encima de la concentración plasmática terapéutica efectiva, incluida una dosis de la concentración plasmática terapéutica clínica efectiva.
  6. Diluir los medicamentos en dimetilsulfóxido, almacenarlos como soluciones madre a -20 °C y luego diluirlos en HBSS a las concentraciones deseadas.
  7. Realizar mediciones electrofisiológicas basales antes de la aplicación del fármaco, como se describe en la sección 5. Una vez que se hayan aplicado los medicamentos, realice registros electrofisiológicos al menos 30 minutos más tarde para estudios crónicos. Consulte las siguientes secciones para conocer los procedimientos de adquisición y análisis de datos de mapeo óptico.

5. Mapeo óptico utilizando indicador de calcio codificado genéticamente (GECI)

  1. Placas disponibles comercialmente o hiPSC-CM purificadas por MACS, como se describió anteriormente, utilizando placas de 96 pocillos recubiertas con MECM para hacer hiPSC-CM maduras. Para formar monocapas confluentes, placa 7.5 × 104 CMs por pocillo de cada placa de 96 pocillos. Utilice el medio de chapado.
  2. Después de 48 h en el medio de recubrimiento, cambie al medio de mantenimiento de cardiomiocitos.
  3. El día 4 después de la descongelación y el replacado, agregue adenovirus recombinante para expresar GCaMP6m (AdGCaMP6m) a las células en una multiplicidad de infección (MOI) = 5. Agregue el virus usando el medio de ensayo CM.
    NOTA: Aquí, se realizaron experimentos con GCaMP6m en cardiomiocitos iCell2 de un proveedor comercial.
  4. El día 5, retire el medio adGCaMP6m y reemplácelo con RPMI + B27 nuevo (medio de mantenimiento de cardiomiocitos).
  5. El día 7, observe los CM utilizando microscopía o el generador de imágenes de mapeo óptico, para visualizar las contracciones espontáneas y los transitorios de calcio correspondientes.
  6. El día 7 o más tarde, para la detección de medicamentos, transfiera directamente placas de 96 pocillos de monocapas hiPSC-CM maduras que expresan GCaMP6m al generador de imágenes de mapeo óptico desde la incubadora para la adquisición de datos de referencia.
  7. Después de la adquisición de datos electrofisiológicos, devolver las placas de los CM a la incubadora de cultivo de tejidos, para mediciones en un punto de tiempo posterior.
  8. Después de los registros de referencia, aplique los medicamentos, usando al menos cuatro dosis de cada medicamento y al menos seis pocillos por dosis. Equilibre los medicamentos en las células durante al menos 30 minutos antes de la recopilación de datos. Caliente la temperatura del pozo a ~37 °C antes y durante la adquisición de datos.
  9. Después de los registros de referencia de una placa completa, agregue isoproterenol (500 nM) a cada pocillo para permitir datos sólidos de respuesta al medicamento. Cuantificar los efectos de isoproterenol sobre la frecuencia de latido monocapa, la amplitud de contracción (amplitud transitoria de calcio) y la duración transitoria del calcio (ver figura 6), como se describe en la sección 5.

6. Adquisición de datos y análisis de mapeo óptico

  1. Asegúrese de que la cámara del dispositivo de mapeo óptico, el transiluminador y el calentador de placas estén encendidos.
  2. Abra el software de adquisición y determine la ubicación de guardado del archivo.
  3. Abra el cajón frontal y coloque la placa en el calentador de placas.
  4. Adquiera un marco oscuro haciendo clic en el botón Marco oscuro .
  5. Seleccione Duración (10-30 s) y Velocidad de fotogramas de adquisición (por ejemplo, 100 fps; 250 fps para una resolución temporal más alta) y haga clic en Iniciar adquisición.
  6. Abra el software de análisis y, en la pestaña Importar/Filtrar , seleccione Buscar un solo archivo o Teselas múltiples para reconstruir una placa.
  7. Seleccione Modo de parámetro (APD o CaTD), introduzca Distancia por píxel y utilice el Asistente para pozos para determinar la ubicación de los pozos en la imagen. Haga clic en Procesar guardar para pasar a la siguiente pestaña.
  8. Abra la pestaña ROI (regiones de interés) y elija dibujar los ROI manualmente, automáticamente o no usar ROI en absoluto, que luego considerarían todo bien para el análisis. Después de seleccionar los ROI, haga clic en el botón Procesar/Guardar para pasar al siguiente paso. Marque las casillas Ocultar pozos y Mostrar solo filtros para visualizar los ROI.
  9. Abra la pestaña Análisis y, en la parte superior derecha de la pantalla, seleccione cada pozo o ROI para confirmar la precisión de la detección automática de latidos. Agregue o elimine ritmos de los rastros presionando Agregar ritmo / Guardar ritmos, o seleccionando un ritmo individual y presionando Eliminar en el teclado.
  10. Opcionalmente, utilice la función Mapas de calor promedio para crear mapas de calor de los parámetros seleccionados para la placa.
  11. Haga clic en el botón Diagrama espacio-temporal en la pestaña Análisis para visualizar los datos de cada pozo o el ROI. Después de asegurarse de que la detección de latido sea precisa, vaya a la pestaña Exportar y seleccione Formato de archivo. Pulse Exportar y cree una carpeta a la que se exportarán los datos. Proceda a abrir archivos de datos y ejecute la rutina de análisis estadístico elegida.
    NOTA: Se prefieren los archivos .xlxs ya que todos los parámetros se exportan en un solo archivo; Otros formatos (.csv o .tsv) generan un archivo por parámetro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Maduración de hiPSC-CM caracterizada por contraste de fase e imágenes confocales inmunofluorescentes
La línea de tiempo para la maduración mediada por ECM de hiPSC-CM disponibles comercialmente utilizando placas de 96 pocillos recubiertas con MECM se presenta en la Figura 1A. Estos datos se recopilan utilizando cardiomiocitos disponibles comercialmente que llegan al laboratorio como viales criopreservados de células. Cada vial contiene >5 × 106 cardiomiocitos viables. Las células son ~ 98% puras y rigurosamente probadas para el control de calidad (se proporciona un certificado de análisis con cada vial). El alto número de CM permite descongelar y chapar los CM en diferentes combinaciones de ECM utilizando el mismo lote de celdas. En la Figura 1, los hiPSC-CM están chapados en placas recubiertas de ECM o MECM de ratón. Los hiPSC-CM chapados en el MECM maduran y se vuelven estructuralmente distintos del mismo lote de hiPSC-CM rechapados en el ECM del ratón. Es decir, las células maduras se vuelven en forma de varilla, mientras que las células inmaduras conservan una forma circular. Esto se puede ver en imágenes de contraste de fase y al teñir los miofilamentos cardíacos (Figura 1B; troponina I [TnI], rojo). En la Figura 2 se presenta una validación más extensa de la maduración estructural de los hiPSC-CM. Un amplio campo de visión (objetivo 20x) de CMs teñidos con anticuerpos α-actinina muestra la forma típica de las células cultivadas en cada condición de ECM. α-actinina es una proteína estructural crítica dispuesta con un espaciamiento regular en los miofilamentos cardíacos. De acuerdo con la tinción de TnI en la Figura 1, la tinción de α-actinina indica además la maduración de los hiPSC-CM cultivados en el MECM. Además de promover un fenotipo maduro en forma de varilla, el MECM también induce una mayor organización del sarcómero (imágenes 60x). El contenido mitocondrial y la actividad también son distintos entre las células cultivadas en la ECM de ratón y el MECM (Figura 2B). El contenido mitocondrial de hiPSC-CM inmaduro fetal se limita al espacio perinuclear, encontrándose pocas mitocondrias en el citosol. En contraste, el contenido mitocondrial maduro de hiPSC-CMs se distribuye por toda la célula. La evaluación mitocondrial utiliza un protocolo establecido19.

Diferenciación dirigida al corazón hiPSC y especificación de la cámara cardíaca
Aquí se proporciona un protocolo para la producción interna y la maduración de hiPSC-CM purificados y específicos de la cámara (Figura 3A). Esto se basa en un informe publicado anteriormente20. Se presentan procedimientos detallados para la purificación de hiPSC-CM utilizando un kit de clasificación de células activadas por imán (MACS) disponible comercialmente. Recientemente validamos el uso de la purificación de MACS y mostramos los beneficios del uso de MACS en comparación con la purificación de hiPSC-CM basada en el metabolismo; típicamente, se anticipa una pureza de hiPSC-CM superior al 95%21. Es importante señalar que si el contenido inicial de CM es <50%, la purificación de MACS puede alcanzar solo ~ 85%. En estos casos, el enriquecimiento de CM puede ser necesario después del agotamiento de los no CM. Si el contenido inicial de CM de la diferenciación es del >50%, el agotamiento de los no CM de la población celular utilizando el kit MACS puede alcanzar una pureza >95%; en este caso, no es necesario el enriquecimiento adicional o la selección positiva de CM. Los hiPSC-CM específicos de la cámara también se pueden madurar utilizando placas de 96 pocillos recubiertas con MECM, como se describe anteriormente y se muestra en la Figura 1 y la Figura 2. Se debe esperar que las células auriculares específicas (hiPSC-ACM) tengan una frecuencia de latido espontánea significativamente más rápida y una duración potencial de acción más corta 80 (APD80) que las células ventriculares específicas (hiPSC-VCM). Estos son datos electrofisiológicos típicos para potenciales de acción registrados utilizando VSD y el sistema de mapeo óptico (Figura 3B-D).

Mapeo óptico electrofisiológico cardíaco de alto rendimiento
El rigor científico aumenta drásticamente para cualquier ensayo si se puede llevar a cabo de una manera de alto rendimiento. Los datos de detección de cardiotoxicidad se presentan en la Figura 4, Figura 5, Figura 6 y Figura 7, que muestran una detección electrofisiológica de alto rendimiento utilizando monocapas maduras de hiPSC-CM en una placa de 96 pocillos. Los mapas de calor de placa completa para parámetros como APD80 (Figura 4A) revelan la reproducibilidad de un parámetro dado dentro de una placa de pozo a pozo. Además, los mapas de calor de placa completa proporcionan un examen rápido de cualquier valor atípico en el conjunto de datos. Por ejemplo, en el pozo E4 de la placa presentada en la Figura 4A, está claro que este pozo tiene un valor APD80 mucho mayor, indicado por el pozo que aparece amarillo, mientras que los otros pozos son azul índigo. Los potenciales de acción típicos de las monocapas 2D maduras de hiPSC-CM (Figura 4B) recuerdan la morfología del potencial de acción de los cardiomiocitos adultos aislados y probados en cultivo. Además, en la Figura 4C se muestra un ritmo espontáneo potencial de acción típico. Los datos de la Figura 4C son una gráfica espacio-temporal de la fila A, columnas 1-12. La línea blanca a través del mapa de placas en la Figura 4A muestra esto. Cada destello fluorescente brillante a lo largo del tiempo en cada pocillo representa una única activación espontánea. La Figura 5 y la Figura 6 muestran la utilidad de utilizar el indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) GCaMP6m para medir los transitorios de calcio intracelular; La figura 6 también muestra la respuesta esperada al isoproterenol, el inotrópico cardíaco positivo clásico. En respuesta al isoproterenol, la activación de los receptores β1-adrenérgicos causa cronotropía positiva (Figura 6A), inotropía positiva (Figura 6B) y lusitropía positiva (Figura 6C). Estas respuestas al isoproterenol indican la maduración significativa de los receptores β1-adrenérgicos hiPSC-CM y las cascadas de señalización intracelular.

En la Figura 7, se muestra la respuesta de hiPSC-CM a los bloqueadores de los canales relacionados con el gen humano Ether-a-go-go (hERG), utilizando la fluorescencia de calcio GCaMP6m para monitorear el ritmo y servir como un marcador sustituto de la contractilidad. E-4031 es un bloqueador de canales específico de hERG, que disminuye la frecuencia de latido espontáneo y aumenta la duración transitoria del calcio (CaTD80) y la triangulación (triangulación CaT). La Figura 7A muestra la detección de despolarizaciones tempranas posteriores causadas por el bloqueo del canal hERG E-4031. También se probaron otros bloqueadores de los canales hERG, incluyendo domperidona, vandetanib y sotalol, y los resultados se muestran en la figura 7E-G. Estos compuestos y dosis fueron seleccionados en base al reciente estudio de validación hiPSC-CM 1,7,9.

Figure 1
Figura 1: Cronología para la maduración rápida de hiPSC-CM criopreservados disponibles comercialmente u otras fuentes . (A) Los cardiomiocitos descongelados suspendidos en medio de recubrimiento se aplican al MECM el día 0. El día 2, el medio se reemplaza con el medio de mantenimiento, y el medio gastado se cambia el día 5. Las células se cultivan durante 2 días adicionales, y en el día 7, la sincitia madura de hiPSC-CM puede cargarse con una solución de grabación para aplicaciones posteriores o cultivarse durante períodos más largos. (B) La fase de contraste de la sincitia de los cardiomiocitos plateados en la ECM de ratón o el MECM muestran que los cardiomiocitos plateados en la ECM de ratón tienen una mayor circularidad en comparación con los cardiomiocitos plateados en el MECM; además, la inmunotinción para TnI indica que los cardiomiocitos plateados en la ECM de ratón conservan una morfología de simetría radial y sarcómeros desorganizados en contraste con los hiPSC-CM dolicomorfos y bien estructurados chapados en el MECM. Barras de escala = 100 μm (B, superior); 50 μm (B, inferior). Abreviaturas: hiPSC-CMs = cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos; ECM = matriz extracelular; MECM = ECM inductora de maduración; 96wp = placa de 96 pocillos; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TnI = troponina I. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Comparación de la organización del sarcómero de hiPSC-CMs chapadas en una ECM de ratón o un MECM. (A) Los hiPSC-CM cultivados en ECM de ratón inmunoteñidos contra α-actinina indican morfología radial, con una menor densidad de sarcómeros dispersos a través del cardiomiocitos en contraste con los hiPSC-CM del mismo lote chapados en la matriz y que presentan morfología en forma de bastoncillo (20x). (60x) La observación de hiPSC-CMs con microscopía confocal muestra que los hiPSC-CMs cultivados en una ECM de ratón tienen morfología de simetría radial, con una distribución perimetral más densa de sarcómeros y una baja densidad de sarcómeros radiales en contraste con los hiPSC-CMs del mismo lote que fueron cultivados en el MECM. Presentan una distribución homogénea de sarcómeros organizados a lo largo del eje más largo de las células. Barras de escala = 100 μm (superior); 50 μm (inferior). (B) La tinción de hiPSC-CMs cultivadas en la ECM de ratón o la MECM con un colorante mitocondrial que tiñe mitocondrias con alto potencial transmembrana muestra una menor intensidad de tinción en cardiomiocitos cultivados en la ECM de ratón en comparación con la MECM. Además, los hiPSC-CM cultivados en el MECM tienen mitocondrias distribuidas homogéneamente en los cardiomiocitos, en contraste con los hiPSC-CM cultivados en la ECM de ratón que presentan una acumulación perinuclear de mitocondrias. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: hiPSC-CMs = cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos; ECM = matriz extracelular; MECM = ECM inductora de maduración; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Producción de cardiomiocitos específicos de cámara. (A) Los protocolos para la producción de cardiomiocitos específicos de cámara comparten una manipulación idéntica de la vía de señalización Wnt, con estimulación de la señalización de Wnt por inhibición de GSK3 del día 0 al 2, y la inhibición de esta vía entre el día 2 y 4. La especificación de la cámara se logra con la activación de la vía del ácido retinoico y la manipulación de la señalización Wnt entre los días 3 y 6. (B) Como resultado de la especificación de la cámara, los cardiomiocitos auriculares presentan una tasa más rápida de despolarización espontánea en comparación con los cardiomiocitos ventriculares. (C) Los hiPSC-CM ventriculares tienen tasas de latido más lentas en comparación con los hiPSC-CM auriculares; por lo tanto, la duración del potencial de acción al 80% de la repolarización es más corta en las hiPSC-ACM en comparación con las hiPSC-VCM. Abreviaturas: hiPSC-CMs = cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos; hiPSC-ACM = cardiomiocitos inducidos por células madre pluripotentes inducidas por humanos auriculares; hiPSC-VCM = cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos ventriculares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Mapeo óptico adquirido con un dispositivo de mapeo óptico y analizado con Pulse. (A) Ejemplo de un mapa de calor para la observación holística de parámetros evaluados en una placa de 96 pocillos después de la filtración de la película y la determinación de regiones de interés en placas de 96 pocillos, mapeado con el dispositivo de mapeo óptico. En este ejemplo, un mapa de calor APD80% que indica un pozo atípico (E4) y pozos que no produjeron datos (pozos H3, 4 y 5). (B) Además, la interfaz fácil de usar permite trazar fácilmente la morfología del potencial de acción promedio de los pozos seleccionados. (C) Se dispone de herramientas adicionales de visualización de datos; en este ejemplo, un gráfico espacio-temporal generado a partir de la línea horizontal que cruza los pozos en la fila A (panel A) muestra la activación a través de una sección horizontal de cada pozo (línea blanca a través de la fila A) durante un período de 10 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Línea de tiempo para el mapeo de cambios transitorios de calcio intracelular con un indicador de calcio codificado genéticamente. El día 4 después de colocar cardiomiocitos disponibles comercialmente en una placa de 96 pocillos recubierta con MECM, como se indica en la Figura 1A, las células deben ser transducidas con 5 MOI de virus en medio de ensayo CM durante la noche. El medio se reemplaza con medio de mantenimiento CDI hasta el día 6, y se cambia a medio de mantenimiento CDI sin rojo fenol entre los días 7 y 11 para permitir la monitorización rápida o continua de los cambios transitorios de calcio intracelular con Nautilus. (B) hiPSC-CMs transducidos con AdGCaMP6f evaluados con mapeo óptico en los días 7, 9 y 10 post-descongelación indican la presencia de cambios estables de fluorescencia intracelular mediados por calcio, que permiten el mapeo óptico diario de la misma placa durante un período prolongado de tiempo sin la necesidad de reaplicar colorantes sensibles al calcio. Abreviaturas: GECI = indicador de calcio codificado genéticamente; CM = cardiomiocitos; MOI = multiplicidad de la infección; 96wp = placa de 96 pocillos; BSA = albúmina sérica bovina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Utilización rápida y fácil de mapas de calor para la comparación visual de datos adquiridos de sincitia funcional madura de hiPSC-CM con Nautilus y analizados con Pulse. (A) Los hiPSC-CM tratados con isoproterenol muestran un aumento en la velocidad de latido, según lo observado por la inspección de mapas de calor y confirmado con la prueba t pareada. (B) Del mismo modo, el mapeo de células antes y después del tratamiento con isoproterenol muestra el efecto inotrópico de la estimulación β-adrenérgica mediante la comparación visual de mapas de calor y con la prueba t pareada. (C) Por último, la utilización de mapas de calor para la comparación visual de los datos muestra lusitropía, otro efecto canónico de la estimulación β-adrenérgica, confirmado con la prueba t pareada (p < 0,0001). La ausencia de un círculo indica una falla en la adquisición / análisis de datos para ese pozo específico. Abreviaturas: hiPSC-CMs = cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos; ISO = isoproterenol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Validación del ensayo de detección de cardiotoxicidad GECI utilizando bloqueadores de los canales hERG. (A) Trazas representativas de flujo espontáneo de calcio de pocillos basales en HBSS y en presencia de 500 nM E-4031. (B-D) Cuantificación de los efectos basales y +E-4031 sobre la frecuencia de latido, la duración transitoria del calcio 80 (CaTD80) y la triangulación transitoria del calcio (triangulación CaT) respectivamente. *,** denota diferencia significativa; prueba t no pareada; p < 0,01; n = 8 en cada grupo. (E) Detección de GECI de otro bloqueador de hERG, domperidona. (F) Detección GECI del bloqueo hERG inducido por vandetanib. (G) Detección GECI del bloqueo hERG por dosis altas de sotalol. Abreviaturas: GECI = indicador de calcio codificado genéticamente; hERG = gen humano relacionado con Ether-a-go-go-go. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Medios y sus composiciones Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Existen varios enfoques diferentes para la detección de cardiotoxicidad in vitro utilizando hiPSC-CM. Un reciente documento de "Mejores prácticas" sobre el uso de hiPSC-CM presentó los diversos ensayos in vitro , sus lecturas primarias y, lo que es más importante, la granularidad de cada ensayo para cuantificar la función electrofisiológica cardíaca humana20. Además de usar electrodos perforadores de membrana, la medida más directa de la función electrofisiológica cardíaca humana es proporcionada por VSD. Las lecturas de ensayo VSD permiten la visualización directa y la cuantificación de parámetros electrofisiológicos críticos, incluida la duración del potencial de acción, la velocidad de propagación del potencial de acción, la carrera ascendente del potencial de acción, la triangulación del potencial de acción, la velocidad de latido, la regularidad del latido y las heterogeneidades de duración del potencial de acción. Del mismo modo, las sondas sensibles al calcio ofrecen información sobre el ritmo, la velocidad y la duración de los eventos de la monocapa hiPSC-CM. Las mediciones transitorias de calcio hiPSC-CM realizadas con sondas fluorescentes también proporcionan información sobre la contractilidad y la resistencia contráctil de cada contracción. Este documento proporciona métodos para el uso de hiPSC-CM maduros (placas de 96 pocillos) en ensayos de medición transitoria de calcio y VSD de alto rendimiento. Además de los métodos para el mapeo óptico, se presenta un software para el análisis de datos EP de alto rendimiento.

Los métodos descritos aquí son un avance significativo para los campos de detección de cardiotoxicidad y ciencia regulatoria. Aquí, hemos presentado métodos para la maduración rápida y el registro electrofisiológico de monocapas 2D hiPSC-CM en placas de cribado de alto rendimiento (placas de 96 pocillos). La maduración rápida utilizando un MECM (7 días) que se muestra aquí es un avance importante con respecto a los enfoques anteriores que requieren que la maduración ocurra durante 30-100 días22,23. En comparación con otros ECM, que requieren aplicación manual para cada experimento, las placas MECM están prerecubiertas con ECM y llegan al laboratorio listas para usar. Este aspecto del MECM hace que sea más fácil de usar, menos variable y más eficiente que el uso de otros recubrimientos ECM. Es importante destacar que este enfoque se puede utilizar tanto para hiPSC-CM criopreservados y disponibles comercialmente como para hiPSC-CM "caseros", que pueden ser específicos de la cámara. Debido a la estructura distinta en forma de varilla de los hiPSC-CM maduros (Figura 1 y Figura 2), es importante señalar que se requiere un mayor número de células para la formación de monocapa confluente aquí, en comparación con los protocolos que utilizan otros ECM. En particular, cuando usamos ECM de ratón (las células tienen un fenotipo de panqueque que se extiende continuamente), plateamos 50,000 hiPSC-CM por pocillo, pero cuando usamos MECM, plateamos 75,000 hiPSC-CM por pocillo. El número de CM por pocillo también puede reducirse si las células se van a utilizar para el análisis de una sola célula, como la pinza de parche o cualquier otra técnica de imagen que requiera células individuales.

Los hiPSC-CM disponibles comercialmente ofrecen ventajas para la ciencia regulatoria debido a la extensa caracterización de estas células por los esfuerzos internacionales liderados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA). Sin embargo, las células disponibles comercialmente son una mezcla de hiPSC-CM ganglionareos, auriculares y ventriculares, que proporcionan información de toxicidad altamente relevante pero carecen de las características específicas de la cámara que imitan el corazón humano. Los hiPSC-CM específicos de cámara recrean las diferencias electrofisiológicas bien conocidas entre los cardiomiocitos auriculares y ventriculares, y proporcionan un ensayo in vitro para el desarrollo de terapias antiarrítmicas específicas de cámara (Figura 3B-D). Por ejemplo, los medicamentos específicos para la fibrilación auricular ahora se pueden probar y desarrollar utilizando monocapas hiPSC-ACM chapadas en placas de 96 pocillos para una recopilación de datos sólida y rigurosa. Asimismo, a la hora de realizar cribado para determinar si un compuesto causa Torsades de Pointes (TdP -una arritmia ventricular de alto riesgo-, es óptimo no tener células auriculares y ganglionares "contaminantes" de monocapas cardíacas ventriculares. Por lo tanto, aunque los esfuerzos de validación de hiPSC-CM dirigidos por la FDA hasta la fecha se han centrado en el uso de CM disponibles comercialmente, es probable que las futuras recomendaciones de la ciencia regulatoria se centren en el uso de células específicas de la cámara para hacer que la detección de toxicidad sea aún más predictiva de la condición cardíaca humana. Los métodos descritos aquí se basan en informes anteriores y proporcionan un enfoque robusto para la generación de cardiomiocitos específicos de cámara derivados de células madre pluripotentes21.

Una diferencia importante entre estos protocolos y los que se usan típicamente en el campo es el enfoque de purificación utilizado. La mayoría de los laboratorios que generan CM-hiPSC en sus propios laboratorios se basan en la selección de cardiomiocitos mediada por el metabolismo22. Aquí, confiamos en el uso de MACS para purificar hiPSC-CMs, utilizando un enfoque de procesamiento celular clínicamente aprobado que produce CMs con fenotipos más saludables23. El abordaje de desafío metabólico es efectivo, pero utiliza una formulación mediática que simula la isquemia miocárdica24. Cuando se utiliza la purificación MACS de hiPSC-CM, es importante utilizar el cóctel de agotamiento sin CM, que se dirige a los no CM para el agotamiento magnético de la población celular. El uso del enfoque de agotamiento sin CM minimiza el esfuerzo cortante que experimentan los CM en la columna magnética, y se prefiere al etiquetado magnético directo de la población de CM. El uso de la purificación MACS de células específicas de la cámara permitirá a otros laboratorios generar CM saludables para la investigación y las pruebas de toxicidad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

TJH es consultor y asesor científico de StemBioSys, Inc. TB es un empleado de StemBioSys, Inc. AMR y JC son ex consultores de StemBioSys, Inc. TJH, TB, AMR y JC son accionistas de StemBioSys, Inc.

Acknowledgments

Este trabajo ha sido apoyado por las subvenciones de los NIH HL148068-04 y R44ES027703-02 (TJH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin EDTA Gibco 25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) Millipore Sigma A3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) Millipore Sigma H4034
AdGCaMP6m Vector biolabs 1909
Albumin human Sigma A9731-1G
alpha actinin antibody ThermoFisher MA1-22863
B27 Gibco 17504-044
Blebbistatin Sigma B0560
CalBryte 520AM AAT Bioquest 20650
CELLvo MatrixPlus 96wp StemBiosys N/A https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021 LC Laboratories c-6556
Clear Assay medium (fluorobrite) ThermoFisher A1896701 For adenovirus transduction
DAPI ThermoFisher 62248
DMEM:F12 Gibco 11330-032
FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma F4135-500ML
FluoVolt ThermoFisher F10488
HBSS Gibco 14025-092
iCell CM maintenance media FUJIFILM/Cellular Dynamics M1003
iCell2 CMs FUJIFILM 1434
Incucyte Zoom  Sartorius
iPS DF19-9-11T.H WiCell
Isoproterenol MilliporeSigma CAS-51-30-9
IWP4 Tocris 5214
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma A8960-5g
L-glutamine Gibco A2916801
LS columns Miltenyii Biotec 130-042-401
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) Miltenyii Biotec 130-091-221
Matrigel Corning 354234
MitoTracker Red ThermoFisher M7512
Nautilus HTS Optical Mapping  CuriBio https://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R Confocal Microscope Nikon
nonessential amino acids Gibco 11140-050
pre-separation filter Miltenyii Biotec 130-041-407
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human Miltenyii Biotec 130-110-188
Pulse CuriBio https://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separator (Magnet) Miltenyii Biotec 130-091-051
Retinoic acid Sigma R2625
RPMI 1640  Gibco 11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) Gibco 22400-089
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyii Biotec 130-107-086
TnI antibody (pan TnI) Millipore Sigma MAB1691 
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution) Gibco 15040-066
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
β-mercaptoethanol Gibco 21985023

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  3. Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
  4. Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
  5. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
  6. Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
  7. Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
  8. da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
  9. da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
  10. Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
  11. Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
  12. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  13. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
  14. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  16. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  17. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  18. Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
  19. Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
  20. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
  21. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
  24. Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).

Tags

Este mes en JoVE Número 193
Detección de cardiotoxicidad de alto rendimiento utilizando monocapas maduras de cardiomiocitos derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monteiro da Rocha, A., Allan, A.,… More

Monteiro da Rocha, A., Allan, A., Block, T., Creech, J., Herron, T. J. High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers. J. Vis. Exp. (193), e64364, doi:10.3791/64364 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter