Method Article

Auseinandersetzung mit praktischen Fragen der Rasterkraftmikroskopie-basierten Mikroeindringung an menschlichen Gelenkknorpelexplantaten

DOI:

10.3791/64371

⸱

October 28th, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir stellen einen Schritt-für-Schritt-Ansatz vor, um die häufigsten Probleme im Zusammenhang mit Mikroeindrücken in der Rasterkraftmikroskopie zu identifizieren und anzugehen. Wir veranschaulichen die aufkommenden Probleme an nativen menschlichen Gelenkknorpelexplantaten, die durch verschiedene Grade der Arthrose-bedingten Degeneration gekennzeichnet sind.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ohne Zweifel ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM) derzeit eine der leistungsfähigsten und nützlichsten Techniken zur Beurteilung von Mikro- und sogar Nanosignalen im biologischen Bereich. Wie bei jedem anderen mikroskopischen Ansatz können jedoch methodische Herausforderungen auftreten. Insbesondere die Eigenschaften der Probe, der Probenvorbereitung, des Gerätetyps und der Eindringsonde können zu unerwünschten Artefakten führen. In diesem Protokoll veranschaulichen wir diese aufkommenden Probleme sowohl an gesunden als auch an osteoarthritischen Gelenkknorpelexplantaten. Zu diesem Zweck zeigen wir zunächst Schritt für Schritt, wie ex vivo Gelenkknorpelscheiben nach verschiedenen Degenerationsstadien mittels großer 2D-Mosaikfluoreszenz-Bildgebung der gesamten Gewebeexplantate erzeugt, klassifiziert und visuell klassifiziert werden können. Die große Stärke des Ex-vivo-Modells besteht darin, dass es aus gealtertem, nativem, menschlichem Knorpel besteht, der es ermöglicht, arthrosebedingte Veränderungen vom frühen Beginn bis zur Progression zu untersuchen. Darüber hinaus werden auch häufige Fallstricke bei der Gewebepräparation sowie das eigentliche AFM-Verfahren zusammen mit der anschließenden Datenanalyse vorgestellt. Wir zeigen, wie sich grundlegende, aber entscheidende Schritte wie die Probenvorbereitung und -verarbeitung, topografische Probeneigenschaften, die durch fortgeschrittene Degeneration verursacht werden, und die Interaktion zwischen Probe und Spitze auf die Datenerfassung auswirken können. Wir nehmen auch die häufigsten Probleme in der AFM unter die Lupe und beschreiben, wo möglich, wie sie überwunden werden können. Die Kenntnis dieser Grenzen ist von größter Bedeutung für die korrekte Datenerfassung, Interpretation und letztlich die Einbettung der Ergebnisse in einen breiten wissenschaftlichen Kontext.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aufgrund der immer kleiner werdenden Größe elektronischer Geräte und Systeme hat die rasante Entwicklung von mikro- und nanobasierten Technologien und Geräten an Dynamik gewonnen. Ein solches Gerät ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM), die biologische Oberflächen scannen und topografische oder biomechanische Informationen sowohl im Nano- als auch im Mikrometerbereich abrufen kann 1,2. Zu seinen umfangreichen Funktionen gehört, dass dieses Werkzeug sowohl als Mikro- als auch als Nano-Eindringkörper betrieben werden kann, um Informationen über die mechanischen Eigenschaften verschiedener biologischer Systeme zu erhalten 3,4,5,6. Die Daten werden durch physischen Kontakt mit der Oberfläche durch eine mechanische Sonde gesammelt, die an ihrer Spitze7 nur etwa 1 nm betragen kann. Die resultierende Verformung der Probe wird dann basierend auf der Eindringtiefe der Cantilever-Spitze und der auf die Probe8 ausgeübten Kraft angezeigt.

Arthrose (OA) ist eine langfristige degenerative chronische Erkrankung, die durch eine Verschlechterung des Gelenkknorpels in den Gelenken und dem umliegenden Gewebe gekennzeichnet ist, was zu einer vollständigen Freilegung der Knochenoberflächen führen kann. Die Belastung durch Open Access ist erheblich; derzeit leidet die Hälfte aller Frauen und ein Drittel aller Männer ab 65 Jahren an OA9. Traumata, Fettleibigkeit und die daraus resultierende veränderte Biomechanik des Gelenks10 bestimmen die Degeneration des Gelenkknorpels, die als häufiges Endergebnis angesehen wird. Die bahnbrechende Studie von Ganz et al. postulierte, dass die frühen Schritte des OA-Prozesses die biomechanischen Eigenschaften des Knorpels beinhalten könnten11, und seitdem haben Forscher diese Hypothese bestätigt12. Ebenso ist es allgemein anerkannt, dass die biomechanischen Eigenschaften des Gewebes funktionell durch die ultrastrukturelle Organisation sowie durch Zell-Zell- und Zell-Matrix-Übersprechen orchestriert werden. Jede Veränderung kann sich dramatisch auf die gesamte biomechanische Funktion des Gewebes auswirken13. Bisher ist die Arthrose-Diagnose klinisch und basiert auf der Röntgenaufnahme14. Dieser Ansatz hat zwei Seiten: Erstens erschwert das Fehlen einer definierten degenerativen Cut-off-Schwelle zur Formulierung der Diagnose Arthrose die Quantifizierung der Erkrankung, und zweitens mangelt es den bildgebenden Verfahren an Sensitivität und Standardisierung und sie können lokalisierte Knorpelschäden nicht erkennen15,16,17. Dazu hat die Beurteilung der mechanischen Eigenschaften des Knorpels den entscheidenden Vorteil, dass sie einen Parameter beschreibt, der sich im Verlauf der Arthrose unabhängig von der Ätiologie der Erkrankung verändert und bereits in einem sehr frühen Stadium einen direkten Einfluss auf die Gewebefunktionalität hat. Eindringinstrumente messen die Kraft, mit der das Gewebe dem Einzug widersteht. Dies ist in der Tat kein neues Konzept; Die frühesten Studien stammen aus den 1980er und 1990er Jahren. In dieser Zeit deuteten zahlreiche Studien darauf hin, dass Eindringinstrumente, die für die arthroskopischen Messungen von Gelenkknorpel konzipiert sind, gut geeignet sein könnten, degenerative Veränderungen des Knorpels zu erkennen. Bereits vor 30 Jahren konnten einige Studien zeigen, dass Indentationsinstrumente in der Lage sind, in vivo Veränderungen der Knorpeloberfläche während der Gewebedegeneration durch Drucksteifigkeitsmessungen während der Arthroskopie zu erkennen18,19,20.

Die AFM-Einkerbung (AFM-IT) des Gelenkknorpels gibt Aufschluss über eine zentrale mechanische Eigenschaft des Gewebes, nämlich die Steifigkeit. Hierbei handelt es sich um einen mechanischen Parameter, der den Zusammenhang zwischen einer aufgebrachten, zerstörungsfreien Belastung und der daraus resultierenden Verformung des eingedrückten Gewebebereichs21 beschreibt. Es hat sich gezeigt, dass AFM-IT in der Lage ist, altersabhängige Veränderungen der Steifigkeit in makroskopisch nicht beeinflussten Kollagennetzwerken zu quantifizieren und somit zwischen den pathologischen Veränderungen zu unterscheiden, die mit dem Ausbruch von Arthrose verbunden sind (Grad 0 auf der Outerbridge-Skala im Gelenkknorpel)22. Wir haben bereits gezeigt, dass AFM-ITs auf der Grundlage der räumlichen Chondrozytenorganisation als bildbasierter Biomarker für die frühe Knorpeldegeneration es ermöglichen, die frühesten degenerativen mechanischen Veränderungen nicht nur zu quantifizieren, sondern auch tatsächlich zu lokalisieren. Diese Befunde wurden bereits von anderen bestätigt23,24. Daher ist AFM-IT ein interessantes Werkzeug, um frühe degenerative Veränderungen zu diagnostizieren und zu identifizieren. Diese Veränderungen können bereits auf zellulärer Ebene gemessen werden, was das Verständnis des pathophysiologischen Prozesses der Arthrose verändert.

In diesem Protokoll demonstrieren wir ein vollständiges histologisches und biomechanisches Grading-Verfahren von Gelenkknorpel-Explantaten, von der nativen Knorpel-Explantat-Präparation bis hin zur AFM-Datenerfassung und -verarbeitung. Anhand eines Schritt-für-Schritt-Ansatzes zeigen wir, wie Gelenkknorpelgewebe nach verschiedenen Stadien der Degeneration mit Hilfe von 2D-Bildgebung mit großem Mosaik, gefolgt von Mikro-AFM-Eindrücken, generiert, klassifiziert und visuell klassifiziert werden kann.

Auch wenn die AFM-IT derzeit eines der empfindlichsten Werkzeuge zur Messung biomechanischer Veränderungen im Knorpel ist7, wie jede andere instrumentelle Technik, hat sie Einschränkungen und praktische Besonderheiten25, die zu einer fehlerhaften Datenerfassung führen können. Zu diesem Zweck nehmen wir die häufigsten Probleme, die bei AFM-Messungen der Knorpelexplantate auftreten, unter die Lupe und beschreiben, wo möglich, wie diese minimiert oder überwunden werden können. Dazu gehören topographische Aspekte der Proben und die Schwierigkeiten, sie in einer AFM-kompatiblen Umgebung zu stabilisieren, physikalische Besonderheiten der Gewebeoberfläche und die daraus resultierenden Schwierigkeiten bei der Durchführung von AFM-Messungen auf solchen Oberflächen. Es werden auch Beispiele für fehlerhafte Kraft-Weg-Kurven vorgestellt, wobei die Bedingungen hervorgehoben werden, die sie verursachen können. Weitere Einschränkungen, die sich aus der Geometrie der Kragarmspitze und der Verwendung des Hertz-Modells für die Datenanalyse ergeben, werden ebenfalls diskutiert.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es wurden Femurkondylen von Patienten verwendet, die sich am Universitätsklinikum Tübingen einer Knietotalendoprothetik unterzogen. In diese Studie wurden nur Gelenkknorpelproben von Patienten mit degenerativen und posttraumatischen Gelenkerkrankungen eingeschlossen. Vor Beginn der Studie wurde die Zustimmung der Abteilungs-, institutionellen und lokalen Ethikkommission eingeholt (Projekt Nr. 674/2016BO2). Vor der Teilnahme wurde von allen Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

HINWEIS: Ein Flussdiagramm der Versuchsschritte in chronologischer Reihenfolge ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Gewebeaufbereitung und Generierung von Knorpelscheiben

  1. Präparation des Gewebes
    1. Nach der postoperativen Resektion werden die Knorpelproben in einen Behälter gegeben, der mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gefüllt ist, das mit 5% (v/v) Penicillin-Streptomycin angereichert ist. Stellen Sie sicher, dass die Proben vollständig in das Medium eingetaucht sind. Die Zeitspanne zwischen chirurgischer Resektion und Weiterverarbeitung des Knorpels sollte 24 h nicht überschreiten. Stellen Sie sicher, dass die Proben während der gesamten Verarbeitung vollständig in Medien eingetaucht sind, um ein Austrocknen der Proben zu vermeiden.
    2. Schneiden Sie den Knorpel mit einem Skalpell vom Knochen weg.
  2. Generierung von Knorpelscheiben
    1. Erzeugen Sie Knorpelscheiben mit einem Durchmesser von 4 mm mit einer Biopsiestanze.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Bereiche des Kondylus auszuwählen und zu resezieren, in denen die Knorpelschichtdicke 1 mm überschreitet. Dies kann vor allem in Belastungszonen problematisch sein, wo die Knorpelschicht typischerweise durch Verschleißprozesse oder Degeneration an Dicke verliert.
    2. Legen Sie die zuvor erzeugten 4 mm Knorpelscheiben auf eine speziell angefertigte Schneidevorrichtung und fixieren und halten Sie die Knorpelscheiben mittels Spatel stabil. Beim Auflegen der Knorpelscheiben auf die Schneidvorrichtung ist Vorsicht geboten. Positionieren Sie die Proben so, dass die oberste Schicht des Knorpels (die oberflächliche Zone des Gelenkknorpels) nicht zur Klinge zeigt
    3. Schneiden Sie die Knorpelscheiben mit einer Rasierklinge ab. So werden scheibenförmige Knorpelproben von 4 mm x 1 mm erzeugt. Um ein Austrocknen der Probe zu verhindern, sollten Sie das Gewebe so schnell wie möglich schneiden.
    4. Sammeln Sie jede Scheibe mit Hilfe eines Spatels und legen Sie die erzeugten Knorpelscheiben in 1,5-ml-Röhrchen, die 1 ml DMEM enthalten, ergänzt mit 5% (v/v) Penicillin-Streptomycin. Legen Sie ca. 15 Scheiben in ein Röhrchen.
  3. Kryotomschnitt der Knorpelscheiben (bei senkrechten Schichten)
    ANMERKUNG: Dieser Schritt ist optional und kann verwendet werden, wenn eine seitliche Visualisierung der zellulären Musterverteilung innerhalb der Knorpelscheiben gewünscht wird. Es kann als Verifizierungsmethode verwendet werden, da die Verteilung des Zellmusters ein 3D-Merkmal des Gelenkknorpels26 ist. Optische Schnitte und 3D-Rekonstruktionen der gesamten Knorpelscheiben mit einem konfokalen Mikroskop können ebenfalls verwendet werden, so dass die Proben nicht mehr wie im Protokoll beschrieben geschnitten werden müssen.
    1. Decken Sie die Knorpelscheibe mit wasserlöslichem Einbettmedium ab und legen Sie sie mit ihrem Rand auf den Kryotomknopf (wobei die Oberfläche der Scheibe senkrecht zur Oberfläche des Knopfes steht). Im Kryotomgerät gefriert das Einbettmedium bei niedrigen Temperaturen.
    2. Mit einem Standard-Kryotom wird das Gewebe mit einer Dicke von 60 μm seitlich durchtrennt, bis die Mitte der Scheibe erreicht ist (d. h. wenn Kryoschnitte eine Länge von 4 mm erreichen) und die Scheiben entnommen. Durch die senkrechte Sektion des Bandscheibenexplantats können alle Zonen des Knorpels (oberflächlich, mittig und tief) sichtbar gemacht werden.
    3. Sammeln Sie die Schnitte auf einem Objektträger und entfernen Sie das wasserlösliche Einbettmedium durch dreimaliges Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).

2. Sortierung der Knorpelscheibe als Funktion des zellulären Raummusters

  1. Färbung der scheibenförmigen Knorpelproben
    1. Platzieren Sie eine Knorpelscheibe (Abschnitt 1.2) in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und geben Sie 130 μl zellpermeablen Fluoreszenzfarbstoff in einer Verdünnung von 1:1.000 in jede Well.
    2. Prüfen Sie die gesamte Platte visuell und stellen Sie sicher, dass nur eine Scheibe in jede Vertiefung eingelegt wird. Inkubieren Sie die Platte für 30 Minuten im Standard-Zellkultur-Inkubator bei 37 °C.
  2. Färbung der 60 μm Knorpelschnitte
    1. Die Knorpelscheibenabschnitte (Abschnitt 1.3) werden vorsichtig mit Hilfe einer Pinzette auf Objektträger aus Glas gelegt.
    2. Decken Sie die Knorpelabschnitte mit Eindeckmedium ab, das die nukleare DAPI-Gegenfärbung enthält, und legen Sie vorsichtig Deckgläser an, die für die Fluoreszenzmikroskopie geeignet sind.
    3. Die Ränder jedes Deckglases mit normalem transparentem Nagellack versiegeln und 3 Minuten trocknen lassen.
  3. Knorpelsortierung und -bildgebung von oben nach unten und von der Seite
    HINWEIS: Jede Scheibe muss unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht werden. Das Ziel dieses Schritts ist es, die Scheiben nach ihrem vorherrschenden Zellmuster (einzelne Saiten, Doppelsaiten, kleine Cluster, große Cluster oder diffuse) zu sortieren.
    1. Legen Sie die 96-Well-Platte auf den Plattenhalter des Fluoreszenzmikroskops.
    2. Wählen Sie den geeigneten Fluoreszenzfilter von Em 495 nm/Ex 515 nm (für die Top-Down-Bildgebung der in Abschnitt 2.1 hergestellten Knorpelscheiben) oder Em 358 nm/Ex 461 nm (für die Seitenansicht der in Abschnitt 2.2 vorbereiteten Knorpelabschnitte) und das 10x-Objektiv.
      HINWEIS: Mit dem 10x-Objektiv kann der gesamte Umfang der Scheibe inspiziert werden, und Proben mit inhomogener oder unsachgemäßer Färbung können ausgeschlossen werden. Die ausschließliche Verwendung der Top-Down-Ansicht kann jedoch dazu führen, dass Veränderungen in der zellulären Organisation als Ergebnis der Analyse der tieferen Gewebeschichten wahrgenommen werden, die durch oberflächliche Erosion für die Top-Down-Beobachtung sichtbar werden. Beispielsweise könnte ein aufsteigender Strang, der den Kollagenarkaden folgt, als einzelne Zelle oder als verstreute Zellen wahrgenommen werden (diffuses Muster)26. Daher müssen beide Seiten der Bandscheiben inspiziert werden, um die richtige Auswahl des Zellmusters zu gewährleisten.
    3. Bestimmen Sie visuell das Zellmuster, das in jeder Knorpelscheibe angezeigt wird. Es ist unwahrscheinlich, dass eine Bandscheibe nur eine Art von Zellmuster aufweist. Nehmen Sie für den Teil der Scheibe, in dem die Chondrozytenanordnung nicht mit dem interessierenden Muster übereinstimmt, die Proben nur dann an, wenn sich das unerwünschte Muster an der äußersten Peripherie befindet, wo keine AFM-Messungen stattfinden (d. h. bis zu 0,5 mm vom Scheibenrand entfernt), und stellen Sie sicher, dass dies 10 % der Gesamtoberfläche der Scheibe27 nicht überschreitet. 28. S.
  4. Bildaufnahme der gesamten Knorpelscheiben
    1. Wählen Sie das 10x-Objektiv des Mikroskops aus und positionieren Sie es unter der vorgewählten Vertiefung, die eine einzelne Knorpelscheibe enthält. Fokussieren Sie sich auf die Scheibe, um das Zellmuster zu erkennen.
    2. Wählen Sie die Navigator-Funktion , um einen Überblick über das gesamte Well zu erhalten. Navigieren Sie mit der linken Maustaste und ziehen Sie zu einer anderen Bühnenposition. Vergrößern und verkleinern Sie mit dem Mausrad.
      HINWEIS: An dieser Stelle können Sie eine Vorschau der Vertiefung mit der gesamten Probe sehen, indem Sie nacheinander auf jeden Interessenbereich doppelklicken.
    3. Wählen Sie ein Quadrat aus, das den zu scannenden Interessenbereich umfasst. Zu diesem Zeitpunkt werden alle einzelnen Kacheln, aus denen sich das Mosaik zusammensetzt, sichtbar.
    4. Passen Sie die Belichtungs-/Lichtintensität so an, dass die Zellen vom Hintergrund aus deutlich sichtbar sind. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Helligkeit/der Kontrast des Bildes für alle Kacheln angepasst und kann nicht mehr für jede Kachel einzeln angepasst werden.
      HINWEIS: Da die Zellen in der Nähe des Scheibenrandes oft ein höheres Fluoreszenzsignal aussenden als die Zellen in der Mitte, müssen die Einstellungen für Belichtung/Lichtintensität angepasst werden.
      1. Um zu beurteilen, ob die Belichtungszeit für einen bestimmten Kanal geeignet ist, untersuchen Sie die Verteilung des Signals im Histogramm. Mit dem automatischen Belichtungsmechanismus, der in der Bildsoftware des Mikroskops enthalten ist, können Sie alle Zellen in der Scheibe visualisieren.
    5. Wählen Sie die Option Fokus-Map-Punkt der Software aus, und wählen Sie dann jede einzelne Kachel aus, indem Sie mit der linken Maustaste in die Mitte klicken.
    6. Wählen Sie die Option Fokus-Map. Es wird ein Fenster mit allen zuvor ausgewählten Kacheln angezeigt. Doppelklicken Sie auf eine Kachel in der Liste, um sie anzuzeigen und in den richtigen Fokus zu bringen.
    7. Klicken Sie auf Z festlegen , um den Fokusplan zu speichern und mit der nächsten Kachel fortzufahren. Nachdem Sie den Fokusplan für jede einzelne Kachel angepasst haben, starten Sie die Bildaufnahme, indem Sie auf Scan starten drücken.
      1. Wenn der Scan dunklere horizontale und/oder vertikale Balken anzeigt, kann dies auf eine unsachgemäße und ungleichmäßige Ausleuchtung der einzelnen Bilder zurückzuführen sein. Beheben Sie dieses Problem, indem Sie vor dem eigentlichen Scan die in der Software enthaltene Option " Verknüpfte Schattierung" verwenden.
    8. Speichern, exportieren und kommentieren Sie die Bilder korrekt.

3. Biomechanischer Ansatz von Knorpelexplantaten

  1. Probenvorbereitung für AFM-Messungen
    1. Jede vorselektierte Knorpelscheibe, die ein Zellmuster (Abschnitt 2) enthält, wird in Petrischalen mit biokompatiblem Kleber fixiert. Füge ausreichend Probenkleber auf die obere, untere, linke und rechte Seite der Disc hinzu.
    2. Bedecken Sie die Scheiben mit 2,5 ml Leibovitz's L-15 Medium ohne L-Glutamin. Geben Sie das Leibowitz-Medium vorsichtig auf die Proben, um zu vermeiden, dass sich die Probe aufgrund der vom Medium erzeugten Wellen von der Oberfläche löst.
  2. Laden der Proben in das AFM
    1. Positionieren Sie die Petrischale im Probenhalter des AFM-Geräts und schalten Sie die auf 37 °C eingestellte Petrischale ein. Lassen Sie die Gewebekulturschale die gewünschte Temperatur erreichen. Dies geschieht, um mögliche Artefakte auszuschließen, die durch Temperaturschwankungen verursacht werden.
  3. AFM-Cantilever-Kalibrierung
    1. Initialisieren Sie das Software-Setup, wie zuvor von Danalache et al.29 beschrieben.
    2. Wählen Sie einen geeigneten Glasbaustein-Kragarmhalter für Flüssigkeitsmessungen aus und setzen Sie ihn vorsichtig auf den AFM-Kopf. Ein Verriegelungsmechanismus sichert den Glasbaustein im AFM-Kopf. Stellen Sie sicher, dass die reflektierende Oberfläche des Glassteins gerade und parallel zum AFM-Halter verläuft.
    3. Platzieren Sie den Ausleger vorsichtig auf der Oberfläche des Glasbaustein-Kragarmhalters. Der Ausleger selbst sollte auf der polierten optischen Ebene in der Mitte des Glasbausteins aufliegen.
    4. Legen Sie vorsichtig eine Silikonschürze (Silikonmembran) auf die Basis des Kragarmhalters, um eine mittlere Kondensation im AFM-Kopf zu verhindern.
    5. Senken Sie den Ausleger mit der Schrittmotorfunktion in 100-μm-Schritten ab, bis er vollständig in das Medium eingetaucht ist.
    6. Führen Sie einen Scanneranflug mit den von Danalache et al.29 beschriebenen Annäherungsparametern durch. Ziehen Sie den Ausleger um 100 μm zurück, sobald der Boden der Petrischale erreicht ist.
    7. Kalibrieren Sie den Ausleger anhand der exakten Schritte und führen Sie die von Danalache et al.29 beschriebenen Parameter aus. Am Ende der Kalibrierung wird die vertikale Auslenkung gespeichert und in Newton (N) Krafteinheiten und nicht in Volt (V) angezeigt - der Einheit der ursprünglichen Registrierung durch den Fotodiodendetektor. In den Experimenten ergab sich nach der Kalibrierung ein Sollwert von 4,47 nN.
    8. Mit der Schrittmotorfunktion den Ausleger auf 1.000 μm einfahren.
  4. Identifizierung der gewünschten Knorpelmessstelle unter dem AFM
    HINWEIS: Aufgrund der 1 mm Dicke der Knorpelscheiben ist der Cantilever beim Navigieren über die Probe im Sichtfeld nicht sichtbar.
    1. Verwenden Sie die CCD-Kamera des Mikroskops, um den Ausleger zu identifizieren. Der AFM-Ausleger sollte in einem probenfreien Bereich der Petrischale positioniert werden.
    2. Beginnen Sie einen Scanneransatz mit dem Cantilever auf einem sauberen, probenfreien Bereich der Petrischale unter Verwendung der gleichen Parameter, die von Danalache et al.29 beschrieben wurden.
    3. Ziehen Sie den Ausleger mit der Schrittmotorsteuerung 1,5 mm weiter vom Boden der Platte weg. Dieser Schritt ist entscheidend, um eine direkte Kollision zwischen Cantilever und Probe zu vermeiden.
    4. Wechseln Sie von der Hellfeld- zur Fluoreszenzansicht und identifizieren Sie visuell die Oberseite der Scheibe.
    5. Bewegen Sie den AFM-Probenhalter genau 2 mm in Richtung Mitte der Scheibe. Dieser Punkt gilt als Zentrum der Knorpelscheibe.
    6. Führen Sie einen Scanneranflug durch und ziehen Sie den Ausleger um 100 μm zurück, sobald die Oberfläche der Knorpelscheibe erreicht ist.
  5. Messungen der Kraft-Weg-Kurve
    1. Fokussieren Sie sich auf die Zellen, die an der gewünschten Messstelle positioniert sind. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Messungen und die Generierung von Kraft-Weg-Kurven an der Zielposition zu starten.
    2. Erfassen Sie fünf Kraft-Weg-Kurven an jeder Messstelle. Ziehen Sie den Ausleger um 500 μm zurück und fahren Sie den Ausleger zur nächsten Messstelle.
      HINWEIS: Das Zurückziehen des Cantilevers ist ein entscheidender Schritt, da die Oberfläche der Knorpelscheibe nicht homogen ist und Unregelmäßigkeiten aufweist. Eine hohe Neigung auf der Oberfläche der Probe kann zu einer dramatischen Kollision führen, die zu einer unerwünschten Beschädigung der Cantilever-Spitze/Probe führt. Wir empfehlen, mindestens fünf verschiedene Messstellen auszuwählen, die über die Oberfläche der Scheibe verteilt sind, und an jeder Stelle mindestens fünf Kraft-Weg-Kurven zu erstellen.
    3. Überprüfen Sie die Kraft-Weg-Kurven und speichern Sie sie.
  6. Schätzung der Elastizitätsmodule mit Hilfe des Hertz-Anpassungsmodells
    1. Öffnen Sie die generierten Kraft-Weg-Kurven (.jpk-Datei) in der Datenanalysesoftware mit der Option Stapel von Spektroskopiekurven öffnen .
    2. Wählen Sie das Hertz-Anpassungsmodell aus, und wählen Sie dann die Option Elastizitätsanpassung aus.
      1. Die Option Elastizitätsanpassung führt automatisch die folgenden Berechnungen für die ausgewählte Kraft-Weg-Kurve durch: berechnet die Basislinie und subtrahiert von der gesamten Kurve, um den Basislinienversatz zu entfernen (die Basislinie wird auf der y-Achse wieder auf Null gebracht); bestimmt den Kontaktpunkt, indem der Punkt erkannt wird, an dem die Kraft-Weg-Kurve die Kraftlinie Null schneidet (der Kontaktpunkt wird auf der x-Achse auf Null gesetzt); berechnet die Trennung zwischen Spitze und Probe (das Höhensignal des Piezos, das die Biegung des Auslegers berücksichtigt, wird subtrahiert); und passt die Kraft-Weg-Kurve automatisch an das ausgewählte Modell an. Auf Wunsch kann jeder dieser Schritte auch unabhängig voneinander durchgeführt werden.
    3. Passen Sie mit den folgenden Passungsparametern an: Poisson-Verhältnis von 0,5 und dem entsprechenden Auslegerspitzenradius.
      HINWEIS: Bei Verwendung eines Auslegers mit kugelförmiger Auslegerspitze sollte das Hertz-Fit-Modell verwendet werden. Der in dieser Studie verwendete Cantilever hatte eine sphärische Spitze mit einem Radius von 5 μm. Wir empfehlen, die Kraft-Weg-Kurve so lange anzupassen, bis die maximal aufgebrachte Kraft erreicht ist (Sollwert).
    4. Prüfen Sie visuell die Passung der Kraft-Weg-Kurve, um die Richtigkeit sicherzustellen. Dieser Schritt muss für jede der analysierten Kraft-Weg-Kurven durchgeführt werden.
  7. Bestimmung der Eindringtiefe
    HINWEIS: Je nach verwendetem Datenanalyse-Tool kann dieser Prozess unterschiedlich sein. Der Experimentator kann die Eindringtiefe leicht ablesen, indem er eine Reihe von Schritten befolgt, die im Datenanalyseprogramm enthalten sind.
    1. Öffnen Sie jede der generierten Kraft-Weg-Kurven in der Datenanalysesoftware und wählen Sie das Hertz-Anpassungsmodell als Analyseprozess aus.
    2. Wenden Sie die Option Basislinienversatz subtrahieren an, um die vertikale Durchbiegungsachse (y-Achse) auf Null zu setzen, und wählen Sie die Funktion Versatz + Neigung .
    3. Verwenden Sie die Funktion Kontaktpunkt suchen, um den Kontaktpunkt automatisch zu identifizieren, der automatisch auf eine x-Koordinate von Null gebracht wird.
    4. Subtrahieren Sie den Abstand, der ausschließlich die Auslenkung des Auslegers berücksichtigt, von der rohen Piezohöhe während des Eindrucks mit der Funktion Vertikale Spitzenposition .
    5. Wählen Sie die Option Elastizitätsanpassung aus, um die verarbeitete Kraft-Weg-Kurve anzuzeigen, und wählen Sie den Bereich des Diagramms so aus, dass er mit dem negativsten Wert auf der vertikalen Spitzenpositionsachse (x-Achse) ausgerichtet ist.
    6. Lesen und dokumentieren Sie die Einrückung aus dem Feld X Min auf der Registerkarte Parameter. Speichern und dokumentieren Sie die Ergebnisse.

4. Statistische Analyse

  1. Öffnen Sie die Statistiksoftware. Wählen Sie Neues Dataset aus dem Dropdown-Menü aus.
  2. Öffnen Sie die Registerkarte Variablenansicht , nachdem Sie die DataSet-Datei ausgewählt haben. Definieren Sie die numerischen Variablen für jede zelluläre Musterkategorie: einzelne Strings = SS, doppelte Strings = DS, kleine Cluster = SC, große Cluster = BC, diffuse und die Elastizitätsmodule.
  3. Geben Sie auf der Registerkarte "Datenansicht" die gemessenen Elastizitätsmoduldaten für jede der entsprechenden zellulären Musterkategorien ein. Analysieren Sie die Datenverteilung, indem Sie in der Menüleiste Analysieren und dann Explorative Datenanalyse auswählen.
  4. Wählen Sie Young's Moduli als abhängige Variable und Cellular Pattern als Faktorliste aus. Ein Boxplot, der für den Ergebnisabschnitt verwendet wird, wird unter den Ergebnissen in der Ausgabedatei angezeigt.
  5. Um eine statistische Analyse durchzuführen, wählen Sie Abhängige Stichproben im Abschnitt "Nicht parametrischer Test" auf der Registerkarte "Analysieren" in der Menüleiste. Wählen Sie Young's Moduli als Testfelder und Cellular Pattern als Gruppen auf der Registerkarte "Felder" aus. Drücken Sie auf Ausführen.
    HINWEIS: Die Ergebnisse werden in der Ausgabedatei angezeigt. Für die statistische Auswertung wird ein Friedman-Test durchgeführt.
  6. Integrieren Sie die p-Werte des nichtparametrischen Tests in den Boxplot, der in Schritt 4.4 erstellt wurde. Speichern Sie die Ergebnisse, indem Sie in der Menüleiste auf Datei klicken und Speichern auswählen.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mit Hilfe eines selbstgebauten Schneidegeräts konnten wir kleine (4 mm x 1 mm) Knorpelscheiben aus frischen menschlichen Kondylen explantieren und erzeugen, die ein einzelnes zelluläres Raummuster30 aus einzelnen Strängen (SS, Abbildung 2A), Doppelsträngen (DS), kleinen Clustern (SC), großen Clustern (BC; Abbildung 2A) und diffus (Abbildung 2B). Ein repräsentatives Knorpelexplantat ist in

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als fortschreitende und multifaktorielle Erkrankung löst Arthrose strukturelle und funktionelle Veränderungen im Gelenkknorpel aus. Im Verlauf der Arthrose gehen Beeinträchtigungen der mechanischen Eigenschaften mit strukturellen und biochemischen Veränderungen an der Oberfläche des Gelenkknorpels einher27,31. Die frühesten pathologischen Ereignisse, die bei OA auftreten, sind die Erschöpfung von Proteoglykanen in Verbindung mit einer Störung des Kollagennetzwerk...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken den orthopädischen Chirurgen der Klinik für Orthopädische Chirurgie des Universitätsklinikums Tübingen für die Bereitstellung der Gewebeproben.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BMerck KGaA, Darmstadt, Deutschland1397-89-3
Kopf für Rasterkraftmikroskopie (AFM);CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, DeutschlandJPK00518
Biokompatibler ProbenkleberBruker Nano GmbH, Berlin, DeutschlandH000033
Calcein AMCayman, Ann Arbor, Michigan, USA14948Zellmembrandurchlässiger Farbstoff, verwendet für die Sortierung von Knorpelscheiben - Draufsicht
CantileverBruker Nano GmbH, Berlin, DeutschlandSAA-SPH-5UMFrequenz Nom: 30KHz, k: 0,2N/m, Länge nom: 115μ m, Breite nom: 40μ m,  Geometrie: Rechteckige, zylindrische Spitze mit einem 5μ m Endradius
Knorpel cting Vorrichtung Selbstgemacht n/aSchneidevorrichtung aus Kunststoff mit vordefinierten Löchern der im AFM integrierten 4mmx1mm
CDD-KameraThe Imaging Source Europe GmbH, Bremen, DeutschlandDFK 31BF03
CDD-Kamera, integriert in das FluoreszenzmikroskopLeica Biosystems, Wetzlar, DeutschlandDFC3000G
KryotomLeica Biosystems, Wetzlar, DeutschlandCM3050S 
Die Datenverarbeitungssoftware für die AFMBruker Nano GmbH, Berlin, Deutschlandn/aVersion 5.0.86 kann kostenlos von der folgenden Website heruntergeladen werden https://customers.jpk.com
Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM)Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Deutschland41966052
Fluoreszenzmikroskop (Leica DMi8)Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland11889113
Glasblock-Cantiliver HalterBruker Nano GmbH, Berlin, DeutschlandSP-90-05Extra langer Glasblock mit abgewinkelten Flächen, speziell für den Einsatz mit dem JPK PetriDishHeaterTM (Bruker) entwickelt.
Inverses Phasenkontrastmikroskop (integriert in das AFM)AxioObserver D1, Carl-Zeiss-Mikroskopie, Jena, DeutschlandL201306_03
Leibovitz' L-15-Medium ohne L-Glutamin Merck KGaA, Darmstadt, DeutschlandF1315
ObjektträgerSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USACLS294775X50
Eindeckmedium Mit DAPIibidi GmbH, Grä felfing, Deutschland50011Einbettmedien mit nukleärer DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)-Gegenfärbung für Knorpelscheiben  Seitenansichtsbildgebung
Penicillin-StreptomycinSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAP4333
Petrischale-Heizung in Verbindung mit AFM (Petri Dish Heater)Bruker Nano GmbH, Berlin, DeutschlandT-05-0117
SkalpellFeather Medical Products, Osaka, Japan2023-01
SilikonschürzeBruker Nano GmbH, Berlin, Deutschlandn/aSilikonschutzmembran (D55x0,25), die auf der Basis des Glasblocks platziert wird, um mittlere Kondensation im AFM-Kopf zu verhindern.
Statistisches Programm - SPSSIBM, Armonk, New York, USASPSS Statistics 22Vesion 280.0.0.0 (190)
Gewebekulturschalen TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, SchweizTPP93040
Tissue-tek O.C.T. CompoundSakura Finetek, Alphen aan den Rijn, NiederlandeSA6255012Wasserlösliches Einbettmedium 

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