Auseinandersetzung mit praktischen Fragen der Rasterkraftmikroskopie-basierten Mikroeindringung an menschlichen Gelenkknorpelexplantaten

Summary

Wir stellen einen Schritt-für-Schritt-Ansatz vor, um die häufigsten Probleme im Zusammenhang mit Mikroeindrücken in der Rasterkraftmikroskopie zu identifizieren und anzugehen. Wir veranschaulichen die aufkommenden Probleme an nativen menschlichen Gelenkknorpelexplantaten, die durch verschiedene Grade der Arthrose-bedingten Degeneration gekennzeichnet sind.

Abstract

Ohne Zweifel ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM) derzeit eine der leistungsfähigsten und nützlichsten Techniken zur Beurteilung von Mikro- und sogar Nanosignalen im biologischen Bereich. Wie bei jedem anderen mikroskopischen Ansatz können jedoch methodische Herausforderungen auftreten. Insbesondere die Eigenschaften der Probe, der Probenvorbereitung, des Gerätetyps und der Eindringsonde können zu unerwünschten Artefakten führen. In diesem Protokoll veranschaulichen wir diese aufkommenden Probleme sowohl an gesunden als auch an osteoarthritischen Gelenkknorpelexplantaten. Zu diesem Zweck zeigen wir zunächst Schritt für Schritt, wie ex vivo Gelenkknorpelscheiben nach verschiedenen Degenerationsstadien mittels großer 2D-Mosaikfluoreszenz-Bildgebung der gesamten Gewebeexplantate erzeugt, klassifiziert und visuell klassifiziert werden können. Die große Stärke des Ex-vivo-Modells besteht darin, dass es aus gealtertem, nativem, menschlichem Knorpel besteht, der es ermöglicht, arthrosebedingte Veränderungen vom frühen Beginn bis zur Progression zu untersuchen. Darüber hinaus werden auch häufige Fallstricke bei der Gewebepräparation sowie das eigentliche AFM-Verfahren zusammen mit der anschließenden Datenanalyse vorgestellt. Wir zeigen, wie sich grundlegende, aber entscheidende Schritte wie die Probenvorbereitung und -verarbeitung, topografische Probeneigenschaften, die durch fortgeschrittene Degeneration verursacht werden, und die Interaktion zwischen Probe und Spitze auf die Datenerfassung auswirken können. Wir nehmen auch die häufigsten Probleme in der AFM unter die Lupe und beschreiben, wo möglich, wie sie überwunden werden können. Die Kenntnis dieser Grenzen ist von größter Bedeutung für die korrekte Datenerfassung, Interpretation und letztlich die Einbettung der Ergebnisse in einen breiten wissenschaftlichen Kontext.

Introduction

Aufgrund der immer kleiner werdenden Größe elektronischer Geräte und Systeme hat die rasante Entwicklung von mikro- und nanobasierten Technologien und Geräten an Dynamik gewonnen. Ein solches Gerät ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM), die biologische Oberflächen scannen und topografische oder biomechanische Informationen sowohl im Nano- als auch im Mikrometerbereich abrufen kann ^1,2. Zu seinen umfangreichen Funktionen gehört, dass dieses Werkzeug sowohl als Mikro- als auch als Nano-Eindringkörper betrieben werden kann, um Informationen über die mechanischen Eigenschaften verschiedener biologischer Systeme zu ....

Protocol

Es wurden Femurkondylen von Patienten verwendet, die sich am Universitätsklinikum Tübingen einer Knietotalendoprothetik unterzogen. In diese Studie wurden nur Gelenkknorpelproben von Patienten mit degenerativen und posttraumatischen Gelenkerkrankungen eingeschlossen. Vor Beginn der Studie wurde die Zustimmung der Abteilungs-, institutionellen und lokalen Ethikkommission eingeholt (Projekt Nr. 674/2016BO2). Vor der Teilnahme wurde von allen Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

HINWEIS: Ein Flussdiagramm der Versuchsschritte in chronologischer Reihenfolge ist in Abbildung 1 dargestellt.<....

Results

Mit Hilfe eines selbstgebauten Schneidegeräts konnten wir kleine (4 mm x 1 mm) Knorpelscheiben aus frischen menschlichen Kondylen explantieren und erzeugen, die ein einzelnes zelluläres Raummuster³⁰ aus einzelnen Strängen (SS, Abbildung 2A), Doppelsträngen (DS), kleinen Clustern (SC), großen Clustern (BC; Abbildung 2A) und diffus (Abbildung 2B). Ein repräsentatives Knorpelexplantat ist in

Discussion

Als fortschreitende und multifaktorielle Erkrankung löst Arthrose strukturelle und funktionelle Veränderungen im Gelenkknorpel aus. Im Verlauf der Arthrose gehen Beeinträchtigungen der mechanischen Eigenschaften mit strukturellen und biochemischen Veränderungen an der Oberfläche des Gelenkknorpels einher^27,31. Die frühesten pathologischen Ereignisse, die bei OA auftreten, sind die Erschöpfung von Proteoglykanen in Verbindung mit einer Störung des Kollagennetzwerk.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland	1397-89-3
Kopf für Rasterkraftmikroskopie (AFM);	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Deutschland	JPK00518
Biokompatibler Probenkleber	Bruker Nano GmbH, Berlin, Deutschland	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Zellmembrandurchlässiger Farbstoff, verwendet für die Sortierung von Knorpelscheiben - Draufsicht
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Deutschland	SAA-SPH-5UM	Frequenz Nom: 30KHz, k: 0,2N/m, Länge nom: 115μ m, Breite nom: 40μ m,  Geometrie: Rechteckige, zylindrische Spitze mit einem 5μ m Endradius
Knorpel cting Vorrichtung	Selbstgemacht	n/a	Schneidevorrichtung aus Kunststoff mit vordefinierten Löchern der im AFM integrierten 4mmx1mm
CDD-Kamera	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Deutschland	DFK 31BF03
CDD-Kamera, integriert in das Fluoreszenzmikroskop	Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland	DFC3000G
Kryotom	Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland	CM3050S
Die Datenverarbeitungssoftware für die AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Deutschland	n/a	Version 5.0.86 kann kostenlos von der folgenden Website heruntergeladen werden https://customers.jpk.com
Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Deutschland	41966052
Fluoreszenzmikroskop (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland	11889113
Glasblock-Cantiliver Halter	Bruker Nano GmbH, Berlin, Deutschland	SP-90-05	Extra langer Glasblock mit abgewinkelten Flächen, speziell für den Einsatz mit dem JPK PetriDishHeaterTM (Bruker) entwickelt.
Inverses Phasenkontrastmikroskop (integriert in das AFM)	AxioObserver D1, Carl-Zeiss-Mikroskopie, Jena, Deutschland	L201306_03
Leibovitz' L-15-Medium ohne L-Glutamin	Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland	F1315
Objektträger	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Eindeckmedium Mit DAPI	ibidi GmbH, Grä felfing, Deutschland	50011	Einbettmedien mit nukleärer DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)-Gegenfärbung für Knorpelscheiben  Seitenansichtsbildgebung
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Petrischale-Heizung in Verbindung mit AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Deutschland	T-05-0117
Skalpell	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silikonschürze	Bruker Nano GmbH, Berlin, Deutschland	n/a	Silikonschutzmembran (D55x0,25), die auf der Basis des Glasblocks platziert wird, um mittlere Kondensation im AFM-Kopf zu verhindern.
Statistisches Programm - SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Gewebekulturschalen	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Niederlande	SA6255012	Wasserlösliches Einbettmedium