In dieser Arbeit wird ein Herstellungsprotokoll für eine neue Art von Kultursubstrat mit Hunderten von Mikrobehältern promm2 vorgestellt, in dem Organoide kultiviert und mittels hochauflösender Mikroskopie beobachtet werden können. Die Zellimpf- und Immunfärbungsprotokolle sind ebenfalls detailliert.
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Methodenartikel
Eine Hochdurchsatzplattform für Kultur und 3D-Bildgebung von Organoiden
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Charakterisierung einer großen Anzahl von dreidimensionalen (3D) organotypischen Kulturen (Organoiden) auf unterschiedlichen Auflösungsskalen ist derzeit durch Standard-Bildgebungsansätze begrenzt. Dieses Protokoll beschreibt eine Möglichkeit zur Herstellung von mikrofabrizierten Organoid-Kulturchips, die eine Multiskalen-3D-Live-Bildgebung auf einem benutzerfreundlichen Instrument ermöglichen, das minimale Manipulationen erfordert und einen Bilddurchsatz von bis zu 300 Organoiden pro Stunde ermöglicht. Diese Kulturchips sind sowohl mit Luft- als auch mit Immersionsobjektiven (Luft, Wasser, Öl und Silikon) und einer Vielzahl gängiger Mikroskope (z. B. rotierende Scheibe, Punktscanner konfokal, Weitfeld und Hellfeld) kompatibel. Darüber hinaus können sie mit Light-Sheet-Modalitäten wie der Single-Objective, Single-Plane-Illumination-Mikroskopie-Technologie (SPIM) (soSPIM) verwendet werden.
Das hier beschriebene Protokoll enthält detaillierte Schritte für die Herstellung der mikrofabrizierten Kulturchips und die Kultur und Färbung von Organoiden. Es ist nur eine kurze Zeit erforderlich, um sich daran zu gewöhnen, und Verbrauchsmaterialien und Geräte können in normalen Biolaboren leicht gefunden werden. Hier werden die 3D-Bildgebungsmöglichkeiten nur mit kommerziellen Standardmikroskopen demonstriert (z. B. Spinning Disk für die 3D-Rekonstruktion und Weitfeldmikroskopie für die Routineüberwachung).
Einleitung
In organotypischen 3D-Zellkulturen, im Folgenden als Organoide bezeichnet, differenzieren sich Stammzellen und organisieren sich selbst zu räumlichen Strukturen, die starke morphologische und funktionelle Ähnlichkeiten mit realen Organen aufweisen. Organoide bieten wertvolle Modelle, um die menschliche Biologie und Entwicklung außerhalb des Körpers zu untersuchen 1,2,3. Es werden immer mehr Modelle entwickelt, die Leber, Gehirn, Niere, Lunge und viele andere Organe nachahmen 2,4,5. D....
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Protokoll
HINWEIS: Der erste Teil dieses Protokolls beschreibt die Mikrofabrikation des Zellkulturgeräts. Eine originale Primärform mit pyramidenförmigen Hohlräumen kann im eigenen Haus hergestellt werden - wenn Mikrofertigungsanlagen verfügbar sind - oder an externe Unternehmen ausgelagert werden. Die Primärform, die in dieser Arbeit verwendet wird, wird im eigenen Haus hergestellt, wobei die Herstellungsprozessschritte an anderer Stelle11,13 beschrieben sind. Ein grundlegendes Protokoll für die Mikrofabrikation der Form ist in der Ergänzungsdatei 1 verfügbar. KRITISCH: Die Vorgänge in den Schritten 1 ....
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Ergebnisse
Abbildung 8F zeigt das typische Aussehen eines Zellkulturdeckglases nach erfolgreicher Herstellung. Die UV-härtende Klebeschicht wirkt flach und haftet gut auf dem Deckglas. Die Übertragung der Klebeschicht auf dem Deckglas kann fehlschlagen, wenn die Schicht auf dem Deckglas übermäßig ausgehärtet ist oder wenn das Entfernen des flachen PDMS-Substrats nicht korrekt erfolgt (wie in Abbildung 8G,H dargestellt). In beiden Fällen ist der Fehler offe.......
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Diskussion
Das Verfahren zur Herstellung der Mikrotiterkulturschale, die eine hochdichte Organoidkultur und -differenzierung ermöglicht, wurde in dieser Arbeit beschrieben. Aufgrund der Geometrie und Anordnung der Mikrokavitäten können Tausende von Sphäroiden über lange Zeiträume (mehrere Wochen oder länger) nahezu ohne Materialverlust in einer einzigen Platte kultiviert und gefärbt werden. Zum Vergleich: Eine Fläche von 4 mm x 2 mm auf der Zellkulturplatte kann so viele Sphäroide enthalten wie eine einzelne 384-Well-Platte mit ein.......
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Offenlegungen
Eine internationale Patentanmeldung wurde mit der Publikationsnummer WO 2021/167535 A1 veröffentlicht.
Danksagungen
Die Forschung wird durch das CALIPSO-Projekt unterstützt, das von der National Research Foundation, Büro des Premierministers, Singapur, im Rahmen ihres Programms Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE) unterstützt wird. V.V. bedankt sich für die Unterstützung des NRF-Ermittlers NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI-Seed-Finanzierung und ANR ADGastrulo. A.B. und G.G. bedanken sich für die Unterstützung durch die MBI-Grundfinanzierung. A.B. bedankt sich bei Andor Technologies für die Leihgabe des BC43-Mikroskops.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2-Propanol | Thermofisher wissenschaftliches | AA19397K7 | |
| Aceton | Thermofisher wissenschaftliches | AA19392K7 | |
| BC43 Konfokales Tischmikroskop | Andor Technology | Konfokalmikroskop mit rotierender Scheibe | |
| Rinderserumalbumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Gepufferte Oxidätzlösung | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Entwickler AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq Wasser | Millipore | ||
| Fötales Rinderserum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glasdeckgläser | Marienfled | 117650 | 1,5H, rund 25 mm Durchmesser |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris Software | BitPlane | Bildanalysesoftware | |
| Optisches Mikroskop mit inverser Transmission | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultraschall-Homogenisator | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | biomimetisches Copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV-härtender Klebstoff |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher wissenschaftlich | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | Für die O2 Plasmabehandlung |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | wasserlösliches Klärmittel |
| RCT Heizplatte/Rührer | IKA (MY) | ||
| Reaktives Ionenätzwerkzeug | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | Nährmedium für HCT116-Zellen |
| Sylgard 184 Silikonelastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxan oder kurz PDMS |
| Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | Tensid |
| Trypsin EDTA | Thermofisher wissenschaftlicher | 15400054 | |
| Ultraschallreiniger | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED-Lichtquelle, 365 nm Wellenlänge, 35 mW/cm2 Leistungsdichte UV-Maske | |
| Aligner | SÜSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
Referenzen
- Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
- Kratochvil, M. J., et....
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Nachdrucke und Genehmigungen
