Methodenartikel

Identifizierung und Isolierung von Burst-bildenden Einheiten und koloniebildenden Einheiten erythroider Vorläuferzellen aus Mausgewebe mittels Durchflusszytometrie

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DOI:

10.3791/64373

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4. November 2022

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMASS Chan Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine neuartige durchflusszytometrische Methode zur prospektiven Isolierung von Vorläuferzellen der frühen Burst-bildenden Einheit erythroid (BFU-e) und der koloniebildenden Einheit erythroid (CFU-e) direkt aus frischem Knochenmark und Milz der Maus. Dieses Protokoll, das auf der Grundlage von Einzelzell-Transkriptomdaten entwickelt wurde, ist das erste, das alle erythroiden Vorläuferzellen des Gewebes mit hoher Reinheit isoliert.

Zusammenfassung

Frühe erythroide Vorläufer wurden ursprünglich durch ihr koloniebildendes Potenzial in vitro definiert und in burstbildende und koloniebildende "Einheiten" eingeteilt, die als BFU-e und CFU-e bekannt sind. Bis vor kurzem gab es keine Methoden zur direkten prospektiven und vollständigen Isolierung von reinen BFU-e- und CFU-e-Vorläuferzellen aus frisch isoliertem adultem Mausknochenmark. Um diese Lücke zu schließen, wurde ein Einzelzell-RNA-seq-Datensatz (scRNAseq) des Knochenmarks von Mäusen auf die Expression von Genen analysiert, die für Zelloberflächenmarker kodieren. Diese Analyse wurde mit Zellschicksalstests kombiniert, was die Entwicklung eines neuartigen durchflusszytometrischen Ansatzes ermöglicht, der die Identifizierung und Isolierung vollständiger und reiner Untergruppen von BFU-e- und CFU-e-Vorläuferzellen im Knochenmark oder in der Milz der Maus ermöglicht. Dieser Ansatz identifiziert auch andere Vorläufer-Untergruppen, einschließlich Untergruppen, die für basophile/Mastzell- und megakaryozytäre Potentiale angereichert sind. Die Methode besteht darin, frische Knochenmark- oder Milzzellen mit Antikörpern zu markieren, die gegen Kit und CD55 gerichtet sind. Vorläufer, die diese beiden Marker exprimieren, werden dann in fünf Hauptpopulationen unterteilt. Population 1 (P1 oder CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high) enthält alle CFU-e-Vorläufer und kann weiter unterteilt werden in P1-low (CD71med CD150 high) und P1-hi (CD71 high CD150low), entsprechend frühen bzw. späten CFU-e; Population 2 (P2 oder BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71low CD150high) enthält alle BFU-e-Vorläufer; Die Population P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150 low CD41low) ist für basophile/mastzellige Vorläuferzellen angereichert; Population 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41+) ist für megakaryozytäre Vorläuferzellen angereichert; und Population 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41-) enthält Vorläuferzellen mit erythroidem, basophilem/mastzelligem und megakaryozytärem Potential (EBMP) und erythroiden/megakaryozytären/basophil-biased Multipotential-Progenitoren (MPPs). Dieser neuartige Ansatz ermöglicht eine höhere Präzision bei der Analyse von erythroiden und anderen hämatopoetischen Vorläuferzellen und ermöglicht auch die Referenzierung von Transkriptominformationen für jede durchflusszytometrisch definierte Population.

Einleitung

Die Erythropoese kann in zwei Hauptphasen unterteilt werden: frühe Erythropoese und erythroide terminale Differenzierung (Abbildung 1)1,2,3. Bei der frühen Erythropoese binden sich hämatopoetische Stammzellen an die erythroide Linie und führen zu frühen erythroiden Vorläuferzellen, die erstmals in den 1970er Jahren aufgrund ihres koloniebildenden Potenzials im halbfesten Medium 4,5,6,7,8,9 identifiziert wurden . Im Großen und Ganzen werden erythroide Vorläuferzellen in zwei Kategorien unterteilt: frühere Vorläufer, die jeweils zu einem "Burst" (einem großen Aggregat kleinerer erythroider Zellverbände) führen, der als "burst-bildende Einheit Erythroid" oder BFU-e 4,5,6 bezeichnet wird; und ihre Nachkommen, die jeweils einen einzelnen, kleinen erythroiden Zellhaufen oder eine Kolonie bilden, die als "koloniebildende Einheit Erythroid" oder CFU-e 7,8,9 bezeichnet wird. BFU-e und CFU-e exprimieren noch keine terminalen erythroiden Gene und sind morphologisch nicht erkennbar. Nach einer Reihe von Selbsterneuerungs- oder Expansionszellteilungen durchläuft die CFU-e einen Transkriptionsschalter, bei dem erythroide Gene wie Globine induziert werden, wodurch sie in eine erythroide terminale Differenzierung (ETD) übergeht1,10. Während der ETD durchlaufen Erythroblasten drei bis fünf reifende Zellteilungen, bevor sie zu Retikulozyten enukleieren, die zu roten Blutkörperchen heranreifen.

Erythroblasten während der terminalen Differenzierung wurden ursprünglich aufgrund ihrer Morphologie in Proerythroblasten, basophile, polychromatische und orthochromatische eingeteilt. Das Aufkommen der Durchflusszytometrie ermöglichte ihre prospektive Sortierung und Isolierung basierend auf der Zellgröße (gemessen durch Vorwärtsstreuung, FSC) und zwei Zelloberflächenmarkern, CD71 und Ter11911,12,13 (Abbildung 1). Dieser und ähnliche durchflusszytometrische Ansätze 14 haben die Untersuchung der molekularen und zellulären Aspekte der ETD revolutioniert und ermöglichen eine entwicklungsstadienspezifische Analyse von Erythroblasten in vivo und in vitro 10,15,16,17,18,19,20. Der CD71/Ter119-Ansatz wird heute routinemäßig in der Analyse von erythroiden Vorstufen eingesetzt.

Bis vor kurzem war ein ähnlicher, zugänglicher durchflusszytometrischer Ansatz für die direkte, hochreine prospektive Isolierung von CFU-e und BFU-e aus Mausgewebe den Forschern entgangen. Stattdessen haben die Forscher durchflusszytometrische Strategien verwendet, die nur einen Bruchteil dieser Vorläuferzellen isolieren, oft in Gegenwart von nicht-erythroiden Zellen, die innerhalb derselben durchflusszytometrischen Untergruppen co-reinigen21. Folglich beschränkte sich die Untersuchung von BFU-e und CFU-e auf In-vitro-Differenzierungssysteme, die BFU-e und CFU-e von früheren Vorläuferzellen des Knochenmarks ableiten und amplifizieren. Es ist dann möglich, durchflusszytometrische Strategien anzuwenden, die CFU-e von BFU-e in diesen erythroid-mit Vorläuferzellen angereicherten Kulturen unterscheiden22,23. Ein alternativer Ansatz verwendet fetale CFU-e und BFU-e, die in der Mitte der Schwangerschaft stark mit der Ter119-negativen Fraktion der fetalen Leber der Maus angereichert sind 10,24,25. Keiner dieser Ansätze erlaubt es jedoch, adulte BFU-e und CFU-e in ihrem physiologischen Zustand in vivo zu untersuchen. Das Ausmaß der Herausforderung kann eingeschätzt werden, wenn man sich daran erinnert, dass diese Zellen auf der Grundlage von Koloniebildungstests im adulten Knochenmark mit einer Häufigkeit von nur 0,025% bzw. 0,3% vorhanden sind6.

Das hier beschriebene Protokoll ist ein neuartiger durchflusszytometrischer Ansatz, der auf einer einzelzelligen transkriptomischen Analyse von frisch geernteten Kit+ Maus-Knochenmarkzellen basiert (Kit wird von allen frühen Vorläuferpopulationen des Knochenmarks exprimiert)1. Unser Ansatz enthält einige Zelloberflächenmarker, die bereits von Pronk et al.21,26 verwendet wurden. Einzelzell-Transkriptome wurden verwendet, um Kombinationen von Zelloberflächenmarkern zu bestimmen, die erythroide und andere frühe hämatopoetische Vorläuferzellen identifizieren (Abbildung 2). Insbesondere kann der CD55+-Anteil von Lineage-negativen (Lin-) Kit+-Zellen in fünf Populationen unterteilt werden, von denen drei zusammenhängende Segmente der erythroiden Trajektorie ergeben (Abbildung 2). Die transkriptomischen Identitäten jeder dieser Populationen wurden durch Sortierung bestätigt, gefolgt von scRNAseq und Projektion der sortierten Einzelzell-Transkriptome zurück auf die ursprüngliche transkriptomische Karte (die Genexpression in jeder der fünf Populationen und der gesamte Knochenmarkdatensatz können in https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html untersucht werden)1 . Das Zellschicksalspotenzial jeder der Populationen wurde mit traditionellen Koloniebildungstests (Abbildung 2) sowie einem neuartigen Hochdurchsatz-Einzelzell-Schicksalstestbestätigt 1,27. Diese Analysen zeigen, dass der neuartige durchflusszytometrische Ansatz zu einer hochreinen Isolierung aller BFU-e- und CFU-e-Vorläuferzellen von frischem adultem Knochenmark und Milz führt. Insbesondere enthält Population 1 (P1) nur CFU-e und keine anderen hämatopoetischen Vorläufer, und Population 2 (P2) enthält alle BFU-e-Vorläufer des Knochenmarks und eine kleine Anzahl von CFU-e, aber keine anderen Vorläufer1. Das detaillierte Protokoll unten wird mit einem Beispielexperiment an Mäusen veranschaulicht, denen entweder Kochsalzlösung oder das Erythropoese-stimulierende Hormon Erythropoietin (Epo) injiziert wurden.

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Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Tierprotokollen A-1586 durchgeführt und 202200017 vom Institutional Animal Care and Use Committee der Chan Medical School der University of Massachusetts genehmigt.

ANMERKUNG: Hier werden zwei Protokolle beschrieben: Erstens die durchflusszytometrische Analyse (Abschnitt 1), gefolgt von Protokollanpassungen für die durchflusszytometrische Sortierung (Abschnitt 2). Das folgende Protokoll verwendet ein Durchflusszytometer/-sortiergerät mit 10 Kanälen. Ein Beispiel für eine Einrichtung ist in Tabelle 1 enthalten, auf die in Schritt 1.14.5 verwiesen wird. Es ist auch möglich, dieses Protokoll mit nur neun Kanälen zu betreiben. siehe Legende in Tabelle 2.

1. Durchflusszytometrische Analyse

  1. Euthanasieren Sie erwachsene (>6 Wochen alte) Balb/C- oder C57BL6-Mäuse mit einer geeigneten Methode, die von Ihrem Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurde (z. B. CO2 -Inhalation mit anschließender Gebärmutterhalsluxation). Für die durchflusszytometrische Analyse ist das Knochenmark (BM) einer einzelnen Maus ausreichend. Bei der Sortierung hängt die Anzahl der Mäuse von den nachgeschalteten Anwendungen ab. Die Zellausbeute für jede Population ist unten angegeben (Schritt 2.3.3).
  2. Gewebeentnahme:
    1. Bereiten Sie 5 ml Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierröhrchen (FACS) mit 3 ml kaltem (4 °C) Färbepuffer ("SB5": phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,08 % Glukose, 5 mM EDTA) auf Eis vor. Verwenden Sie dies, um geerntete Gewebe zu platzieren.
    2. Bereiten Sie separate Röhrchen für jedes Gewebe vor, das von jeder Maus seziert wird. Sammeln Sie kein Gewebe von mehreren Mäusen.
    3. Ernten Sie beide Oberschenkelknochen und beide Tibias. Entfernen Sie alle Muskeln aus den Knochen, bevor Sie sie mit SB5 in die Röhre legen.
    4. Sezieren Sie die Milz durch einen Schnitt auf der linken Seite des Bauches.
  3. Extraktion von Knochenmarkzellen:
    1. Legen Sie die frisch präparierten Oberschenkelknochen und Tibien direkt in den Kaltfärbepuffer (SB5) und halten Sie die Röhrchen auf Eis, bis Sie bereit sind, das Knochenmark (BM) zu entnehmen. Legen Sie einen sauberen sterilisierten Mörser auf Eis in einen Eimer. Übertragen Sie die Knochen zusammen mit dem SB5 aus dem Röhrchen in den Mörtel.
    2. Schneiden Sie etwa 1 mm von den Enden jedes Knochens mit einer Sezierschere ab, so dass die Öffnung des Knochens gerade noch sichtbar wird.
    3. Verwenden Sie eine 26-G-Nadel und eine mit SB5 gefüllte 3-ml-Spritze, um das Knochenmark aus den Knochen zu spülen und in den Mörser zu geben. Wiederholen Sie den Vorgang 3-5 Mal mit frischem Puffer, bis die Knochen farblos erscheinen.
    4. Filtern Sie das gespülte Knochenmark durch einen 100-μm-Maschenfilter und sammeln Sie die Zellen in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das auf Eis gelegt wird.
    5. Verwenden Sie den Mörser und den Stößel, um die gespülten Knochen in 5-10 ml SB5 zu zerkleinern. Das Gemisch aus zerkleinerten Knochen und Puffer wird durch das 100-μm-Zellsieb und den Pool mit den in Schritt 1.3.4 gesammelten Zellen filtriert.
  4. Milzzellextraktion:
    1. Stellen Sie einen 100-μm-Mesh-Filter auf einem leeren 50-ml-Zentrifugenröhrchen auf, das auf Eis gelegt wird. Legen Sie eine einzelne Milz auf den Netzfilter.
    2. Geben Sie 0,5-1 ml SB5 in die Milz, um sicherzustellen, dass sie nicht austrocknet.
    3. Drücken Sie die Milz mit der Gummiseite eines 3-ml- oder 5-ml-Spritzenkolbens durch das Netz. Fügen Sie mehr SB5, 5 ml auf einmal hinzu und pürieren Sie weiter, bis alle Zellen im Röhrchen gesammelt sind.
  5. Ab diesem Zeitpunkt werden das Knochenmark und die Milzzellen auf die gleiche Weise behandelt.
  6. Die Zellen werden bei 900 x g, 4 °C für 10 min heruntergeschleudert. Saugen Sie den Überstand mit einem Vakuum-Aspirations-Setup ab.
  7. Um eine einzellige Suspension herzustellen, resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml SB5 und pipenieren Sie 50 Mal mit einem P1000 mit einer großen Blendenspitze auf und ab (siehe Materialtabelle). Diese haben breite Spitzenöffnungen, um Schäden an zerbrechlichen Zellen zu vermeiden.
  8. Um die Zellen zu zählen, resuspendieren, indem Sie 20 Mal auf und ab pipettieren. Verdünnen Sie die Zellen im Verhältnis 1:100 in SB5. Mischen Sie 10 μl der verdünnten Zellen mit 10 μl Trypanblau und zählen Sie auf ein Hämozytometer und/oder einen Zellzähler.
  9. Die Zellen werden bei 900 x g, 4 °C für 10 min heruntergeschleudert. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen bei 33 x 106 lebenden Zellen/ml in SB5.
  10. Bereiten Sie den Lin-FITC-Cocktail vor, indem Sie die gleichen Volumina jedes Antikörpers in Tabelle 3 mischen.
  11. Bereiten Sie die Zellen für einfarbige Kontrollen und "Fluoreszenz-Minus-eins"-Kontrollen (FMO) vor. Führen Sie die Schritte 1.11-1.12 parallel zur Vorbereitung und Färbung der Probenzellen in Schritt 1.14 (Proben für die durchflusszytometrische Analyse) und/oder Schritt 2.1 (durchflusszytometrische Sortierung) durch.
    1. Bereiten Sie die Zellen für eine ungefärbte Zellkontrolle vor, indem Sie 50 μL (1,6 x 106 Zellen) der Zellsuspension in ein FACS-Röhrchen auf Eis überführen. Bereiten Sie die Zellen für jede einzelne Farbkontrolle (11 Röhrchen) vor, indem Sie 50 μL (1,6 x 106 Zellen) der Zellsuspension in ein FACS-Röhrchen auf Eis überführen.
    2. Bereiten Sie FMO-Kontrollen für die folgenden Farben vor (Kit, CD41, CD150, CD49f [vier Röhrchen]), indem Sie 300 μL (10 x 106 Zellen) der Zellsuspension in ein separates FACS-Röhrchen auf Eis überführen.
    3. Die Zellen werden bei 900 x g, 4 °C für 10 min heruntergeschleudert und der Überstand abgesaugt.
  12. Antikörperfärbung von FMOs und einfarbigen Kontrollen
    1. Färben Sie die FMOs mit 33 x 106 Zellen/ml (in einem Gesamtvolumen von 300 μL) in FACS-Röhrchen. Fügen Sie für jede Kontrolle alle Antikörper mit Ausnahme des gleichnamigen Antikörpers des FMO hinzu. Lassen Sie beispielsweise für den Kit-FMO den Kit-Antikörper weg. Für jeden Antikörper sind die Verdünnungs- und Endkonzentration wie in Tabelle 2 angegeben.
    2. Färben Sie die einfarbigen Kontrollen bei 20 x 106 Zellen/ml (in einem Gesamtvolumen von 50 μl) in FACS-Röhrchen; Für jede Kontrolle wird ein einzelner Antikörper in der in Tabelle 2 angegebenen Konzentration zugegeben.
    3. Jedes Steuerrohr für 2-3 s bei 3.000 U/min (Umdrehungen pro Minute) schwenken und dann bei 4 °C inkubieren, 2,5 h im Dunkeln vor Licht geschützt. Die Rohre werden mit einer Drehachse parallel zur Länge des Rohres zwischen einem Winkel von etwa 10° und 60° von der Horizontalen geschüttelt, so dass der Inhalt die Kappe nicht berührt.
    4. Waschen Sie die Zellen mit SB5: Füllen Sie das Volumen der Zellsuspension mit SB5 auf 4 ml auf. Die Zellen werden bei 900 x g, 4 °C für 10 min heruntergeschleudert und der Überstand abgesaugt.
  13. Zellresuspension:
    1. Resuspendieren Sie die ungefärbte und alle einfarbigen Regler (mit Ausnahme der DAPI-Steuerung) in 300 μL SB5 und filtern Sie durch ein 40-μm-Filtergitter in ein neues FACS-Röhrchen.
    2. Stellen Sie eine DAPI / SB5-Lösung her, indem Sie den DAPI-Stamm (1 mg / ml in 100% Ethanol) bei 1:10.000 in SB5 verdünnen.
    3. Resuspendieren Sie die FMOs in 1,8 mL DAPI/SB5 und filtrieren Sie durch ein 40-μm-Filtergewebe in ein neues FACS-Röhrchen.
    4. Resuspendieren Sie die DAPI-Einfarbregelung in 300 μL DAPI/SB5 und filtrieren Sie durch ein 40-μm-Filtergitter in ein neues 4-ml-FACS-Röhrchen.
  14. Probenvorbereitung: Wenn die Zellen für die durchflusszytometrische Analyse vorbereitet werden, fahren Sie mit Schritt 1.14 fort. Wenn Sie die Zellen für die Sortierung vorbereiten, fahren Sie mit Schritt 2.1 fort.
  15. Färben Sie die durchflusszytometrischen Analyseproben bei 33 x 10 6 Zellen/ml in einem Gesamtvolumen von 300 μL (10 x 106 Zellen) in FACS-Röhrchen:
    1. Bereiten Sie die Antikörper-Mastermischung vor. Bestimmen Sie das Volumen der Mastermischung anhand der Anzahl der Proben mit 300 μL pro Probe. Stellen Sie die Mastermischung her, indem Sie alle in Tabelle 2 aufgeführten Antikörper mit der angegebenen Verdünnung in SB5 verdünnen. Das Kaninchen-IgG im Master-Mix dient als Fc-Block.
    2. Jede Röhre 2-3 s bei 3.000 U/min schwenken und dann bei 4 °C inkubieren, 2,5 Stunden im Dunkeln vor Licht geschützt schaukeln.
    3. Waschen Sie die Zellen mit SB5: Füllen Sie das Volumen der Zellsuspension mit SB5 auf 4 ml auf. Die Zellen werden bei 900 x g, 4 °C für 10 min heruntergeschleudert und der Überstand abgesaugt.
    4. Die Proben werden für die durchflusszytometrische Analyse in 1,8 ml DAPI/SB5 resuspendiert, wie in Schritt 1.12.5.2 vorbereitet, und durch ein 40-μm-Filtergitter in ein FACS-Röhrchen filtriert.
    5. Analysieren Sie die Proben auf einem Zytometer mit 10 Kanälen, um die Antikörperkonjugate in Tabelle 2 und den Viabilitätsfarbstoff DAPI aufzunehmen. Ein Beispiel für die Kanaleinrichtung ist in Tabelle 1 enthalten. Es ist auch möglich, nur neun Kanäle zu verwenden; Weitere Informationen finden Sie in der Legende von Tabelle 2 .
    6. Verwenden Sie bei der Analyse der Durchflusszytometriedaten Standard-Spektralkompensationsansätze mit Hilfe der Einfarbregler und FMO-Kontrollen, wie in Schritt 2.4 beschrieben.

2. Protokollanpassungen für die durchflusszytometrische Sortierung

  1. Zubereitung von Lin-
    1. Sammeln Sie alle extrahierten Zellen aus demselben Gewebe (entweder BM oder Milz) von 10 Mäusen in einem 50-ml-Röhrchen. Resuspendieren Sie jede gepoolte Probe, indem Sie mit einem P1000 mit einer großen Blendenspitze pipettieren.
    2. Die Zellen werden bei 900 x g, 4 °C für 10 min heruntergeschleudert und der Überstand abgesaugt.
    3. Bereiten Sie einfarbige und FMO-Kontrollen vor, wie in Abschnitt 1 beschrieben, unter Verwendung nicht angereicherter Zellen.
    4. Anreicherung von Lin-Zellen zur Sortierung mittels magnetischer Perlenanreicherung von Lin-Zellen:
    5. Resuspendieren Sie die Zellen bei 1 x 108 Zellen/ml mit SB5 und übertragen Sie sie in ein 15 ml Röhrchen. Normales Rattenserum und die in Tabelle 4 aufgeführten biotinylierten Antikörper zugeben und 1 Stunde lang bei 4 °C inkubieren.
    6. Die Zellen werden bei 900 x g, 4 °C für 10 min nach unten gedreht und der Überstand abgesaugt. Resuspendieren Sie die Zellen in 15 ml kaltem SB5.
    7. Die Zellen werden bei 900 x g, 4 °C für 10 min nach unten gedreht und der Überstand abgesaugt. Resuspendieren Sie die Zellen bei 1 x 108 Zellen/ml in kaltem SB5 und halten Sie sie auf Eis.
    8. Wirbeln Sie die magnetischen Nanokügelchen bei 3.000 U/min für 5-10 s. Nehmen Sie 1 ml magnetische Nanokügelchen pro 10 ml Zellen.
    9. Waschen Sie die Nanokügelchen in einem 5 ml FACS-Röhrchen. Das Volumen mit SB5 auf 4 ml auffüllen, bei 900 x g, 4 °C für 5 min schleudern und den Überstand absaugen.
    10. Die Nanokügelchen werden in 500 μl SB5 resuspendiert und mit den in Schritt 2.1.7 hergestellten Zellen vermischt. Bei 4 °C unter Schaukeln 15 min inkubieren.
    11. Die Zellen werden bei 900 x g, 4 °C für 10 min nach unten gedreht und der Überstand abgesaugt. Resuspendieren Sie die Zellen bei 1 x 108 Zellen/ml mit SB5.
    12. Legen Sie das Röhrchen für 5 min bei 4 °C auf einen Magneten.
    13. Gießen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues 15-ml-Röhrchen.
    14. Das Röhrchen mit dem Überstand aus Schritt 2.1.13 wird 5 min lang bei 4 °C auf einen Magneten gelegt. Gießen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues 15-ml-Röhrchen.
    15. Die Zellen aus dem Überstand werden in Schritt 2.1.14 bei 900 x g, 4 °C für 10 min gedreht und der Überstand abgesaugt.
    16. Resuspendieren Sie die mit Lin angereicherten Zellen in 1 ml SB5.
    17. Verdünnen Sie 10 μL der Zellen bei 1:100 in SB5. Mischen Sie 10 μl der verdünnten Zellen mit 10 μl Trypanblau und zählen Sie auf ein Hämozytometer und/oder einen Zellzähler.
    18. Basierend auf der Zellzahl in Schritt 2.1.17 resuspendieren Sie die mit Lin angereicherten Zellen bei 33 x 106 Zellen/ml.
  2. Färbung von angereicherten Zellen:
    1. Färben Sie die angereicherten Zellproben bei 33 x 106 Zellen/ml in FACS-Röhrchen, indem Sie alle in Tabelle 2 aufgeführten Antikörper hinzufügen. Jede Röhre 2-3 s bei 3.000 U/min schwenken und dann bei 4 °C inkubieren, 2,5 Stunden im Dunkeln vor Licht geschützt schaukeln.
    2. Waschen Sie die Zellen mit SB5: Füllen Sie das Volumen der FACS-Röhrchen mit SB5 auf 4 ml auf. Die Zellen werden bei 900 x g, 4 °C für 10 min heruntergeschleudert und der Überstand entfernt.
    3. Die Proben werden für die durchflusszytometrische Analyse in 4-6 ml DAPI/SB5, wie in Schritt 1.12.5.2 vorbereitet, resuspendiert und durch ein 40-μm-Filternetz in ein neues 4-ml-FACS-Röhrchen filtriert.
  3. Sortierung der Proben:
    1. Sortieren Sie die Proben mit einer großen Düse und niedrigem Druck, um die CFU-e-Ausbeute zu maximieren, da CFU-e-Zellen unter hohem Druck leicht beschädigt werden können. Für das in dieser Studie verwendete Durchflusszytometer verwenden Sie 14 psi und eine 100-μm-Düse oder 12 psi mit einer 130-μm-Düse. Richten Sie die Sortiertore ein, wie in Schritt 2.4 unten beschrieben.
    2. Bereiten Sie den Sammelpuffer vor: Fügen Sie 20% fötales Rinderserum zu PBS hinzu.
    3. Um die Reinheit der sortierten Grundgesamtheiten zu überprüfen, führen Sie erneut einen kleinen Aliquot aus jeder sortierten Grundgesamtheit in einem Puffer aus, der DAPI enthält, wie in Schritt 1.12.5.2 beschrieben.
      HINWEIS: Typischerweise ergibt BM von insgesamt 10 Mäusen (ca. 1 x 109 Zellen) mindestens 50.000-100.000 Zellen für jede der P1-hi-, P1-Low- und P2-Populationen mit einer Lebensfähigkeit von ca. 70%.
  4. Verwenden Sie die in Abbildung 3 dargestellte Anschnittstrategie für die Analyse oder die Einrichtung der Sortiergates.
    1. Verwenden Sie den FSC-Parameter (Forward-Scatter), um die Trümmer basierend auf der Größe zu entfernen. Verwenden Sie das FSC-Höhen- und FSC-Flächenhistogramm, um Zellaggregate auszuschließen und einzelne Zellen auszuwählen. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem Histogramm der Seitenstreuung (SSC) über die SSC-Fläche.
    2. Schließen Sie die toten Zellen aus, indem Sie die Zellen ausschließen, die positiv für den DNA-Farbstoff DAPI sind, für den lebensfähige Zellen undurchlässig sind.
    3. Wählen Sie Lin-Ter119-Kit+-Zellen aus und wählen Sie aus diesen eine Subpopulation aus, die CD55 exprimiert.
    4. Unterteilen Sie die Lin-Ter119-Kit+CD55+-Zellen in zwei Hauptpopulationen, P6 und P7, basierend auf der Expression von CD49f und CD105.
    5. Basierend auf der Expression von CD150 und CD41 wird P6 weiter unterteilt in P3 (basophile oder Mastzellvorläufer), P4 (megakaryozytäre Vorläuferzellen) und P5 (EBMP und erythroid-biased MPP).
    6. Basierend auf der Expression von CD150 und CD71 wird P7 weiter unterteilt in P2 (BFU-e), frühe CFU-e (P1-niedrig) und späte KBE-e (P1-hi).

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Ergebnisse

Das Protokoll beschreibt einen durchflusszytometrischen Ansatz zur Identifizierung von BFU-es und CFU-es in frisch geernteten Knochenmark- und Milzzellen. Es beginnt mit der Ernte von frischem BM und Milz von Mäusen und dem sofortigen Aufbringen des Gewebes auf Eis. Alle Verfahren werden in der Kälte durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Die Zellen werden mit einem "Abstammungs"-Antikörper-Cocktail markiert, der den Ausschluss aller Zellen ermöglicht, die Marker differenzierter Blutlinien exprimier...

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Diskussion

Die Fähigkeit, BFU-e- und CFU-e-Vorläufer prospektiv direkt aus frischem Gewebe mit hoher Reinheit zu isolieren, war den Forschern bisher entgangen. Unser neuartiger Ansatz, der mit scRNAseq und Zellschicksalstests 1,27 validiert wurde, bietet nun die Werkzeuge dafür.

Es gibt eine Reihe von Schlüsselpunkten für die erfolgreiche Ausführung sowohl der Sortier- als auch der Analyseprotokolle. Zuerst müssen die Zellen bei 900 x g ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wird durch die NIH-Zuschüsse R01DK130498, R01DK120639 und R01HL141402 unterstützt

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 M EDTA, pH 8,0Life Technologies15575020
1000 & Mikro; L Spitzen mit großer ÖffnungUSA sceintific1011-9000
Alexa Fluor 647 Anti-Maus CD55 (DAF) AntikörperBioLegend131806
APC/Cyanin7 Anti-Maus CD117 (c-kit) AntikörperBioLegend105826
Biotin-CD11bBD Biosciences557395M1/70 (Klon)
Biotin-CD19BD Biosciences5537841D3 (Klon)
Biotin-CD4BD BiosciencesBDB553045RM4-5 (Klon)
Biotin-CD8aBD BiosciencesBDB553029 53-6.7 (Klon)
Biotin-F4/80Biolegend123106BM8 (Klon)
Biotin-Ly-6G und Ly-6CBD Biosciences553125RB6-8C5 (Klon)
Biotin-TER-119BD Biosciences553672TER-119 (Klon)
Rinderserum AlbuminSigma AldritchA1470
Brilliant Violet 421 Anti-Mensch/Maus CD49f AntikörperBioLegend313624
Brilliant Violet 605 Anti-Maus CD41 AntikörperBioLegend133921
Brilliant Violet 650 Anti-Maus CD150 (SLAM) AntikörperBioLegend115931
BUV395 Ratte Anti-Maus TER-119/Erythroid ZellenBD Biosciences563827
ChromReines Kaninchen-IgG, ganzes MolekülJackson ImmunoResearch Laboratories011-000-003
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)Life TechnologiesD1306
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Referenzen

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