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Methodenartikel

Eine Hochdurchsatzplattform für Kultur und 3D-Bildgebung von Organoiden

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DOI:

10.3791/64405

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14. Oktober 2022

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1Mechanobiology Institute (MBI), National University of Singapore, 2Biomedical Engineering Department, National University of Singapore, 3Department of Biological Sciences, National University of Singapore, 4IRL 3639 CNRS, 5Department of Microbiology & Immunology, Immunology Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird ein Herstellungsprotokoll für eine neue Art von Kultursubstrat mit Hunderten von Mikrobehältern promm2 vorgestellt, in dem Organoide kultiviert und mittels hochauflösender Mikroskopie beobachtet werden können. Die Zellimpf- und Immunfärbungsprotokolle sind ebenfalls detailliert.

Zusammenfassung

Die Charakterisierung einer großen Anzahl von dreidimensionalen (3D) organotypischen Kulturen (Organoiden) auf unterschiedlichen Auflösungsskalen ist derzeit durch Standard-Bildgebungsansätze begrenzt. Dieses Protokoll beschreibt eine Möglichkeit zur Herstellung von mikrofabrizierten Organoid-Kulturchips, die eine Multiskalen-3D-Live-Bildgebung auf einem benutzerfreundlichen Instrument ermöglichen, das minimale Manipulationen erfordert und einen Bilddurchsatz von bis zu 300 Organoiden pro Stunde ermöglicht. Diese Kulturchips sind sowohl mit Luft- als auch mit Immersionsobjektiven (Luft, Wasser, Öl und Silikon) und einer Vielzahl gängiger Mikroskope (z. B. rotierende Scheibe, Punktscanner konfokal, Weitfeld und Hellfeld) kompatibel. Darüber hinaus können sie mit Light-Sheet-Modalitäten wie der Single-Objective, Single-Plane-Illumination-Mikroskopie-Technologie (SPIM) (soSPIM) verwendet werden.

Das hier beschriebene Protokoll enthält detaillierte Schritte für die Herstellung der mikrofabrizierten Kulturchips und die Kultur und Färbung von Organoiden. Es ist nur eine kurze Zeit erforderlich, um sich daran zu gewöhnen, und Verbrauchsmaterialien und Geräte können in normalen Biolaboren leicht gefunden werden. Hier werden die 3D-Bildgebungsmöglichkeiten nur mit kommerziellen Standardmikroskopen demonstriert (z. B. Spinning Disk für die 3D-Rekonstruktion und Weitfeldmikroskopie für die Routineüberwachung).

Einleitung

In organotypischen 3D-Zellkulturen, im Folgenden als Organoide bezeichnet, differenzieren sich Stammzellen und organisieren sich selbst zu räumlichen Strukturen, die starke morphologische und funktionelle Ähnlichkeiten mit realen Organen aufweisen. Organoide bieten wertvolle Modelle, um die menschliche Biologie und Entwicklung außerhalb des Körpers zu untersuchen 1,2,3. Es werden immer mehr Modelle entwickelt, die Leber, Gehirn, Niere, Lunge und viele andere Organe nachahmen 2,4,5. Die Differenzierung in Organoiden erfolgt durch die Zugabe von löslichen Wachstumsfaktoren und einer extrazellulären Matrix in einer präzisen zeitlichen Abfolge. Im Gegensatz zu Organen ist die Entwicklung von Organoiden jedoch recht heterogen.

Neben zahlreichen biologischen Herausforderungen 6,7 stellen Organoidkulturen auch technologische Herausforderungen in Bezug auf Zellkulturmethoden, Charakterisierung der Transkriptomik und Bildgebung dar. Die In-vivo-Organentwicklung findet in einer biologischen Umgebung statt, die zu einer hochgradig stereotypen Selbstorganisation von Zellanordnungen führt. Jede phänotypische Veränderung kann als Proxy verwendet werden, um einen erkrankten Zustand zu diagnostizieren. Im Gegensatz dazu entwickeln sich Organoide in vitro in minimal kontrollierten Mikroumgebungen, die mit Zellkulturbedingungen kompatibel sind, was zu einer großen Variabilität im Entwicklungspfad und in der Formbildung für jedes einzelne Organoid führt.

Eine aktuelle Studie8 zeigte, dass die quantitative Abbildung der Organoidform (Phänotyp-Deskriptoren) in Verbindung mit der Bewertung einiger genetischer Marker die Definition phänotypischer Entwicklungslandschaften ermöglicht. Die Fähigkeit, die Vielfalt der genomischen Expression in Organoiden mit ihrem phänotypischen Verhalten in Beziehung zu setzen, ist wohl ein wichtiger Schritt, um das volle Potenzial organotypischer Kulturen freizusetzen. Daher bittet es um die Entwicklung von dedizierten, hochinhaltlichen Bildgebungsansätzen, die die Charakterisierung von organoiden Merkmalen auf subzellulären, multizellulären und ganzorganoiden Skalen in 3D 9,10 ermöglichen.

Wir haben eine vielseitige High-Content-Screening-Plattform (HCS) entwickelt, die eine optimierte Organoidkultur (von isolierten humanen embryonalen Stammzellen [hESCs], humaninduzierten pluripotenten Stammzellen [hIPSCs] oder Primärzellen bis hin zu mehrzelligen, differenzierten 3D-Organoiden) und eine schnelle, nicht-invasive 3D-Bildgebung ermöglicht. Es integriert ein miniaturisiertes 3D-Zellkulturgerät der nächsten Generation, den sogenannten JeWells-Chip (im Folgenden der Chip ), der Tausende von gut angeordneten Mikrotiterplatten enthält, die von 45°-Spiegeln flankiert werden, die eine schnelle, hochauflösende 3D-Bildgebung durch Einzelobjektiv-Lichtblattmikroskopie ermöglichen11. Dieses System ist kompatibel mit jedem handelsüblichen, inversen Mikroskop und ermöglicht die Abbildung von 300 Organoiden in 3D mit subzellulärer Auflösung in <1 h.

Die Mikrofabrikation der Zellkulturvorrichtung geht von einer vorhandenen mikrostrukturierten Form aus, die Hunderte von Mikropyramiden (Abbildung 1A) mit einer quadratischen Basis und Seitenwänden in einem Winkel von 45° zur Basis enthält. Abbildung 1C zeigt elektronenmikroskopische (EM) Aufnahmen solcher Strukturen. Die Form selbst besteht aus Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) und kann als Nachbildung einer Primärform (hier nicht gezeigt) mit entsprechenden Merkmalen (als Hohlräume) unter Verwendung von Standard-Soft-Lithographie-Verfahren hergestellt werden. Die Primärform kann durch verschiedene Verfahren hergestellt werden. Dasjenige, das für dieses Protokoll verwendet wurde, wurde unter Verwendung von Silizium-Nassätzen hergestellt, wie in Galland et al. berichtet. 11; Das Verfahren zur Herstellung der Primärform ist für dieses Protokoll nicht kritisch. Die Pyramiden sind in einem quadratischen Array angeordnet, mit dem gleichen Abstand für die X- und Y-Richtung (in diesem Fall beträgt der Abstand 350 μm).

Zur Veranschaulichung wurden Proof-of-Concept-Experimente12 veröffentlicht, um zu zeigen, dass der Chip Langzeitkultur- (Monate) und Differenzierungsprotokolle ermöglicht und gleichzeitig die Anzahl der Anfangszellen in den Vertiefungen genau definiert. Die individuelle Entwicklung einer großen Anzahl von Organoiden kann mit Standard-Hellfeld- und 3D-Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopen automatisch live überwacht werden. Darüber hinaus können Organoide für weitere biologische Untersuchungen (z.B. Transkriptomanalysen) gewonnen werden. In diesem Artikel werden detaillierte Protokolle für die Herstellung der Zellkultur-Deckgläser, das Seeding- und Färbeverfahren für die Fluoreszenzmikroskopie sowie die Gewinnung der Organoide beschrieben.

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Protokoll

HINWEIS: Der erste Teil dieses Protokolls beschreibt die Mikrofabrikation des Zellkulturgeräts. Eine originale Primärform mit pyramidenförmigen Hohlräumen kann im eigenen Haus hergestellt werden - wenn Mikrofertigungsanlagen verfügbar sind - oder an externe Unternehmen ausgelagert werden. Die Primärform, die in dieser Arbeit verwendet wird, wird im eigenen Haus hergestellt, wobei die Herstellungsprozessschritte an anderer Stelle11,13 beschrieben sind. Ein grundlegendes Protokoll für die Mikrofabrikation der Form ist in der Ergänzungsdatei 1 verfügbar. KRITISCH: Die Vorgänge in den Schritten 1 bis 6 müssen in einer staubfreien Umgebung durchgeführt werden. Eine Laminar-Flow-Haube oder ein Reinraum, falls vorhanden, werden bevorzugt. Bei all diesen Schritten muss persönliche Schutzausrüstung (PSA) wie Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrille verwendet werden.

1. Würfeln von PDMS-Formen

  1. Schneiden Sie kleine Teile der PDMS-Form auf das für das Endprodukt erforderliche Maß (z. B. 1 cm x 1 cm [Abbildung 1B]). Schneiden Sie sie parallel zu den XY-Richtungen des Arrays.
    KRITISCH: Wenn Sie die PDMS-Form in 1 cm x 1 cm große Würfel schneiden, führen Sie die Schnitte in einzelnen Schritten aus. Üben Sie mit einer einseitigen Rasierklinge Druck aus und schneiden Sie das PDMS in einem einzigen Schritt durch. Dies soll die Bildung von kleinen PDMS-Partikeln verhindern, die sich auf der Oberfläche der Form ablagern und die Qualität der Replikationsschritte beeinträchtigen können (Schritt 3).

2. Vorbereitung von flachen PDMS-Substraten

  1. Wiegen Sie ~ 15-20 g PDMS-Basisharz und 1,5-2 g seines Retikulationsmittels (d. h. ein Verhältnis von 10: 1), mischen Sie sie sorgfältig und entgasen Sie in einem Vakuumgefäß für ~ 20 Minuten.
  2. Gießen Sie das entgaste PDMS langsam auf eine 15 cm breite Petrischale aus Kunststoff (Durchmesser).
  3. Härten Sie das PDMS aus, indem Sie die Petrischale 2 Stunden lang in einem Ofen bei 65° C aufbewahren. Nach dem Warten auf den Abschluss der Aushärtung ist eine flache PDMS-Folie mit einer Dicke von ~1,5 mm (in der Petrischale enthalten) einsatzbereit (Abbildung 2A).
  4. Schneiden Sie mit einer scharfen Klinge 2 cm x 2 cm große Stücke aus dem PDMS aus (Abbildung 2B-D).
    HINWEIS: Die genaue Dicke dieses PDMS-Blattes ist nicht entscheidend. ~1-2 mm ist ein geeigneter Bereich. Die Abmessungen für den Schnitt sollten größer sein als die strukturierte Form, aber nicht viel größer, was zu Materialverschwendung führen würde.

3. Herstellung der strukturierten Schicht aus UV-härtendem Klebstoff

  1. Legen Sie einen PDMS-Formwürfel (wie in Schritt 1 vorbereitet) mit der Vorderseite nach unten auf den flachen PDMS-Schnitt (wie in Schritt 2 vorbereitet) (Abbildung 3A, B).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die pyramidenförmigen Vorsprünge in der Form auf das flache PDMS-Substrat ausgerichtet sind und dass nur die obere Oberfläche der abgeschnittenen Pyramidenstumpfe in Kontakt kommt. Beurteilen Sie die korrekte Platzierung mit einem Lichtmikroskop (Abbildung 3C, D).
  2. Tropfen Sie mit einer Pipette eine kleine Menge (zwei Tropfen, ca. 0,1-0,2 ml) UV-härtenden Klebstoffs auf eine Seite der Form (Abbildung 4A).
    HINWEIS: Wenn die Flüssigkeit mit dem Rand der Form in Kontakt kommt, treibt die Kapillarität die Flüssigkeit an, um den Hohlraum zwischen der Form selbst und dem flachen Schnitt des PDMS zu füllen, das als Substrat verwendet wird.
    1. Verfolgen Sie den Verlauf der Flüssigkeit im Hohlraum, z. B. mit einem inversen Lichtmikroskop mit einem 10-fachen Vergrößerungsobjektiv (Abbildung 4B, C).
  3. Setzen Sie den UV-härtenden Klebstoff UV-Licht aus, um ihn auszuhärten. Passen Sie die Belichtungszeit in Abhängigkeit von der Leistungsdichte der verwendeten UV-Quelle an (z. B. eine UV-LED-Box mit einer Leistungsdichte von 35 mW/cm 2;2 min bei 50% Leistung in diesem Protokoll, um den Klebstoff vollständig auszuhärten).
  4. Halten Sie den ausgehärteten Klebstoff mit der überschüssigen Klebstoffmenge an einer Kante auf dem flachen PDMS-Substrat, indem Sie ihn vorsichtig mit einem Finger drücken (Abbildung 5A, B). Verwenden Sie in der Zwischenzeit eine Pinzette, um eine Ecke der Form neben der gleichen Kante einzuklemmen, die nach unten gedrückt wird, und ziehen Sie sie langsam ab, während Sie sicherstellen, dass die strukturierte Folie nicht ebenfalls angehoben wird.
    HINWEIS: Abbildung 5C zeigt das Ergebnis einer ordnungsgemäßen Schimmelentfernung. Abbildung 5E-G zeigt die falsche Vorgehensweise.
  5. Schneiden Sie den überschüssigen Klebstoff und das überschüssige PDMS-Substrat mit einer Rasierklinge ab, um die ausgehärtete, strukturierte Klebeschicht flach auf dem PDMS zu belassen, wobei überschüssiges PDMS nur an einer Kante vorhanden ist (Abbildung 5D), was in Schritt 5 benötigt wird.

4. Vorbereitung des Deckglassubstrats

HINWEIS: Als Substrat für das Endprodukt werden gerundete Standard-1,5-H-Deckgläser mit 25 mm Durchmesser verwendet. Bevor sie verwendet werden können, müssen sie gereinigt werden, um Staub und/oder organische Rückstände von ihrer Oberfläche zu entfernen.

  1. Deckglasreinigung
    1. Tauchen Sie die Deckgläser für 5 min in Seifenwasser, während der Ultraschall angewendet wird (40 kHz, 110 W Schallleistung).
    2. Waschen Sie die Deckgläser in sauberem, deionisiertem Wasser (DI), zuerst durch Eintauchen und schließlich mit fließendem Wasser aus einem Wasserhahn. Trocknen Sie die Deckgläser mit einer Gasblaspistole N2 .
    3. Tauchen Sie die Deckgläser für 5 min in ein Acetonbad; Bewegen Sie sich sofort für weitere 5 Minuten in ein 2-Propanol (IPA) -Bad.
    4. Spülen Sie die Deckgläser mit sauberem IPA mit einer Quetschflasche ab. Trocknen Sie die Deckgläser mit der Gasblaspistole N2 .
      HINWEIS: Deckgläser, die mit diesem Verfahren gereinigt wurden, können bis zum Bedarf in einem geschlossenen Behälter aufbewahrt werden. Bewahren Sie sie in einem trockenen Schrank auf, um zu vermeiden, dass sich Feuchtigkeit auf ihrer Oberfläche ablagert.
  2. Wenn es gebrauchsfertig ist, behandeln Sie ein sauberes Deckglas mit einem kurzenO2-Plasmaprozess , um seine Hydrophilie zu verbessern: O2 20 sccm, 3 mbar Druck, 60 W am HF-Stromgenerator und 60 s Dauer.
  3. Unmittelbar nach der Plasmaaktivierung wird die dünne Schicht des UV-härtenden Klebstoffs mit dem Schleudern beschichtet, indem Sie das Deckglas auf das Vakuumspannfutter eines Standard-Schleuderbeschichters legen und einen kleinen Tropfen Klebstoff in die Mitte des Deckglases gießen (Abbildung 6). Führen Sie den Schleuderbeschichtungsprozess durch: Streuen für 5 s bei 500 U/min, Beschichtung bei 3.000 U/min für 45 s (mit Beschleunigung und Verzögerung auf 100 U/min/s).
    1. Wenn die Schleuderbeschichtung nicht verfügbar ist, verwenden Sie die folgende Alternative, um einen dünnen UV-Klebstofffilm auf den Deckgläsern zu erzeugen:
      1. Tropfen Sie ~0,1 ml UV-härtenden Klebstoffs mit einer Pipette auf ein sauberes Deckglas (Abbildung 7A).
      2. Nehmen Sie ein zweites Deckglas und legen Sie es auf das erste, damit sich der flüssige Klebstoff gleichmäßig zwischen den beiden Deckgläsern verteilt (Abbildung 7B-D).
      3. Sobald der Streukleber die Ränder der Deckgläser erreicht hat, trennen Sie sie vorsichtig, indem Sie sie übereinander schieben. Nach dem Trennen werden beide Deckgläser vollständig mit einer dünnen Schicht Flüssigkleber beschichtet (Abbildung 7E).
        HINWEIS: Die Beschichtung ist möglicherweise nur dann nicht gleichmäßig und glatt, wenn die Trennung nicht mit einer glatten und kontinuierlichen Bewegung erfolgt.
  4. Vorhärtung von UV-härtendem Klebstoff
    1. Nach der Schleuderbeschichtung wird der Klebstoff unter UV-Einwirkung vorgehärtet. Passen Sie die Belichtungszeit in Abhängigkeit von der Leistungsdichte der verwendeten UV-Quelle an (hier wurde eine UV-LED-Box mit einer Leistungsdichte von 35 mW/cm2 für 1 min bei 50% Leistung verwendet).
      KRITISCH: Bei dem hier verwendeten Klebstoff handelt es sich um einen optischen Klebstoff. In der Diskussion finden Sie die wichtigsten Punkte im Zusammenhang mit den Energiedosen für die Aushärtung.

5. Übertragung der texturierten Folie auf das endgültige Substrat

  1. Nehmen Sie eine der texturierten Folien (vorbereitet in Schritt 3) und bringen Sie sie in Kontakt mit dem selbstklebenden Deckglas (vorbereitet in Schritt 4). Stellen Sie sicher, dass der Kontakt zwischen dem teilweise ausgehärteten Klebstoff auf dem Deckglas und der strukturierten Folie so gleichmäßig wie möglich ist (Abbildung 8A-C).
    KRITISCH: In diesem Stadium sollte der Klebstoff auf dem Deckglas fest genug sein, um ein Refließen zu vermeiden, was die pyramidenförmigen Hohlräume der strukturierten Folie füllen würde, wenn sie in Kontakt gebracht wird, aber auch plastisch und klebrig genug ist, dass der Kontakt durch sanftes Drücken auf die strukturierte Folie optimiert werden kann.
  2. Setzen Sie die Deckgläser UV-Licht aus, bis die auf dem Deckglas beschichtete Klebeschicht vollständig ausgehärtet ist. Dadurch wird die strukturierte Folie auf dem Deckglas versiegelt und eine auslaufsichere Isolierung zwischen den Pyramidenhohlräumen gewährleistet.
  3. Zum Schluss ziehen Sie das flache PDMS-Substrat ab (Abbildung 8D-F). Drücken Sie das PDMS mit einer Pinzette an einer Ecke an der Kante zusammen, an der überschüssiges Material nach dem Trimmen zurückgeblieben ist (Schritt 3.5). Auf diese Weise bleibt die strukturierte Filmschicht auf dem Deckglas haftend und hat oben freien Zugang für die Zellaussaat. KRITISCH: Beim Abziehen des flachen PDMS sollte die strukturierte Folie gut am Deckglas haften. Adhäsionsfehler lassen sich leicht bestätigen, wenn sich der texturierte Film nach der letzten UV-Einwirkung ohne Anstrengung vom Deckglas ablösen lässt.

6. Langzeitpassivierung des Zellkulturdeckglases für die Zellkultur

HINWEIS: Die Passivierung wird durch die Erzeugung einer konformen und kontinuierlichen Beschichtung eines biomimetischen Copolymers mit einer Struktur erreicht, die der polaren Gruppe der Phospholipide in der Zellmembran ähnelt. Diese Schutzbeschichtung verhindert die Anhaftung der Zellen an das Zellkulturgerät

  1. Es wird eine Lösung mit 0,5 % (w/v) des in reinem Ethanol gelösten biomimetischen Copolymers hergestellt. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C für die zukünftige Verwendung.
  2. Legen Sie das Zellkulturdeckglas in eine 35 mm Petrischale und bedecken Sie es vollständig mit der biomimetischen Copolymerlösung.
  3. Nach 5 min das Zellkulturdeckglas mit der biomimetischen Copolymerlösung aus dem Behälter nehmen und bei Raumtemperatur in der fertigen Schale in einer Biosicherheitshaube trocknen lassen (>1 h).
    HINWEIS: Eine dickere Beschichtung kann hergestellt werden, indem die Konzentration des biomimetischen Copolymers in der Beschichtungslösung erhöht wird. Die Ergebnisse einer dickeren Beschichtung sind unter einem Hellfeldmikroskop sichtbar (Abbildung 9A).

7. Zell-Seeding

  1. Entgasung und Sterilisation
    1. Geben Sie kurz vor der Zellaussaat sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Zellkulturschalen (typischerweise 1 ml für eine 35-mm-Petrischale). Entgasen Sie die Schale mit dem sterilen PBS mit einem Ultraschallgerät für ~ 10 Minuten, gefolgt von mehreren Pipettierungsrunden, um alle Blasen zu entfernen.
      KRITISCH: Wenn Luft in den Pyramidenhöhlen eingeschlossen ist, verhindert sie, dass die Zellen in sie eindringen. Um sicherzustellen, dass vor der Zellaussaat keine Luft in der Pyramide eingeschlossen wird, wird empfohlen, die Abwesenheit von Luft in diesen Hohlräumen visuell sicherzustellen (unter einem Tischhellfeldmikroskop bei 10-facher oder 20-facher Vergrößerung) (Abbildung 10).
    2. Ersetzen Sie das PBS durch steriles Kulturmedium und sterilisieren Sie die Platte mit UV-Licht für 30 Minuten unter einer Zellkulturhaube.
      HINWEIS: Ab diesem Schritt sollte das Gericht als steril betrachtet und mit sterilen Techniken manipuliert werden. Eine alternative Möglichkeit, eingeschlossene Luft aus dem Zellkulturgerät zu entfernen, ist die Verwendung eines Vakuumbehälters mit einer Vakuumpumpe.
  2. Zubereitung der Zellsuspension
    HINWEIS: Die Zellen können als einzel- oder kleinzellige Aggregate ausgesät werden und durch die obere Öffnung in die Probenvertiefung gelangen. Im Laufe der Zeit aggregieren und wachsen die eingeführten Zellen in den Probentöpfen zu Sphäroiden heran, deren Größe größer ist als die Größe der Apertur. Als validierte Zelllinienmodelle werden HCT116 (CCL-247 ATCC) oder MCF7 (HTB-22 ATCC) Krebszellen verwendet, die in empfohlenem Kulturmedium (ATCC-Richtlinien) gehalten werden.
    1. Bereiten Sie eine Zellsuspension vor (z. B. mit einem Trypsinisierungsverfahren nach ATCC-Richtlinien). Befolgen Sie die Empfehlungen zur Trypsinisierung / Zellsuspensionsvorbereitung für die interessierenden Zellen.
    2. Zählen und stellen Sie die Zellkonzentration auf 0,5 × 106 Zellen/ml im empfohlenen Kulturmedium ein.
  3. Dosieren von Zellen
    1. Entfernen Sie den PBS-Puffer aus der 35-mm-Zellkulturschale und geben Sie dann 1 ml der eingestellten Zellsuspension ab. Siehe Abbildung 11A für ein lichtmikroskopisches Bild eines Zellimpfverfahrens mit ausreichender Zelldichte und Homogenität.
    2. Legen Sie die Zellkulturschale für 10 min wieder in den Zellinkubator (37 °C, 5%CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit). Ungefähr 80-100 Zellen treten in jede Pyramidenhöhle ein.
      HINWEIS: Es ist möglich, die Anzahl der Zellen pro Zellkulturschale zu erhöhen, indem entweder die Zellkonzentration oder die Zeit vor der Entfernung der Zellsuspension erhöht wird. Typischerweise dauert die Sphäroidbildung (je nach Zelltyp) mehrere Stunden nach der Zellaussaat und kann mit einem Hellfeldmikroskop (4x bis 40x Objektive; Abbildung 11). Von hier aus können Kulturmedium, extrazelluläre Matrices und Differenzierungswachstumsfaktoren in Übereinstimmung mit typischen Differenzierungsprotokollen, die einige Tage, Wochen oder Monate dauern können, verändert oder der Zellkulturschale hinzugefügt werden, die die Sphäroide enthält.
    3. Nach der 10-minütigen Inkubation die Zellkulturschale aus dem Inkubator entnehmen und die Zellsuspension vorsichtig absaugen, um nicht eingeschlossene Zellen zu entfernen. Geben Sie 1 ml Kulturmedium in eine 35-mm-Schale und legen Sie sie zurück in den Zellinkubator.
      KRITISCH: Da sich in diesem Stadium noch keine Sphäroide gebildet haben, ist es sehr wichtig, eine starke Aspiration oder Abgabe zu vermeiden, die zum Verlust der Zellen führt. Die visuelle Kontrolle mit einem Tisch-Hellfeldmikroskop wird bei diesem Schritt dringend empfohlen.

8. Immunfärbung und Bildgebung

  1. Fixierung und Färbung
    HINWEIS: Verschiedene klassische Verfahren der Fixierung und Immunfärbung sind vollständig kompatibel mit der Zellkulturschale. Ein typisches Protokoll wird hier beschrieben.
    1. Die Organoide/Sphäroide in der Zellkulturschale für 20 min in 4%igem Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixieren.
    2. Die Organoide werden für 24 h in 1%iger Tensidlösung in sterilem PBS bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler permeabilisiert und 24 h in Blockierungspuffer (2% Rinderserumalbumin [BSA] und 1% Tensid in sterilem PBS) bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler inkubiert.
    3. Die Proben werden mit den primären Antikörpern von Interesse in einer Verdünnung zwischen 1/50 und 1/200 (oder gemäß den Empfehlungen des Herstellers) in einem Antikörperverdünnungspuffer (2% BSA und 0,2% Tensid in sterilem PBS) bei 4 °C für 48 h inkubiert.
    4. Die Proben werden 3x mit einem Waschpuffer auf einem Orbitalschüttler (3% NaCl und 0,2% Tensid in sterilem PBS) gespült und mit entsprechenden sekundären Antikörpern in Antikörperverdünnungspuffer (Verdünnung zwischen 1/100 und 1/300 oder gemäß den Empfehlungen des Herstellers), 0,5 μg/mL 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und 0,2 μg/ml Alexa Fluor 647 oder 488 Phalloidin bei 4 °C für 24 h auf einem Orbitalschüttler inkubiert. gefolgt von fünf Spülschritten mit PBS. Optional können die Proben mit einem auf 37 °C vorgewärmten wasserlöslichen Reinigungsmittel montiert werden.
  2. Bildgebung
    HINWEIS: In diesem Stadium können die Organoide in der Mikrotiterplatte als normale Kulturschale betrachtet werden, die fixierte und gefärbte Proben für die Bildgebung enthält: Jedes Standard-Bildgebungsverfahren kann verwendet werden, ohne dass eine Anpassung oder Modifikation erforderlich ist. Abbildung 12 zeigt ein repräsentatives Ergebnis von Bildern und 3D-Rekonstruktionen, die mit einem konfokalen Mikroskop mit rotierender Scheibe und einem 40-fachen Luftobjektiv (numerische Apertur 0,75) aufgenommen wurden.
    1. Verwenden Sie eine Konstruktorsoftware für den automatischen Bilderfassungsprozess mit den folgenden Einstellungen: Belichtungszeit = 50 ms, mit einem z-motorisierten Tisch zur Erfassung eines Z-Stacks (1 μm Z-Schritt, für eine Gesamthöhe von 70 μm).
    2. Führen Sie eine 3D-Rekonstruktion mit einer Bildanalysesoftware durch.

9. Freisetzung und Sammlung der Organoide

HINWEIS: Die texturierte Klebeschicht der Zellkulturschale kann vom Deckglas gelöst werden, um die in den Pyramidenhohlräumen enthaltenen lebenden Sphäroide/Organoide (vor der Fixierung) für die Analyse der Zellen mit anderen Verfahren wie RNA-Sequenzierung, -omik-Ansätzen, In-vitro-Experimenten und In-vivo-Transplantation freizugeben.

  1. Während sich die Probe noch in der Petrischale und in einer Biosicherheitshaube befindet, schneiden Sie mit einer Klinge wie einem Skalpell eine Ecke der strukturierten Klebeschicht ab.
  2. Drücken Sie die strukturierte Klebeschicht mit einer Pinzette auf die Schnittkante und ziehen Sie sie vorsichtig vom Glasdeckglas ab, lassen Sie sie jedoch in das Medium eingetaucht (einige Organoide können mit der Klebeschicht verbleiben, Abbildung 13).
  3. 3x mit Nährmedium abspülen und die Organoide durch Pipettieren auffangen.

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Ergebnisse

Abbildung 8F zeigt das typische Aussehen eines Zellkulturdeckglases nach erfolgreicher Herstellung. Die UV-härtende Klebeschicht wirkt flach und haftet gut auf dem Deckglas. Die Übertragung der Klebeschicht auf dem Deckglas kann fehlschlagen, wenn die Schicht auf dem Deckglas übermäßig ausgehärtet ist oder wenn das Entfernen des flachen PDMS-Substrats nicht korrekt erfolgt (wie in Abbildung 8G,H dargestellt). In beiden Fällen ist der Fehler offe...

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Diskussion

Das Verfahren zur Herstellung der Mikrotiterkulturschale, die eine hochdichte Organoidkultur und -differenzierung ermöglicht, wurde in dieser Arbeit beschrieben. Aufgrund der Geometrie und Anordnung der Mikrokavitäten können Tausende von Sphäroiden über lange Zeiträume (mehrere Wochen oder länger) nahezu ohne Materialverlust in einer einzigen Platte kultiviert und gefärbt werden. Zum Vergleich: Eine Fläche von 4 mm x 2 mm auf der Zellkulturplatte kann so viele Sphäroide enthalten wie eine einzelne 384-Well-Platte mit ein...

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Offenlegungen

Eine internationale Patentanmeldung wurde mit der Publikationsnummer WO 2021/167535 A1 veröffentlicht.

Danksagungen

Die Forschung wird durch das CALIPSO-Projekt unterstützt, das von der National Research Foundation, Büro des Premierministers, Singapur, im Rahmen ihres Programms Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE) unterstützt wird. V.V. bedankt sich für die Unterstützung des NRF-Ermittlers NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI-Seed-Finanzierung und ANR ADGastrulo. A.B. und G.G. bedanken sich für die Unterstützung durch die MBI-Grundfinanzierung. A.B. bedankt sich bei Andor Technologies für die Leihgabe des BC43-Mikroskops.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-PropanolThermofisher wissenschaftlichesAA19397K7
AcetonThermofisher wissenschaftlichesAA19392K7
BC43 Konfokales TischmikroskopAndor TechnologyKonfokalmikroskop mit rotierender Scheibe
Rinderserumalbumin Thermofisher scientific37525
Gepufferte OxidätzlösungMerck901621-1L
CEE Spin CoaterBrewer Science200X
DAPIThermofisher scientific62248
Entwickler AZ400KMerck18441223164
DI Milliq WasserMillipore
Fötales Rinderserum (FBS)Invitrogen10082147
GlasdeckgläserMarienfled1176501,5H, rund 25 mm Durchmesser
HepesInvitrogen15630080
Imaris SoftwareBitPlaneBildanalysesoftware
Optisches Mikroskop mit inverser TransmissionNikonTSF100-F
Labsonic MSartorius Stedium BiotechUltraschall-Homogenisator
LipidureNOF AmericaCM5206biomimetisches Copolymer
NOA73Norland Products17-345UV-härtender Klebstoff
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15070063
PhalloidinThermofisher wissenschaftlich A12379Alexa Fluor
Phosphate Buffer SolutionThermofisher scientific10010023
Photo Resist AZ5214EMerck14744719710
Pico Plasma toolDiener Electronic GmbH + Co. KGPico PlasmaFür die O2 Plasmabehandlung
RapiClear 1.52Sunjin labRC 152001wasserlösliches Klärmittel
RCT Heizplatte/RührerIKA (MY)
Reaktives IonenätzwerkzeugSamco Inc. (JPN)RIE-10NR
RPMI 1640Invitrogen11875093Nährmedium für HCT116-Zellen
Sylgard 184 Silikonelastomer KitDow Corning4019862Polydimethylsiloxan oder kurz PDMS
Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silanSigma Aldrich448931-10G
Triton X-100Sigma AldrichT9284Tensid
Trypsin EDTAThermofisher wissenschaftlicher15400054
UltraschallreinigerBransonicCPX2800
UV-KUB 2KLOEUV-LED-Lichtquelle, 365 nm Wellenlänge, 35 mW/cm2 Leistungsdichte UV-Maske
AlignerSÜSS Microtec Semiconductor (DE)MJB4

Referenzen

  1. Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  2. Takebe, T., Wells James, M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
  3. Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
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