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Methodenartikel

Die Mechanik (poro-)elastischer kontraktiler Actomyosin-Netzwerke als Modellsystem des Zellzytoskeletts

1.6K Aufrufe

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DOI:

10.3791/64377

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10. März 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Ben Gurion University of the Negev, 2Department of Chemical Engineering, Ilse Kats Institute for Nanoscale Science and Technology, Ben Gurion University of the Negev

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird ein in vitro Rekonstitutionsansatz verwendet, um die Poroelastizität von Aktomyosingelen unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. Die Dynamik des Aktomyosingels und des eingebetteten Lösungsmittels wird quantifiziert, wodurch die Netzwerkporoelastizität nachgewiesen wird. Wir diskutieren auch die experimentellen Herausforderungen, häufige Fallstricke und die Relevanz für die Mechanik des Zellzytoskeletts.

Zusammenfassung

Zellen können aktiv ihre Form verändern und beweglich werden, eine Eigenschaft, die von ihrer Fähigkeit abhängt, ihre innere Struktur aktiv neu zu organisieren. Diese Eigenschaft wird auf die mechanischen und dynamischen Eigenschaften des Zellzytoskeletts zurückgeführt, insbesondere auf das Aktomyosin-Zytoskelett, das ein aktives Gel aus polaren Aktinfilamenten, Myosinmotoren und akzessorischen Proteinen ist, die intrinsische Kontraktionseigenschaften aufweisen. Die allgemein akzeptierte Ansicht ist, dass sich das Zytoskelett wie ein viskoelastisches Material verhält. Dieses Modell kann jedoch nicht immer die experimentellen Ergebnisse erklären, die eher mit einem Bild übereinstimmen, das das Zytoskelett als poroelastisches aktives Material beschreibt - ein elastisches Netzwerk, das in Zytosol eingebettet ist. Kontraktilitätsgradienten, die von den Myosinmotoren erzeugt werden, treiben den Fluss des Zytosols durch die Gelporen an, was darauf schließen lässt, dass die Mechanik des Zytoskeletts und des Zytosols eng gekoppelt sind. Ein Hauptmerkmal der Poroelastizität ist die diffusive Relaxation von Spannungen im Netzwerk, die durch eine effektive Diffusionskonstante gekennzeichnet ist, die vom Elastizitätsmodul des Gels, der Porosität und der Viskosität des Zytosols (Lösungsmittels) abhängt. Da Zellen viele Möglichkeiten haben, ihre Struktur und Materialeigenschaften zu regulieren, ist unser derzeitiges Verständnis darüber, wie die Mechanik des Zytoskeletts und die Dynamik des Zytosolflusses gekoppelt sind, noch wenig verstanden. Hier wird ein in vitro Rekonstitutionsansatz verwendet, um die Materialeigenschaften von poroelastischen Aktomyosingelen als Modellsystem für das Zellzytoskelett zu charakterisieren. Die Gelkontraktion wird durch die motorische Kontraktilität des Myosins angetrieben, die zur Entstehung eines Flusses des eindringenden Lösungsmittels führt. Der Artikel beschreibt, wie diese Gele hergestellt und Experimente durchgeführt werden. Wir diskutieren auch, wie der Lösungsmittelfluss und die Gelkontraktion sowohl auf lokaler als auch auf globaler Ebene gemessen und analysiert werden können. Die verschiedenen Skalierungsrelationen, die für die Datenquantifizierung verwendet werden, werden angegeben. Abschließend werden die experimentellen Herausforderungen und häufigen Fallstricke diskutiert, einschließlich ihrer Relevanz für die Mechanik des Zellzytoskeletts.

Einleitung

Lebende Zellen haben einzigartige mechanische Eigenschaften. Neben der Fähigkeit, passiv auf einwirkende Kräfte zu reagieren, sind sie auch in der Lage, aktiv Kräfte als Reaktion auf äußere Reize zu erzeugen1. Diese Eigenschaften, die für eine Vielzahl von zellulären Prozessen, insbesondere während der Zellmotilität, unerlässlich sind, werden in erster Linie auf die mechanischen und dynamischen Eigenschaften des Zellzytoskeletts zurückgeführt, insbesondere auf das Aktomyosin-Zytoskelett, das ein aktives Gel aus polaren Aktinfilamenten, Myosin-Molekularmotoren und akzessorischen Proteinen ist. Diese Aktomyosin-Netzwerke weisen intrinsische Selbstorganisations- und Kontraktionseigenschaften auf, die von den Myosin-Motorproteinen angetrieben werden, die die Aktinfilamente vernetzen und aktiv mechanische Spannungen in dem Netzwerk erzeugen, das durch ATP-Hydrolyse angetrieben wird2.

Zahlreiche experimentelle und theoretische Studien wurden durchgeführt, um die Materialeigenschaften des Zytoskeletts3 zu untersuchen. Die allgemein akzeptierte Ansicht ist, dass sich das Zytoskelett wie ein viskoelastisches Material verhält4. Das bedeutet, dass sich das Zytoskelett auf kurzen Zeitskalen wie ein elastisches Material verhält und sich auf langen Zeitskalen aufgrund der Vernetzung von Proteinen und der Ablösung (und Wiederanheftung) des Myosinmotors wie eine viskose Flüssigkeit verhält, wodurch sich das Netzwerk dynamisch drehen kann. In vielen Situationen kann das viskoelastische Modell jedoch nicht die experimentellen Ergebnisse beschreiben, die eher mit einem Bild übereinstimmen, das das Zytoskelett und allgemeiner das Zellzytoplasma als poroelastisches aktives Material beschreibt 5,6. Zwei Hauptmerkmale charakterisieren diese Art von Materialien. (i) Das erste Hauptmerkmal ist die Erzeugung eines Flusses des eindringenden Zytosols (des "Lösungsmittels") durch die Gelporen durch Kontraktilitätsgradienten, die von den Myosinmotoren angetrieben werden, was Prozessen wie Zellblasen7, Motilität8 und Zellformoszillationen9 zugrunde liegt. Die Entstehung solcher zytosolischen Flüsse kann lokal sein, zum Blebbing, oder global, wie bei der Zellmotilität. Im letzteren Fall treiben die kontraktil aufgebrachten Spannungen an der Zellrückseite den Fluss der zytosolischen Flüssigkeit in Richtung Zellfront an, wodurch der Proteinpool wieder aufgefüllt wird, der für die Lamellipodien-Assemblierung benötigtwird 8. (ii) Das zweite Hauptmerkmal besteht darin, dass die Relaxation von Spannungen diffusiv ist und durch eine effektive Diffusionskonstante gekennzeichnet ist, die vom Elastizitätsmodul des Gels, der Porosität des Gels und der Viskosität des Lösungsmittelsabhängt 5. Die poroelastische Diffusionskonstante bestimmt, wie schnell das System auf eine aufgebrachte Spannung reagiert. Höhere Diffusionskonstanten entsprechen einer schnelleren Spannungsumverteilung. Dies wiederum bestimmt, wie lange es dauert, bis die intrazelluläre zytosolische Flüssigkeit nach mechanischer Belastung, sei es von außen oder von innen, wie z. B. den aktiven kontraktilen Belastungen, die von Myosinmotoren erzeugt werden, innerhalb der Zelle umverteilt wird. Diese Beispiele zeigen somit, dass die Mechanik des Zytoskeletts und des Zytosols eng gekoppelt sind und nicht getrennt voneinander behandelt werden können3.

Da Zellen ihre mechanischen Eigenschaften auf unterschiedliche Weise regulieren können, ist das Zusammenspiel zwischen Netzwerkmechanik und Strömungsdynamik noch wenig verstanden. Ein leistungsfähiger alternativer Ansatz ist die Verwendung von in vitro rekonstituierten Systemen, die eine vollständige Kontrolle über die verschiedenen mikroskopischen Bestandteile und die Systemparameter ermöglichen, wodurch diese Modellsysteme optimal für die physikalische Analyse geeignet sind10,11. Dieser Ansatz wurde erfolgreich eingesetzt, um den Einfluss der Proteinzusammensetzung und der Systemgeometrie auf die Aktin-basierte Motilität 12,13,14,15,16,17,18 und die 2D-Musterung von Aktomyosin-Netzwerken 19,20,21,22 zu untersuchen und das Zusammenspiel zwischen Netzwerkkontraktilität und Fluidströmungsdynamik poroelastischer Aktomyosingele, das im Mittelpunkt dieser Arbeitsteht 23.

In diesem Manuskript wird die Herstellung von kontraktilen elastischen Aktomyosin-Netzwerken mit kontrollierbaren Dimensionen und Materialeigenschaften auf der Grundlage der Arbeiten von Ideses et al.23 diskutiert. Die Dynamik des kontrahierenden Gels und des drainierten Lösungsmittels wird analysiert und quantifiziert, wodurch gezeigt wird, dass diese Aktomyosingele als poroelastisches aktives Material beschrieben werden können. Die Untersuchung des Einflusses der Lösungsmittelviskosität auf die Spannungsdiffusionsfähigkeit bestätigt die poroelastische Natur dieser Netzwerke. Die verschiedenen Skalierungsrelationen, die für die Datenquantifizierung verwendet werden, werden bereitgestellt. Schließlich werden auch die experimentellen Herausforderungen, die häufigsten Fallstricke und die Relevanz der experimentellen Ergebnisse für das Zellzytoskelett diskutiert.

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Protokoll

1. Glasoberflächenbehandlung und Passivierung:

HINWEIS: Dieser Abschnitt umfasst drei Hauptschritte (siehe Abbildung 1): (i) Reinigung und Hydrophilierung, (ii) Silanisierung und (iii) Oberflächenpassivierung.

  1. Reinigung und Hydrophilierung
    1. Verwenden Sie Piranha-Lösung für die Reinigung von Glasoberflächen.
      HINWEIS: Die Piranha-Lösung ist ein Gemisch aus 30 % H2 O2 und 70 %H2 SO4 (Materialtabelle). Sein Hauptziel ist es, organische Verunreinigungen von Deckglasoberflächen zu entfernen und die OH-Gruppen auf der Glasoberfläche freizulegen. Auf diese Weise wird die Glasoberfläche hydrophil.
    2. Legen Sie 10-12 #1,5 (22 mm x 22 mm) Glasdeckgläser (Materialtabelle) in einen selbstgebauten Polytetrafluorethylenhalter (Grundfläche: 5,5 cm x 5,5 cm). Übertragen Sie den Polytetrafluorethylenhalter in ein 400-ml-Becherglas (Materialtabelle) und inkubieren Sie ihn 2 h lang mit 300 ml Piranha-Lösung. Führen Sie diesen Schritt auf Eis und in einer chemischen Haube durch.
      Anmerkungen: Die an der Halterbasis verschraubte Polytetrafluorethylenstange ist 12 cm lang und damit länger als der Becher (11 cm), was ein sicheres Umsetzen/Herausziehen des Halters in/aus der Piranha-Lösung ermöglicht. Da die Piranha-Lösung immer noch sehr reaktiv und sehr heiß sein kann, ist es unbedingt erforderlich, die Reaktion zu stoppen. Der einfachste Weg, die Reaktion zu stoppen, besteht darin, die Piranha-Lösung in (Leitungs-)Wasser zu gießen, um eine 50-fache Verdünnung (mindestens) zu erreichen. Die Lösung kann dann bedenkenlos entsorgt werden. Bewahren Sie die gebrauchte Piranha-Lösung niemals in einer geschlossenen Glasflasche auf – dies könnte zu einer Flaschenexplosion führen.
    3. Füllen Sie den Polytetrafluorethylenhalter in ein sauberes Becherglas, das mit frischem doppelt destilliertem Wasser (DDW) gefüllt ist, um überschüssigen Piranha von den Deckgläsern zu waschen.
    4. Füllen Sie das Becherglas in ein Beschallungsbad (Materialtabelle) und beschallen Sie es 10 Minuten lang bei 80 Hz bei voller Leistung bei 25 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male mit frischem DDW. Verwenden Sie jedes Mal frisches DDW.
  2. Silanisierung
    1. Füllen Sie den Halter in ein sauberes Becherglas (400 ml), das mit 300 ml reinem Methanol gefüllt ist (Materialtabelle) und dann in ein Beschallungsbad (Materialtabelle). Beschallung bei 80 Hz bei voller Leistung für 30 min bei 25 °C.
    2. Nach der Beschallung wird der Halter in eine Silanlösung überführt, die mit 15 ml DDW, 3,1 ml Essigsäure (Materialtabelle), 340 ml Methanol und 7,6 ml Silan ((3-Mercaptopropyl)trimethoxysilan) hergestellt wurde (Materialtabelle). Den Becher mit Parafilm verschließen und über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahren.
      Anmerkungen: Die Herstellung und Handhabung der Silanlösung muss in einer chemischen Haube erfolgen. Geben Sie nach dem Silanisierungsschritt die verbrauchte Silanlösung (Abfall) in eine spezielle Glasflasche in der Chemikalienhaube.
    3. Am nächsten Tag wird der Halter für 15 s in ein sauberes Becherglas gefüllt, das mit 300 ml reinem Methanol gefüllt ist. Setzen Sie dann den Halter in ein sauberes Becherglas ein, nicht bevor Sie den Boden des Polytetrafluorethylenhalters getrocknet haben, um überschüssiges Methanol zu entfernen. Stellen Sie das Becherglas in den Ofen (Materialtabelle), um die Glasdeckgläser 5 min bei 120 °C zu trocknen.
  3. Oberflächenpassivierung mit einem inerten Polymer
    1. Erreichen Sie eine Oberflächenpassivierung, indem Sie die Glasdeckgläser mit einem inerten Polymer inkubieren (Materialtabelle). Nehmen Sie für jedes Experiment zwei Deckgläser und legen Sie sie in eine Petrischale, die mit einer Parafilmschicht beschichtet ist, die zunächst mit Ethanol (EtOH) gereinigt wurde (DDW/EtOH: 30/70 vol/vol) (Materialtabelle).
    2. Inkubieren Sie jedes Deckglas mit 1 ml eines 4 mg·ml−1 5 kDa molekularen Methoxy-Polyethylenglykolmaleimid (mPEG-mal, Mw = 5 kDa) (Materialtabelle) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Materialtabelle) für 1 h bei 22 °C.
      Anmerkungen: Durch das Platzieren der Deckgläser auf einer hydrophoben Parafilmschicht wird die hydrophile PEG-Polymerlösung auf die Oberfläche des Glasdeckglases beschränkt. Die Inkubationszeit ist entscheidend für eine optimale Passivierung. Verwenden Sie die Inkubationszeiten zwischen 45 min und 2 h. Oberhalb dieser Inkubationszeit kann sich die Oberfläche der Glasdeckgläser verschlechtern, was zu Proteinadhäsion und Transparenzverlust führt.
    3. Spülen Sie am Ende des Inkubationsprozesses jedes Deckglas mit 5 ml DDW aus und trocknen Sie es mit einem Fluss vonN2 (Gas). Trocknen Sie die Deckgläser nicht unter Vakuum. Da die Deckgläser nach der Passivierung feucht gehalten werden müssen, geben Sie sofort 1 ml 10 mM Tris auf die pegylierten Oberflächen. Verwenden Sie die Deckgläser innerhalb von 2 Stunden.
      Anmerkungen: Die verschiedenen Schritte müssen in einer Laminar-Flow-Kammer durchgeführt werden, um eine Kontamination der Glasoberfläche zu vermeiden.

2. Protein-Reinigung

  1. Reinigen Sie G-Aktin aus Acetonpulver der Skelettmuskulatur von Kaninchen mit der Gelfiltrationsmethode24.
    1. Die Aktinreinigung dauert 1 Woche. Bewahren Sie das gereinigte G-Aktin in G-Puffer auf (5 mM Tris pH 7,8, 0,01 % NaN3, 0,1 mM CaCl 2,0,2 mM ATP und 1 mM DTT) und lagern Sie es auf Eis. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 2 Wochen.
      Anmerkungen: Ersetzen Sie das Eis alle paar Tage.
    2. Markierung des Aktins mit einem maleimidmodifizierten Fluoreszenzfarbstoff16 (Materialtabelle). Reinigen Sie das GST-Fascin nach der Methode von Ono et al.25. Beide Proteine werden in flüssigem N2 schockgefroren und bei −80 °C gelagert.
  2. Verwenden Sie ein Standardprotokoll zur Aufreinigung von Myosin II aus dem Skelettmuskel26 des Kaninchens. Der gereinigte Myosin-II-Puffer (Dimere) enthält 10 mM Tris pH 7,4, 0,5 M KCl und 35 % w/v Saccharose. Das Myosin wird in FlüssigkeitN2 schockgefroren und bei −80 °C gelagert.
    Anmerkungen: Die hohe Konzentration von KCl hält die Myosinmotoren in einer dimeren Form, während der hohe Anteil an Saccharose sicherstellt, dass die Aktivität der Motoren beim Einfrieren nicht beeinträchtigt wird. Verwenden Sie eine spezielle Pipette für die Handhabung viskoser Flüssigkeiten, wenn Sie mit Myosin II-Stammlösungen arbeiten (Materialtabelle).
    1. Markierung der Myosin-II-Dimere mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Materialtabelle) an Paaren von technisch hergestellten Cysteinresten19,27. Verwenden Sie zu diesem Zweck eine Hühnermagen-RLC-Mutante A26. Das markierte Myosin II wird in FlüssigkeitN2 schockgefroren und bei −80 °C gelagert.
      HINWEIS: Dieses Markierungsverfahren stellt sicher, dass das markierte Myosin als natives Myosin II-Protein aktiv ist.
  3. Verwenden Sie ein UV-Vis-Spektralphotometer (Materialtabelle), um die Absorption der Stammproteinlösungen zu messen, und leiten Sie die Proteinkonzentrationen mit dem Beer-Lambert-Gesetz unter Verwendung der folgenden Extinktionskoeffizienten ab: G-Aktin (ε290 = 26.460 M−1·cm−1), GST-Fascin (ε 280 = 99.330 M−1·cm−1), Myosin-II-Dimer (ε280 = 268.800 M−1·cm−1), und RLC-Mutante A (ε280 = 3.960 M−1·cm−1)19.

3. Probenvorbereitung

HINWEIS: Polymerisieren Sie die Aktinmonomere in Gegenwart großer Aggregate von Myosin-II-Motoren und dem starken passiven Vernetzer Fascin zur Herstellung makroskopisch kontraktiler elastischer Aktomyosin-Netzwerke19,23. Die Zugabe von fluoreszierenden Kügelchen zur Lösung ermöglicht es, den Lösungsmittelfluss während der Gelkontraktion zu verfolgen.

  1. Proteinlösung ("Aktomyosin")
    1. Mit Ausnahme von G-Aktin sollten die Proteine in kleinen Aliquoten bei −80 °C aufbewahrt und vor der Verwendung bei 37 °C aufgetaut werden. Das Gesamtvolumen der Aktomyosinlösung beträgt 40 μl.
    2. Bereiten Sie die Lösung vor, indem Sie 10 mM Tris pH 7,4, 2 mMMgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, ein ATP-Regeneriersystem (0,5 mg·ml−1 Kreatinkinase und 5 mM Kreatinphosphat), 200 μM EGTA (Chelate Ca2+ -Ionen), eine Anti-Bleichlösung (0,1 mg·ml−1 Glukoseoxidase, 0,018 mg·ml−1 Katalase und 5 mg·ml−1 Glukose), 5 μM G-Aktin, 280 nM GST-Faschin und 1,67 nM Myosin II. Der prozentuale Anteil an markiertem G-Aktin beträgt 5% (molare Prozentzahl).
      Anmerkungen: Verwenden Sie einen geringen Prozentsatz an markiertem G-Aktin, um die Sättigung des Fluoreszenzsignals in den fortgeschrittenen Stadien der Gelkontraktion zu vermeiden.
  2. Herstellung von Myosin-II-Motoraggregaten
    1. Fügen Sie der Proteinlösung die Myosinmotoren in Form von Aggregaten hinzu. Um große Myosin-Aggregate (150 Myosin-Dimere/Aggregat) zu bilden, wird die Myosin-Stammlösung mit 10 mM Tris pH 7,4 verdünnt, um eine Endkonzentration von 25 mM KCl zu erreichen.
    2. Bewahren Sie die verdünnte Myosinlösung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) auf und geben Sie sie dann bis zur Verwendung auf Eis. Die Motoren sind bis zu 2 h voll aktiv.
  3. Messung des Lösemittelflusses
    1. Um den Lösungsmittelfluss durch die Gelporen zu verfolgen, fügen Sie die fluoreszierenden Kügelchen der Aktomyosinlösung hinzu. Reduzieren Sie die Wechselwirkung zwischen den Beads und dem Aktomyosin-Netzwerk, indem Sie die Beads passivieren. In der Praxis inkubieren Sie 1 μl Kügelchen (Materialtabelle) mit 5 μM G-Aktin für 20 min bei RT und entfernen dann überschüssiges G-Aktin durch Zentrifugation (Materialtabelle) (Bedingungen: 6.000 x g für 5 min bei 4 °C).
    2. Wiederholen Sie diesen Schritt mit 10 mg·ml−1 Rinderserumalbumin (BSA) (Materialtabelle), um (möglicherweise) die verbleibende unbeschichtete Oberfläche zu blockieren. Verwenden Sie die Kügelchen in einer Endverdünnung von 1:10.000 vol/vol in den Experimenten.
      Anmerkungen: Es ist wichtig, den Durchmesser der Perlen so an die Gelporengröße anzupassen, dass das Verhältnis von Perle zu Porengröße in allen Phasen <1 beträgt.
  4. Einfluss der Viskosität der Lösung
    1. Kontrollieren Sie die Viskosität der Lösung, indem Sie der Aktomyosinlösung Glycerin (Materialtabelle) hinzufügen. Die Zugabe von Glycerin in einem Gewichtsprozentbereich von 0 % bis 34 % induziert eine entsprechende Erhöhung der Lösungsviskosität von η ω auf 2,76 η ω, wobei η ω die Viskosität von Wasser bei 20 °C28 ist.
      HINWEIS: Bei der Arbeit mit Glycerin ist es wichtig, eine spezielle Pipette für die Handhabung viskoser Flüssigkeiten zu verwenden (Materialtabelle).

4. Durchführen eines Experiments

  1. Hausgemachtes Probenhalter-Handling
    1. Nehmen Sie eines der PEG-passivierten Deckgläser, legen Sie einen gefetteten Parafilm-Abstandshalter darauf und legen Sie es in den Probenhalter.
      Anmerkungen: Man kann den Parafilm-Abstandshalter durch einen beliebigen Abstandshalter ersetzen.
  2. Herstellung der Aktomyosinlösung
    1. Bereiten Sie die Aktomyosinlösung auf Eis in einem Mikrozentrifugenröhrchen zu, indem Sie die verschiedenen mikroskopischen Bestandteile einbauen, die Myosin-II-Motoraggregate hinzufügen und zuletzt EGTA hinzufügen. Mischen Sie die Lösung gut. Die Zugabe von EGTA initiiert die Polymerisation des Aktomyosin-Netzwerks, die den Startzeitpunkt des Experiments festlegt.
  3. Geben Sie 1,1 μl dieser Lösung auf das am Halter befestigte Deckglas und legen Sie das zweite Deckglas darauf. Schrauben Sie den Halter fest, um die Probe zu versiegeln. Bei diesem Vorgang wird der Tropfen leicht zusammengedrückt, der eine scheibenartige Form annimmt. Die Tropfendurchmesser liegen zwischen 2.800 und 3.000 μm.
  4. Setzen Sie den Probenhalter auf das Mikroskop und starten Sie die Aufnahme. Bereiten Sie das Mikroskop im Voraus vor, um die anfängliche Erfassungszeit zu verkürzen. Es dauert in der Regel 1-2 Minuten nach dem Mischen, um mit der Probenbildgebung zu beginnen.

5. Mikroskopie-Techniken

  1. Bilden Sie die Proben mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (Materialtabelle) ab, das von einer speziellen Software (Materialtabelle) gesteuert wird.
    1. Verwenden Sie niedrige Vergrößerungen von 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR Objektiv (Materialtabelle), um den gesamten Gelbereich zu visualisieren und seine makroskopische Kontraktion mit der Zeit zu verfolgen.
    2. Verwenden Sie ein 10x/0,3 Ph1 UPlanFL-Objektiv (Table of Materials), um die Porosität und Struktur des Netzwerks zu charakterisieren und die Selbstorganisation und Kontraktion des Netzwerks mit der Zeit zu verfolgen.
      HINWEIS: Dieses Objektiv ist auch nützlich, um die Myosin-II-Motoraggregate innerhalb des Netzwerks zu lokalisieren und die Bewegung fluoreszierender Kügelchen durch die Gelporen zu verfolgen. Höhere Vergrößerungen können auf Kosten eines reduzierten Sichtfelds verwendet werden, was im zweifarbigen Bildmodus noch wichtiger ist (Materialtabelle).
  2. Die Proben werden bei 488 nm (Aktin/Fluoreszenz-Beads) und 561 nm (Myosin-Motoraggregate/Fluoreszenz-Beads) angeregt. Erfassen Sie die Bilder mit einer Geschwindigkeit von 100 ms pro Bild mit einer speziellen Software (Table of Materials) im Streaming-Modus mit einer EMCCD-Kamera (Electron Multiplying Charge-Coupled Device) (Table of Materials).
    HINWEIS: Die Intensität der Leuchtstofflampe (Materialtabelle) sollte auf dem niedrigstmöglichen Wert gehalten werden, um eine Signalsättigung während der Netzwerkkontraktion zu vermeiden.
  3. Simultane zweifarbige Bildgebung
    1. Verwenden Sie diesen Modus für zwei Zwecke: (i) Detektion der Lokalisation der Myosinmotoraggregate innerhalb des Aktinnetzwerks und (i) Charakterisierung des nach außen gerichteten Lösungsmittelflusses innerhalb und außerhalb während der Netzwerkkontraktion.
    2. Die Aktin- und Myosin-II-Motoren werden bei 488 nm bzw. 561 nm angeregt und die Bilder gleichzeitig auf einer EMCCD-Kamera (Materialtabelle) mit einer Dual-Emission-Apparatur (Materialtabelle) aufgenommen. Verwenden Sie dasselbe Bildgebungssystem, um gleichzeitig das Aktingel (488 nm) und die fluoreszierenden Kügelchen (561 nm) abzubilden.

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Ergebnisse

Pro Versuch werden zwei Glasdeckgläser verwendet. Die Glasdeckgläser werden mit PEG-Polymeren gereinigt und passiviert. Die Passivierung ist unerlässlich, um zu verhindern, dass die gelösten Proteine bereits in frühen Versuchsstadien an den Glasoberflächen haften und um die Wechselwirkung des kontrahierenden Netzwerks mit den Glaswänden zu minimieren. Gelingt es nicht, eine gute Passivierung zu erreichen, kann dies zu einer ineffizienten Kontraktion führen und im Extremfall sogar die Bildung von Aktinnetzwerken hemmen.

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Diskussion

Hier wird ein in vitro Ansatz verwendet, um die Mechanik von poroelastischen Aktomyosingelen als Modellsystem des Zellzytoskeletts und allgemeiner des Zellzytoplasmas zu charakterisieren, das sich nachweislich als poroelastisches Material verhält 3,5. Die Rheologie des Zellzytoskeletts (Zytoplasma) wurde durch eine poroelastische Diffusionskonstante charakterisiert, die bestimmt, wie lange es dauert, bis sich die intrazelluläre zytosolische Flüssigkeit n...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir bedanken uns bei Dina Aranovich für die Proteinreinigung und -kennzeichnung. G.L. dankt dem israelischen Ministerium für Wissenschaft, Technologie und Raumfahrt für das Jabotinsky-Promotionsstipendium. A.B.G. dankt der Israel Science Foundation (Grant 2101/20) und dem Ministry of Science and Technology - State of Israel (Grant 3-17491) für die finanzielle Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilanSigma-Aldrich Company175617Lagerung unter Argonatmosphäre bei 4 μde; C 
EssigsäureBio-Lab Ltd1070521
Alexa-Fluor 488InvitrogeneA10254Verdünnt mit DMSO, gelagert unter Argonatmosphäre bei -20 & Grad; C 
Alexa-Fluor 647InvitrogenA20347Verdünnt mit DMSO, gelagert unter Argonatmosphäre bei -20 &Grad; C 
BSASigma -Aldrich CompanyA3059Gelagert bei 4 Grad; C 
CatalaseSigma -Aldrich CompanyC9322Die Lagerflasche wird unter trockener Atmosphäre (Kieselgel) bei -20 &° aufbewahrt; C
DeckgläserMezel-GlaserCG2222-1.5Nach der Piranha-Behandlung in milliQ-Wasser aufbewahrt und innerhalb von 3 Wochen verwendet
KreatinkinaseRoche Life Science Products10736988001Frisch in Glycinpuffer zubereitet, auf Eis gelagert und innerhalb von 3 Tagen verbraucht. Die Vorratsflasche wird unter trockener Atmosphäre (Kieselgel) bei 4° aufbewahrt; C
KreatinphosphatRoche Life Science Produkte10621714001Wenn es aufgelöst ist, sollte es bei -20 & Grad aufbewahrt werden; C und innerhalb von 3 Monaten verbraucht. Die Vorratsflasche wird unter Argonatmosphäre aufbewahrt und bei 4 Grad gelagert; C
DTTLife Science Products10708984001Wenn es aufgelöst ist, sollte es bei -20 ° C aufbewahrt werden; C und innerhalb von 3 Monaten verwendet
Dual-View-System für simultane BildgebungPhotometricsDV2-CUBE
EGTAMP Biomedicals195174
EM-CCD KameraAndor Technology LtdDV 887
EM-CCD KameraPhotometricsEvolve Delta
EthanolBio-Lab ltd525050300
FluoreszenzlampeRapp Optoelektronische
Fluoresbrite YG MicrospheresPolysciences17151-10200 nm
Durchmesser GlukoseICN Biomedicals Inc194024Wenn aufgelöst, sollte es bei -20 & Grad aufbewahrt werden; C und innerhalb von 3 Monaten verbraucht.
GlukoseoxidaseSigma-Aldrich CompanyG7141Gehalten in -20 &°; C und innerhalb von 3 Monaten verbraucht. Das Brühpulver wird unter Argonatmosphäre aufbewahrt und bei -20 μg aufbewahrt; C
GlycerolICN Biomedicals Inc800687
GlycineMP Biomedicals808822
WasserstoffperoxidSigma-Aldrich Company216763gelagert bei 4 & Grad; C 
KClEMD Millipore Corp.
MethanolBio-Lab Ltd1368052100
MgCl2EMD Millipore Corp.
MikroskopLeica MicrosystemsDMI3000
mPEG-malNanocsPG1-ML-5k Mw = 5000 Da. Aufgeteilt in kleine Chargen nach Gewicht. Gelagert unter Argonatmosphäre bei -20 °; C
Nilrote MikrosphärenSpherotechFP-2056-2 2300 nm Durchmesser
Objektiv (10x)Leica GermanyHC PL AP0UPlanFL Numerische Apertur = 0,3
Objektiv (2,5x)Leica Germany506304  Plan-NEOFLUAR Numerische Apertur = 0,075
OfenWTC Binder
ParafilmAmcorPM-996
PBS PufferSigma-Aldrich CompanyP4417
Shutter DriverVincet AssociatesVMM D1
Silica gelMerck1.01907.5000
SonicatorElmaElmasonic P
SchwefelsäureCarlo Erba Reagenzien410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging SystemPhotometrie
TRISMP Biomedicals819620
UV-VIS SpektralphotometerPharmaciaUltraspec 2100 pro
MICROMAN EGilsonFD100011– 10 μl
MATLAB R2017bMathWorksDatenquantifizierung 
MetaMorph Molekulare BauelementeSteuerungssoftware des optischen Bildgebungssystems; Datenquantifizierung (Partikelverfolgungsanalyse, Netzwerkmaschenweite)
Roche 529552442615

Referenzen

  1. Alberts, B., et al. Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
  2. Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2001).
  3. Mogilner, A., Manhart, A. Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel. Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).
  4. Bausch, A. R., Kroy, K. A bottom-up approach to cell mechanics. Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).
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  6. Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. Animal cell hydraulics. Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).
  7. Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).
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