Eine auf Durchflusszytometrie basierende Hochdurchsatztechnik für das Screening von Integrin-hemmenden Medikamenten

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine auf Durchflusszytometrie basierende Hochdurchsatz-Screening-Methode zur Identifizierung niedermolekularer Medikamente, die die β2-Integrin-Aktivierung auf menschlichen Neutrophilen hemmen.

Abstract

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine Methode zur Identifizierung kleiner molekularer Antagonisten der β2-Integrinaktivierung unter Verwendung von Antikörpern zu etablieren, die über Konformationsänderungen berichtende Antikörper und Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie verwenden. Die Methode kann auch als Leitfaden für andere antikörperbasierte Hochdurchsatz-Screening-Methoden dienen. β2-Integrine sind Leukozyten-spezifische Adhäsionsmoleküle, die für die Immunantwort entscheidend sind. Neutrophile Granulozyten sind auf die Integrinaktivierung angewiesen, um den Blutkreislauf zu verlassen, nicht nur, um Infektionen zu bekämpfen, sondern auch, um an mehreren entzündlichen Erkrankungen beteiligt zu sein. Die Kontrolle der β2-Integrin-Aktivierung stellt einen praktikablen Ansatz zur Behandlung von Neutrophilen-assoziierten Entzündungserkrankungen dar. In diesem Protokoll wird ein monoklonaler Antikörper, mAb24, der spezifisch an das hochaffine Kopfstück von β2-Integrinen bindet, verwendet, um die Aktivierung von β2-Integrinen auf isolierten primären humanen Neutrophilen zu quantifizieren. N-Formylmethionyl-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) wird als Stimulus zur Aktivierung neutrophiler β2-Integrine verwendet. In dieser Studie wurde ein Hochdurchsatz-Durchflusszytometer verwendet, das in der Lage ist, 384-Well-Plattenproben automatisch durchzuführen. Die Auswirkungen von 320 Chemikalien auf die β2-Integrin-Hemmung werden innerhalb von 3 h untersucht. Auf diese Weise können Moleküle identifiziert werden, die direkt auf β2-Integrine abzielen oder auf Moleküle im G-Protein-gekoppelten Rezeptor-initiierten Integrin-Inside-Out-Aktivierungssignalweg abzielen.

Introduction

Viele entzündliche Erkrankungen sind durch die Infiltration von Neutrophilen an der Schwellungs- oder Verletzungsstelle gekennzeichnet¹. Um in diese Gewebe einzudringen, müssen die Neutrophilen die Rekrutierungskaskade der Neutrophilen durchlaufen, die einen Arrest im Endothel, eine Extravasation über die Gefäßwand und eine Rekrutierung in das Gewebe beinhaltet². Zirkulierende Neutrophile benötigen eine β2-Integrin-Aktivierung, um diese Kaskade zu vervollständigen, insbesondere für die Arrestphase. Daher können Integrin-hemmende Medikamente, die die Adhäsion, Extravasation und Rekrutierung von Neutrophilen reduzieren, entzündliche Erkrankungen wirksam behandeln ^3,4.

β2-Integrine wurden schon früher für entzündliche Erkrankungen ins Visier genommen. Efalizumab, ein monoklonaler Antikörper, der direkt gegen Integrin αLβ2 gerichtet ist, wurde zur Behandlung von Psoriasis⁵ entwickelt. Efalizumab wurde jedoch aufgrund seiner tödlichen Nebenwirkung - progressiver multifokaler Leukenzephalopathie infolge einer Reaktivierung des JC-Virus - zurückgezogen ^6,7. Neue entzündungshemmende Integrin-basierte Therapien sollten die Aufrechterhaltung der antiinfektiösen Funktionen von Leukozyten berücksichtigen, um Nebenwirkungen zu minimieren. Die Nebenwirkungen von Efalizumab könnten auf die verlängerte Zirkulation monoklonaler Antikörper im Blutkreislauf zurückzuführen sein, die langfristig die Immunfunktionen hemmen könnten⁸. Eine aktuelle Studie zeigt, dass Efalizumab die αLβ2-Vernetzung und die unerwünschte Internalisierung von α4-Integrinen vermittelt, was eine alternative Erklärung für die Nebenwirkungen liefert⁹. Daher könnten kurzlebige, niedermolekulare Antagonisten dieses Problem vermeiden.

Eine Hochdurchsatzmethode zum Screening von niedermolekularen β2-Integrin-Antagonisten unter Verwendung humaner Neutrophiler wird hier vorgestellt. Die β2-Integrinaktivierung erfordert Konformationsänderungen der Integrin-Ektodomäne, um Zugang zu ihrem Liganden zu erhalten und ihre Bindungsaffinität zu diesem zu erhöhen. Im kanonischen Switchblade-Modell dehnt sich die gebogene geschlossene Integrin-Ektodomäne zunächst zu einer extended-closed Konformation aus und öffnet dann ihr Kopfstück zu einer vollständig aktivierten extended-open Konformation^10,11,12,13. Es gibt auch einen alternativen Weg, der vom gebogen-geschlossenen zum gebogen-offenen und ausgestreckt-offenen Weg führt, schließlich 14,15,16,17,18,19. Der konformationsspezifische Antikörper mAb24 bindet an ein Epitop in der humanen β2-I-ähnlichen Domäne, wenn das Kopfstück der Ektodomäne geöffnet ist^20,21,22,23.

Hier wird mit mAb24-APC bestimmt, ob die β2-Integrine aktiviert sind. Zur Aktivierung von Neutrophilen und Integrinen wird in diesem Protokoll N-Formylmethionyl-Leucylphenylalanin (fMLP), ein aus Bakterien gewonnenes kurzes chemotaktisches Peptid, das neutrophile β2-Integrine²⁴ aktivieren kann, als Stimulus verwendet. Wenn fMLP an das Fpr1 auf Neutrophilen bindet, werden nachgeschaltete Signalkaskaden aktiviert, an denen G-Proteine, Phospholipase Cβ und Phosphoinositid-3-Kinase-γ beteiligt sind. Diese Signalereignisse führen letztendlich zu einer Integrinaktivierung über den Inside-Out-Signalweg^18,25. Neben niedermolekularen Antagonisten, die direkt an β2-Integrine binden und Konformationsänderungen der Integrinaktivierung^{verhindern 26}, würden mit dieser Methode auch Verbindungen nachgewiesen, die Komponenten des β2-Integrin-Inside-Out-Aktivierungssignalwegs hemmen können. Automatisierte Durchflusszytometer ermöglichen ein Hochdurchsatz-Screening. Die Identifizierung neuer Antagonisten kann nicht nur unser Verständnis der Integrin-Physiologie vertiefen, sondern auch translationale Einblicke in die Integrin-basierte Anti-Entzündungstherapie liefern.

Protocol

Heparinisierte Vollblutproben wurden von anonymisierten gesunden menschlichen Spendern nach Einholung der Einverständniserklärung gemäß den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki gewonnen, wie vom Institutional Review Board der UConn Health genehmigt. Von allen Spendern wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Die Ein-/Ausschlusskriterien für diese Studie wurden sorgfältig entwickelt, um die Eignung der Teilnehmer sicherzustellen und potenzielle Risiken zu minimieren. Die teilnahmeberechtigten Teilnehmer waren zwischen 18 und 65 Jahre alt, hatten eine beliebige ethnische Zugehörigkeit, sprachen fließend Englisch und waren in der Lage, eine informierte Einwilligung zu geben. Zu den ausgeschlossenen Teilnehmern gehörten diejenigen, die nicht in der Lage waren, eine Einwilligung nach Aufklärung für sich selbst zu geben, wie z. B. diejenigen, die einen gesetzlichen Vertreter benötigen, Personen unter 18 oder über 65 Jahren, inhaftierte Personen und schwangere Frauen. Darüber hinaus mussten die Teilnehmer frei von entzündungshemmenden Medikamenten und entzündlichen Zuständen sein. Aktuelle Infektionen oder anhaltende chronische oder akute Entzündungszustände waren ebenfalls Ausschlusskriterien. Schließlich waren Personen mit einer aktuellen oder kürzlichen COVID-19-Infektion in der Vorgeschichte nicht für die Studie geeignet. Diese Kriterien wurden entwickelt, um die Sicherheit und Eignung der Teilnehmer zu gewährleisten und gleichzeitig potenzielle Störfaktoren zu minimieren, die sich auf die Studienergebnisse auswirken könnten.

1. Herstellung der Reagenzien

1. Neutrophiles Medium: Bereiten Sie das neutrophile Medium vor, indem Sie RPMI-1640 2 % humanes Serumalbumin ohne Phenolrot hinzufügen (siehe Materialtabelle).
2. fMLP-Lösung: Bereiten Sie die fMLP-Lösung vor, indem Sie sie 100-fach aus der 10-mM fMLP-Speicherlösung für Dimethylsulfoxid (DMSO) (siehe Materialtabelle) mit RPMI 1640 ohne Phenolrot verdünnen, was zu einer 100 μM fMLP-Lösung führt.
3. Antikörperlösung: Verdünnen Sie 120 μl des mit Allophycocyanin (APC) konjugierten monoklonalen Antikörpers mAb24 (mAb24-APC) (siehe Materialtabelle), der die hochaffine Konformation von β2-Integrin angibt, in 10 ml neutrophilem Medium, wodurch eine 1,2 μg/ml mAb24-APC-Lösung entsteht.
4. Compound-Bibliothek: Verdünnen Sie die anfängliche Compound-Bibliothek mit einer Konzentration von 10 mM bis 1 mM, indem Sie 5 μl der 10-mM-Bibliothek (siehe Materialtabelle) zu 45 μl DMSO in 384-Well-Platten mit dem Liquid Handler hinzufügen. Anschließend werden 5 μl pro Well der 1-mM-Compound-Bibliothek mit dem Liquid Handler auf eine leere 384-Well-Platte übertragen.
5. Wie in Abbildung 1 dargestellt, enthielten vier Spalten ( 1, 2, 23, 24) nur DMSO, aber keine Verbindungen, die als Positiv- und Negativkontrollen im Screening dienten. Jede Vertiefung wird weiter verdünnt, indem 45 μl RPMI-1640 ohne Phenolrot hinzugefügt werden, was zu einer Endkonzentration von 100 μM für alle Verbindungen führt.

2. Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut

1. Mit einer serologischen Pipette vorsichtig 4 ml Blut über 8 ml eines handelsüblichen Dichtegradientenmediums (siehe Materialtabelle) in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen schichten (Abbildung 2A).
2. Das Blut wird bei 550 × g für 30-50 min bei 20 °C zentrifugiert. Bremsen Sie den Rotor schrittweise ab (Verzögerungsfaktor 1).
   HINWEIS: Die erfolgreiche Trennung von Neutrophilen (Band 2 in Abbildung 2B) von roten Blutkörperchen kann je nach Spender variieren. Für die meisten Spender ist eine 30-minütige Zentrifugation ausreichend. Bei einigen Spendern kann jedoch eine zusätzliche Zentrifugation von 10 bis 30 Minuten erforderlich sein, wenn die Trennung nicht erfolgreich ist (Abbildung 2C).
3. Entfernen Sie vorsichtig das Plasma (die gelbe Flüssigkeit auf der Oberseite) und die mononukleären Zellen (das obere trübe Band; PBMC-Bande in Abbildung 2B) mit einer 1-ml-Pipette.
4. Neutrophile Granulozyten werden aus dem unteren trüben Band (Neutrophilenband in Abbildung 2B) und etwa 3-4 ml unterhalb der klaren Flüssigkeit in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gesammelt. Mischen Sie die Neutrophilensuspension vorsichtig, indem Sie sie 2-3 Mal invertieren.
5. Die Suspension wird bei 400 × g für 10 min bei 20 °C zentrifugiert und anschließend der Überstand vorsichtig durch Dekantieren entfernt.
6. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 5 ml PBS und zentrifugieren Sie es bei 300 × g für 5 Minuten bei 20 °C.
7. Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren und entfernen Sie vorsichtig alle Restüberstände um die Röhrchenmündung und an der Röhrchenwand durch Vakuumabsaugung. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml neutrophilem Medium.
8. Zählen Sie die Zellzahlen mit einem Hämozytometer. Typischerweise wurden 1 bis 4 × 10⁷ Neutrophile aus 8 ml menschlichem Blut gewonnen.
   HINWEIS: Es kann zu einer Kontamination der roten Blutkörperchen in der Neutrophilensuspension kommen. Rote Blutkörperchen haben keinen signifikanten Einfluss auf die meisten Assays und können die Aktivierung/das Priming von Neutrophilen verhindern²⁷. Rote Blutkörperchen müssen vor der Zählung lysiert werden, um eine genaue Neutrophilenkonzentration zu erhalten. Geben Sie 10 μl der Zellsuspension für 10-30 s zu 891 μl deionisiertem Wasser, um die roten Blutkörperchen zu lysieren, und fügen Sie dann 99 μl 10× PBS hinzu, um den osmotischen Druck auszugleichen und die Lyse der Neutrophilen zu verhindern.
9. Stellen Sie die Zelldichte auf 6,25 × 10⁵ Zellen/ml ein, indem Sie neutrophiles Medium hinzufügen.

3. Vorbereitung der 384-Well-Platte

1. In einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen wird 1 ml der Antikörperlösung (1,2 μg/ml mAb24-APC) mit 0,2 ml neutrophilem Medium vermischt, um eine 1 μg/ml mAb24-APC-Lösung herzustellen. Geben Sie dann 25 μl dieser Mischung in die Negativkontrollvertiefungen in einer 384-Well-Platte (die blauen Wells in Abbildung 1).
2. In einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen werden 9 ml der Antikörperlösung mit 21,6 μl der fMLP-Lösung (100 μM) und 1,7784 ml neutrophilem Medium gemischt, um eine Lösung zu erhalten, die 1 μg/ml mAb24-APC und 200 nM fMLP enthält. Als Nächstes werden 25 μl dieser Mischung in die Positivkontroll- und Testvertiefungen in einer 384-Well-Platte gegeben (die roten und blauen Wells in Abbildung 1).
3. Übertragen Sie 5 μl der 100-μM-Verbindungslösungen mit einer Mehrkanalpipette von der Verbindungsbibliotheksplatte auf die 384-Well-Platte.
4. Zentrifugieren Sie die Flüssigkeit 1 Minute lang bei 500 × g bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Zum Zentrifugieren von Platten sind ein Ausschwingrotor und Plattenbecher erforderlich.

4. Behandlung von Zellen

1. Geben Sie 20 μl der neutrophilen Suspension mit einer 16-Kanal-Pipette (5-50 μl-Bereich für jede Säule der 384-Well-Platte) in jede Vertiefung. Mischen Sie vorsichtig 5-10 Mal mit der Pipette und halten Sie dabei ein gleichbleibendes Zeitintervall zwischen den einzelnen Pipettiervorgängen ein.
   ANMERKUNG: Die endgültigen Konzentrationen in den Wells sind wie folgt: Neutrophile 2,5 × 10⁵ Zellen/ml (alle Wells); mAb24-APC 0,5 μg/ml (alle Vertiefungen); fMLP 100 nM (Positivkontroll- und Testbohrungen); Verbindungen 10 μM (Testbrunnen).
2. Die Platte auf einem Schüttler bei 300 U/min bei Raumtemperatur (RT) 10 Minuten lang inkubieren.
3. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie mit einer 16-Kanal-Pipette 3 μl 16 % Paraformaldehyd (PFA) in jede Vertiefung geben (endgültige PFA-Konzentration ~0,91 %). Dann 10 Minuten auf Eis inkubieren.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, beim Hinzufügen von Neutrophilen und PFA ein konsistentes Zeitintervall zwischen den verschiedenen Spalten einzuhalten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Neutrophilen in jedem Well die gleiche Inkubationszeit mit fMLP und mAb24-APC haben.

5. Durchflusszytometrie

1. Schalten Sie das Durchflusszytometer ein (siehe Materialtabelle) und stellen Sie sicher, dass der an das Gerät angeschlossene Computer ebenfalls eingeschaltet ist.
2. Stellen Sie sicher, dass der Behälter für die Mantelflüssigkeit gefüllt ist und der Abfallbehälter leer und ordnungsgemäß an das Gerät angeschlossen ist.
3. Laden Sie die 384-Well-Platte auf den Probenlader des Durchflusszytometers. Stellen Sie sicher, dass die A1-Vertiefung der Platte mit der A1-Markierung auf dem Lader übereinstimmt.
4. Öffnen Sie die Software und erstellen Sie ein neues Experiment. Wählen Sie 384 Well und wählen Sie die gewünschten Fluorophore. Klicken Sie anschließend auf Plate setup, ziehen Sie, um alle Wells auszuwählen, und klicken Sie dann auf Sample. Aktivieren Sie den Schalter "Hoher Durchsatz" und wählen Sie im Bereich "Rate" die Option "Hoch" aus.
   1. Geben Sie im Feld Volume den Wert 50 ein. Wählen Sie Proben in ungeraden Spalten aus und aktivieren Sie dann den Schalter "Rühren". Benennen Sie abschließend die Beispiele im rechten Bereich.
5. Klicken Sie auf Plot and gate. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Anwenden" (zwei Pfeile auf einem grün gefüllten Kreis) und anschließend auf die Schaltfläche "Wiedergabe" (Dreiecksform). Warten Sie einige Sekunden, um einige Zellen aus der ersten Vertiefung zu beobachten, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Pause.
   1. Passen Sie die FSC- und SSC-Spannungen an, um eine korrekte Visualisierung der Zellen im Diagramm zu gewährleisten. Klicken Sie auf Akquisition und dann auf die Wiedergabeschaltfläche (Dreiecksform), um den Assay zu starten.
6. Das Durchflusszytometer entnimmt sequentiell ~50 μl von 1000-3000 Neutrophilen aus jeder Vertiefung. Es wird etwa 3 Stunden dauern, bis die gesamte 384-Well-Platte fertiggestellt ist.
7. Nachdem Sie alle Beispiele abgeschlossen haben, exportieren Sie die FCS-Dateien für den nächsten Schritt.

6. Datenanalyse

1. Öffnen Sie die Datenanalyse-Software für die Durchflusszytometrie (siehe Materialtabelle). Wählen Sie den Ordner mit allen .fcs-Dateien aus, ziehen Sie ihn in das Softwarefenster und lassen Sie ihn los, um die Daten in die Software zu importieren.
2. Doppelklicken Sie auf eine Probe, um einzelne Neutrophile basierend auf FSC und SSC^28,29,30 im Pop-up-Fenster zu gruppieren^, wie in Abbildung 3 gezeigt. Wählen Sie die abgegrenzten Zeilen aus, ziehen Sie sie in den Ordner und lassen Sie sie dann los, um das Gating auf alle Beispiele in diesem Ordner anzuwenden.
3. Berechnen und exportieren Sie die mittlere APC-Fluoreszenzintensität (MFI) von Neutrophilen aus jedem Well mit der Tabelleneditor-Funktion der Software. Klicken Sie auf Spalte hinzufügen auf der Registerkarte Bearbeiten. Wählen Sie auf der Registerkarte Statistik die Option Median aus, wählen Sie die Neutrophilen der eingeschränkten Population aus, und wählen Sie APC als Parameter aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK.
4. Kehren Sie zur Registerkarte "Tabelleneditor" zurück, wählen Sie auf der Registerkarte "Gruppe" die Option Alle Beispiele aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Tabelle erstellen . Es erscheint ein neues Fenster, in dem die erstellte Tabelle angezeigt wird. Speichern Sie es als Text-, CSV- oder Excel-Datei.
5. Öffnen Sie die exportierte Tabelle, berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung des APC-MFI für die positiven und negativen Kontrollproben (Abbildung 4).
6. Berechnen Sie den Z'-Faktor (Z') der Platte mit der Gleichung:
   Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μ_p - μ_n),
   wobei σ p und σ n die Standardabweichungen der Positiv- bzw. Negativkontrollen sind und μ_p und μ_n die Mittelwerte der Positiv- bzw. Negativkontrollen sind³¹.
   ANMERKUNG: Der Faktor Z' gibt die Trennung der positiven und negativen Kontrollverteilung an. Ein Z' von 0 bedeutet keine Trennung, während ein Z' von 0,5 eine gleichmäßige Trennung angibt. Wie bereits in einer früheren Studie^{erwähnt 31}, weist Z' > 0,5 auf einen ausgezeichneten Assay für das Screening von Verbindungen hin. Ein Z' im Bereich von 0,5 bis 0 ist akzeptabel, aber es kann nur starke Treffer im Assay identifizieren, was eine weitere Validierung in sekundären Assays erfordert.
7. Betrachten Sie Verbindungen als "Treffer" für das Screening, wenn der APC-MFI von mit Substanzen behandelten Neutrophilen niedriger ist als das Dreifache der Standardabweichung des MFI der Positivkontrolle, subtrahiert vom MFI der Positivkontrolle (P = 0,0013, dargestellt durch die gestrichelte Linie in Abbildung 4).

Results

Die Daten eines repräsentativen 384-Well-Plattenscreenings (Abbildung 4) zeigten, dass die Negativkontrollen einen MFI von mAb24-APC von 3236 ± 110 aufwiesen, während die Positivkontrollen einen MFI von mAb24-APC von 7588 ± 858 aufwiesen. Der Z'-Faktor für diese Platte beträgt ungefähr 0,33, was innerhalb eines akzeptablen Bereichs³¹ liegt. Z' erfordert jedoch eine weitere Validierung in sekundären Assays.

Um die Daten zu normalisieren, wurden alle Werte skaliert, um dem positiven Mittelwert einen Maximalwert von 1 und dem negativen Mittelwert einen Minimalwert von 0 zuzuweisen. Der Z'-Faktor wird in sekundären Assays einer strengeren Validierung unterzogen. Der Grenzwert für diese Platte liegt bei 0,41, was bedeutet, dass Proben mit einem relativen MFI von weniger als 0,41 als Treffer betrachtet werden, die die fMLP-induzierte β2-Integrinaktivierung in humanen Neutrophilen hemmen. Von dieser Platte konnten keine Treffer festgestellt werden.

Um die Wirksamkeit des Protokolls zu bestätigen, wurden Nexinhib20, das die β2-Integrinaktivierung hemmt, indem es die Rac-1-Funktion antagonisiert, und Lifitegrast, das Integrin αLβ2 direkt antagonisiert^32,33, verwendet. Die Inkubationszeiten wurden jedoch auf eine Stunde für Nexinhib20 und eine halbe Stunde für Lifitegrast angepasst. Die resultierenden Daten aus diesen Experimenten wurden mit der oben beschriebenen Skalierungsmethode normalisiert. Diese Datenpunkte wurden dann mit den Plattenergebnissen kombiniert und gemeinsam analysiert (Abbildung 4).

Abbildung 1: Plattenlayout für das Compound-Screening. Ein schematisches Diagramm, das die Anordnung von Screening-Verbindungen und -Kontrollen in einer 384-Well-Platte veranschaulicht. Die Negativkontrollwellen sind blau dargestellt (Spalten 1 und 23) und die Positivkontrollwellen sind rot dargestellt (Spalten 2 und 24). Die Prüfbohrungen sind in Beige dargestellt (Spalten 3 bis 22). Pfeile zeigen die Reihenfolge zum Lesen der Platte an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Neutrophilentrennung mittels Dichtegradientenmedium. Repräsentative Fotos, die die erfolgreiche und misslungene Trennung von Neutrophilen mit Hilfe von Dichtegradientenmedium zeigen. (A) Zunächst werden 4 ml Blut auf 8 ml Dichtegradientenmedium geschichtet. (B) Nach der Zentrifugation sollten zwei trübe Banden sichtbar sein: das obere Band, das hauptsächlich mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) enthält, und das untere Band, das hauptsächlich neutrophile Granulozyten mit einigen roten Blutkörperchen (RBCs) enthält. Die meisten Erythrozyten sind unten pelletiert. (C) Eine erfolglose Trennung, bei der die Erythrozyten nicht pelletiert sind und die Neutrophilenbande nicht beobachtet wird. Eine zusätzliche Zentrifugation (10-30 min) wäre erforderlich, um die Neutrophilenbande zu trennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Gating von Neutrophilen mit Hilfe von FSC/SSC-Plots. Repräsentative Forward-Scatter- (FSC) und Side-Scatter-Diagramme (SSC), die die Gating-Strategie zur Identifizierung von Neutrophilen veranschaulichen. (A) Neutrophile Granulozyten werden auf der Grundlage der vom Durchflusszytometer aufgezeichneten Fläche der Vorwärtsstreuung (FSC-A) und der Seitenstreuung (SSC-A) gesteuert. (B) Einzelne Zellen werden basierend auf der Breite (FSC-W) und Höhe (FSC-H) der Vorwärtsstreuung und (C) der Breite (SSC-W) und Höhe (SSC-H) der Seitenstreuung weiter gesteuert. Die Farbskala stellt die Zelldichte dar und geht mit abnehmender Dichte von Rot zu Gelb, Grün und Blau über. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Die Screening-Ergebnisse ergeben eine repräsentative 384-Well-Platte. Das Screening resultiert aus einer repräsentativen 384-Well-Platte, die einen Z'-Faktor von 0,3 aufweist. Negativ- und Positivkontrollen sind durch blaue bzw. rote Punkte gekennzeichnet. Prüfproben, die mit verschiedenen Verbindungen behandelt wurden, werden als beige Punkte dargestellt. Die gestrichelte Linie stellt den mittleren Grenzwert für die Fluoreszenzintensität (MFI) zur Identifizierung von Treffern dar. Keine der getesteten Verbindungen wurde als β2-Integrin-Antagonisten identifiziert, da alle getesteten Verbindungen MFI-Werte über der Cut-off-Linie aufwiesen. Ergebnisse aus unabhängigen Experimenten, in denen bekannte β2-Integrin-Antagonisten mit unterschiedlichen Inkubationszeiten getestet wurden (Nexinhib20 für 1 h, Lifitegrast für eine halbe Stunde), sind für die Darstellung in dieser Abbildung zusammengefasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die Initiierung und Beendigung der Stimulation und Färbung von Neutrophilen wird durch die Zugabe von Neutrophilen und dem Fixiermittel PFA bestimmt. Daher ist es wichtig, das gleiche Zeitintervall zwischen dem Pipettieren von Neutrophilen oder PFA in jede Säule zu gewährleisten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Stimulations- und Färbezeit der Neutrophilen aus jeder Vertiefung konstant bleibt. Aufgrund der kurzen Lebensdauer von Neutrophilen muss das gesamte Experiment, von der Blutentnahme bei den Spendern bis zum Abschluss der Durchflusszytometrie, am selben Tag durchgeführt werden. Neutrophile Granulozyten reagieren sehr empfindlich auf Temperaturänderungen und können aktiviert werden, wenn sie einem schnellen Temperaturanstieg ausgesetzt sind, z. B. beim Übergang von 4 °C auf Raumtemperatur oder von Raumtemperatur auf 37 °C. Darüber hinaus tritt nach unseren bisherigen Erfahrungen keine fMLP-induzierte neutrophile β2-Integrinaktivierung auf, wenn Zellen auf Eis oder bei 4 °C gelagert werden (Daten nicht gezeigt). Daher sollten Vollblut und Neutrophile vor der Fixierung bei Raumtemperatur oder 20 °C (während des Isolationszentrifugationsschritts) aufbewahrt werden. Vollblut und Neutrophile nicht auf Eis legen.

Die Färbung von mAb24 in Negativkontrollen sollte zu sehr geringen Ergebnissen führen. Wenn in einem Experiment eine hohe mAb24-Färbung beobachtet wird, überprüfen Sie bitte Folgendes: (1) ob es während des Experiments vor der Fixierung eine signifikante Temperaturänderung gab; (2) ob eine fMLP- oder Endotoxin-Kontamination im neutrophilen Medium vorlag; (3) ob die Probenhandhabung zu aggressiv war, wie z. B. die Bildung von Blasen während des Pipettierens und Mischens.

Das derzeitige Protokoll verwendet mAb24, um die Öffnung des β2-Integrin-Kopfstücks zu melden. Theoretisch kann KIM127, ein monoklonaler Antikörper, der die Ausdehnung der β2-Integrine 34,35 meldet, in Verbindung mit mAb24 verwendet werden^, um die β2-Integrin-Konformation umfassend zu bewerten. Das Signal-Rausch-Verhältnis der KIM127-Färbung (1,5- bis 2-fach) ist jedoch nicht so günstig wie das von mAb24 (5- bis 10-fach), das in der Regel keinen zufriedenstellenden Z'-Faktor im 384-Well-Plattenassay liefert. Im 96-Well-Plattenassay können die Proben vor der Durchflusszytometrie gewaschen werden, wodurch die von löslichen Antikörpern abgeleiteten Hintergrundsignale reduziert werden. Daher kann der KIM127-basierte Assay im 96-Well-Platten-Assay durchgeführt werden, der im Vergleich zum 384-Well-Platten-Assay einen geringeren Durchsatz aufweist.

Da diese Methode die Fluoreszenzintensität als Messwert verwendet, um die Integrin-hemmende Wirkung von Medikamenten zu beurteilen, können einige fluoreszierende Medikamente die Ergebnisse beeinträchtigen. Darüber hinaus scheinen toxische Medikamente, die den Tod von Neutrophilen innerhalb der 10-minütigen Stimulationsperiode induzieren, ebenfalls über eine Integrinhemmung zu berichten. Medikamente, die die Degranulation von Neutrophilen hemmen, unterdrücken die Gesamtexpression von β2-Integrinen. Auch diese Degranulationsinhibitoren werden in unserem Screening identifiziert. Daher ist ein sekundäres Screening mit anderen Kontrollen erforderlich, um die hemmende Wirkung der Treffer zu bestätigen. Sekundäre Bildschirme werden als Mittel zur Validierung und Bestimmung des Wirkungsmechanismus von Treffern herangezogen. Zusätzlich zur Wiederholung der mAb24-Tests wird die gesamte CD18-Expression auf der Zelloberfläche mit einem pan-humanen CD18-Antikörper bestimmt. Der Gehalt an aktiviertem β2-Integrin, gemessen mit mAb24, wird durch die gesamte CD18-Expression normalisiert. Auf diese Weise können wir feststellen, ob der Wirkmechanismus des Wirkstoffs darin besteht, die Integrinaktivierung zu antagonisieren und/oder die Expression von CD18 auf der Zelloberfläche zu hemmen. Ein Viabilitätstest sollte auch im sekundären Screening durchgeführt werden, um toxische Wirkungen der Treffer auszuschließen.

Dieses Protokoll hat Einschränkungen. Erstens ist mAb24 in der Lage, die β2 I-ähnliche Domäne nur in Fällen zu detektieren, in denen sich das Integrin in einem hochaffinen Zustand befindet. Daher können α/β I-ähnliche allosterische Antagonisten wie Lifitegrast nicht durch abnehmende mAb24-Bindung identifiziert werden. Lifitegrast induziert mehr mAb24-Bindung³² und zeigt einen abnorm erhöhten MFI-Wert mit mAb24 (Abbildung 4). Für solche abnormalen Werte können andere Assays erforderlich sein, um zu überprüfen, ob es sich bei diesen Treffern um α/β I-ähnliche allosterische Antagonisten wie Lifitegrast handelt. Zweitens ist der Z'-Faktor für diesen Assay suboptimal und könnte möglicherweise durch den Einsatz von automatischem Pipettieren und Rühren verbessert werden. Leider fehlt unserem Labor die notwendige Ausrüstung, um diese Hypothese zu testen. Das Duplizieren oder Verdreifachen von Assays ist hilfreich bei der Identifizierung falsch positiver und negativer Ergebnisse, falls der Z'-Faktor mit den oben genannten Methoden nicht weiter verbessert werden kann. Darüber hinaus kann es vorteilhaft sein, die Inkubationszeit zu verlängern, um mehr Treffer zu identifizieren, wie dies bei dem bekannten β2-Integrin-Aktivierungsinhibitor Nexinhib20 beobachtet wurde, der eine Stunde Inkubation benötigt, um hemmende Wirkungen zu erzeugen. Diese Studie konzentrierte sich auf die Identifizierung schnell wirkender Wirkstoffe. Forscher sollten beachten, dass sie die Inkubationszeit an ihre spezifischen Bedürfnisse anpassen können.

Unseres Wissens ist dies die erste Hochdurchsatz-Screening-Methode für β2-Integrin-Antagonisten. Dieser Ansatz könnte verwendet werden, um niedermolekulare Verbindungen zu identifizieren, die direkt an β2-Integrine binden und Konformationsänderungen verhindern, die zu intermediären/hochaffinen Integrinzuständen führen, ähnlich wie Antagonisten ohne "agonistische" Eigenschaften, die kürzlich für die Integrine αIIbβ3 und α4β1 beschrieben wurden²⁶. Neutrophile Granulozyten sind bei vielen entzündlichen Erkrankungen von entscheidender Bedeutung, wie z. B. myokardiale Ischämie-Reperfusionsschäden 36, Sepsis³⁷ und Autoimmunerkrankungen^38,39. Niedermolekulare Medikamente können im Vergleich zu Medikamenten auf Antikörperbasis mehr Flexibilität bei der Behandlung dieser Krankheiten bieten. Treffer von unserem Bildschirm könnten potenzielle Behandlungen für entzündliche Erkrankungen liefern.

Bei der aktuellen Methode handelt es sich um ein auf fluoreszierenden Antikörpern basierendes Hochdurchsatz-Screening. Da Aktivierungsreporter-Antikörper auch für β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46 und αL-Integrine^47,48,49,50 verfügbar sind^, kann diese Methode auf die Identifizierung von Antagonisten für andere Integrine ausgeweitet werden. Ein konformationssensitiver Antikörper wie HUTS-21, der an die β1-Hybriddomäne bindet 51,52,53, wurde in einem Hochdurchsatz-Screening verwendet, um allosterische Antagonisten des sehr späten Antigen-4 (VLA-4^, Integrin α4β1) zu identifizieren ⁵⁴. Das vorliegende Screening-Verfahren kann auch modifiziert und erweitert werden, um Arzneimittel zu finden, die die Expression anderer Oberflächenrezeptoren hemmen oder fördern, wie z. B. Verbindungen, die die Oberflächenexpression des Mukoviszidose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulators (CFTR) auf Mukoviszidose-Zellen (CF) erhöhen. Bei Mukoviszidose führen multiple Mutationen zu einer CFTR-Fehlfaltung, was zu einer fehlenden Expression von CFTR auf der Zellmembran führt⁵⁵. Es wurde gezeigt, dass niedermolekulare Medikamente die CFTR-Expression wiederherstellen⁵⁶. Für Protokollmodifikationen ist es notwendig, die Inkubationszeit von Medikamenten auf mehrere Stunden zu erhöhen, damit Änderungen der Proteinexpression auftreten können.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16-Kanal-Pipetten	Thermo	4661090N	Instrument
384-Well-Platte	Greiner	784201	Materials
APC Anti-Human CD11a/CD18 (LFA-1) Antikörper Klon: m24	BioLegend	363410	Reagenzien
Bravo  Automatisierte Liquid-Handling-Plattform	Agilent	16050-102	384 Mehrkanal-Flüssigkeitshandler
Zentrifuge	Eppendorf	Modell 5810R	Instrument
FlowJo	Becton, Dickinson & Unternehmen	NA	Software
Humanserum Albumin Lösung (25%)	GeminiBio	800-120	Reagenzien
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	Reagenzien
Nexinhib20	Tocris	6089	Reagenzien
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	F3506	Reagenzien
Paraformaldehyd 16% ige Lösung	Elektronenmikroskopie Sciences	15710	Reagenzien
Platteneimer	Eppendorf	UL155	Zubehör
Plattenschüttler	Fisher	88-861-023	Instrument
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (vorherige 1114683)	Reagenzien
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)	Prestwick Chemical Libraries	Ver19_384	1520 kleine Moleküle, 98% vermarktete zugelassene Arzneimittel (FDA, EMA, JAN und andere Behörden zugelassen)
RPMI 1640 Medium, kein Phenolrot	Gibco	11-835-030	Reagenzien
Ausschwingrotor	Eppendorf	A-4-62	Rotor
ZE5 Zellanalysator	Bio-Rad Laboratories	Modell ZE5	Instrument