Die Fähigkeit von Bakteriophagen, DNA zwischen Bakterienzellen zu bewegen, macht sie zu wirksamen Werkzeugen für die genetische Manipulation ihrer bakteriellen Wirte. Hier wird eine Methodik zur Induktion, Wiederherstellung und Verwendung von φBB-1, einem Bakteriophagen von Borrelia burgdorferi, vorgestellt, um heterologe DNA zwischen verschiedenen Stämmen der Lyme-Borreliose Spirochäte zu transduzieren.
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Methodenartikel
Phagenvermittelte genetische Manipulation der Borreliose Spirochete Borrelia burgdorferi
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Einbringen von Fremd-DNA in die Spirochäte Borrelia burgdorferi erfolgte fast ausschließlich durch Umwandlung mittels Elektroporation. Dieser Prozess hat deutlich geringere Wirkungsgrade in der Lyme-Borreliose-Spirochäte im Vergleich zu anderen, besser charakterisierten gramnegativen Bakterien. Die Erfolgsrate der Transformation hängt stark von konzentrierten Mengen hochwertiger DNA aus spezifischen Hintergründen ab und unterliegt einer signifikanten Variabilität von Stamm zu Stamm. Alternative Mittel zum Einbringen fremder DNA (d.h. Shuttle-Vektoren, fluoreszierende Reporter und Antibiotikaresistenzmarker) in B. burgdorferi könnten eine wichtige Ergänzung zum Arsenal nützlicher Werkzeuge für die genetische Manipulation der Lyme-Borreliose-Spirochäte sein. Bakteriophagen sind als natürliche Mechanismen für die Bewegung von DNA zwischen Bakterien in einem Prozess namens Transduktion anerkannt. In dieser Studie wurde eine Methode entwickelt, um den ubiquitären Borrelialphagen φBB-1 zu verwenden, um DNA zwischen B. burgdorferi-Zellen mit demselben und unterschiedlichem genetischen Hintergrund zu transduzieren. Die transduzierte DNA umfasst sowohl borreliale DNA als auch heterologe DNA in Form von kleinen Shuttle-Vektoren. Diese Demonstration legt eine mögliche Verwendung der Phagen-vermittelten Transduktion als Ergänzung zur Elektroporation für die genetische Manipulation der Lyme-Borreliose-Spirochäte nahe. Dieser Bericht beschreibt Methoden zur Induktion und Reinigung von Phage φBB-1 aus B. burgdorferi, die Verwendung dieses Phagens in Transduktionsassays und die Auswahl und das Screening potenzieller Transduktanten.
Einleitung
Die Entwicklung von Werkzeugen zur genetischen Manipulation des Spirochätenbakteriums Borrelia burgdorferi hat dem Verständnis der Natur der Borreliose 1,2,3,4 einen unermesslichen Mehrwert verliehen. B. burgdorferi hat ein ungewöhnlich komplexes Genom, das aus einem kleinen linearen Chromosom und sowohl linearen als auch zirkulären Plasmiden besteht 5,6. Spontaner Plasmidverlust, intragene Umlagerung (Bewegung von Genen von einem Plasmid zum anderen innerhalb desse....
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Protokoll
Alle Experimente mit rekombinanter DNA und BSL-2-Organismen wurden vom Quinnipiac University Institutional Biosafety Committee überprüft und genehmigt.
1. Aufbereitung der B. burgdorferi-Kultur zur Herstellung von φBB-1
- Barbour-Stoenner-Kelly-Medium mit 6,6% hitzeinaktiviertem normalem Kaninchenserum (BSK)15 zubereiten. Für 1 l 1x BSK die in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten in 900 ml Wasser mischen, den pH-Wert mit 1 N Natronlauge auf 7,6 einstellen und bei 4 °C 2-4 h langsam mischen. Nachdem das Mischen abgeschlossen ist, überprüfen und regulieren Sie den pH-Wer....
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Ergebnisse
Die Verwendung von Bakteriophagen zum Transport von DNA zwischen leichter transformierbaren B. burgdorferi-Stämmen oder Klonen, die der Elektrotransformation widerspenstig sind, stellt ein weiteres Werkzeug für die weitere molekulare Untersuchung der Determinanten der Lyme-Borreliose dar. Der hierin beschriebene Transduktionsassay kann nach Bedarf modifiziert werden, um die Bewegung von DNA zwischen beliebigen Klonen von Interesse zu erleichtern, wobei entweder ein oder zwei Antibiotika für die Auswahl potenziel.......
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Diskussion
Die Verwendung der Transduktion könnte eine Methode darstellen, um zumindest einige der biologischen und technischen Barrieren zu überwinden, die mit der Elektrotransformation von B. burgdorferi 1,4,13,37 verbunden sind. In vielen Systemen können Bakteriophagen Wirts-DNA (Nicht-Prophage) zwischen Bakterienzellen durch generalisierte oder spezialisierte Transduktion bewegen 22,23,24,49,.......
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Offenlegungen
Der Autor hat nichts offenzulegen.
Danksagungen
Der Autor dankt Shawna Reed, D. Scott Samuels und Patrick Secor für ihre nützliche Diskussion und Vareeon (Pam) Chonweerawong für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch das Department of Biomedical Sciences und Forschungsstipendien der Fakultät an Christian H. Eggers von der School of Health Sciences der Quinnipiac University unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 L Filtereinheiten (PES, 0,22 & Mikro; m Porengröße) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| 12 mm x 75 mm Röhrchen (Kappe mit zwei Positionen) (Polypropylen) | USA Scientific | 1450-0810 | fasst 4 mL mit geringem Hohlraumvolumen (für Induktion) |
| 15 mL konische Zentrifugenröhrchen (Polypropylen) | USA Scientific | 5618-8271 | |
| 1-Methyl-3-nitroso-nitroguanidin (MNNG) | Millipore Sigma | VORSICHT: potenziell krebserregend; nicht mehr ohne weiteres verfügbar, wurde nicht getestet, bot Ersatz | |
| 5,75" Pasteur-Pipetten an (mit Baumwollstecker/Borosilikatglas/unsteril) | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | Autoklav vor dem Gebrauch |
| 50 mL konische Zentrifugenröhrchen (Polypropylen) | USA Scientific | 1500-1211 | |
| Absolutes Ethanol | |||
| Agarose LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
| Bacto Neopepton | Gibco | DF0119-17-9 | |
| Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
| Rinderserumalbumin (Serumersatzqualität) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
| Chloroform (für die Molekularbiologie) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | ACHTUNG: flüchtig organisch; nur in einem chemischen Abzug verwenden |
| CMRL-1066 ohne L-Glutamin (Pulver) | US Biological | C5900-01 | Zellkulturqualität |
| Erythromycin | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
| Gentamicin Reagenzlösung | Gibco | 15750-060 | |
| Glukose (Dextrose wasserfrei) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 Kanamycinsulfat | |
| Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | ||
| Millex-GS (0,22 &μ; M Porengröße) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | zum Filtrieren von Antibiotika und anderen kleinvolumigen Lösungen |
| Mitomycin C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | ACHTUNG: potenziell krebserregend; nur in einem chemischen Abzug verwenden |
| N-Acetyl-D-Glucosamin | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
| Oligonukleotide (Primer für die PCR) | IDT DNA | ||
| OmniPrep (Total Genomic Extraction Kit) | G Biosciences | 786-136 | |
| Petrischale (100 mm & mal 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Petroff-Hausser Zählkammer | Hausser scientific | HS-3900 | |
| Petroff-Hausser Zählkammer Deckglas | Hausser scientific | HS-5051 | |
| Polyethylenglykol 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
| Kaninchenserum unsteril spurenhämolysiert jung (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | hitzeinaktiviert gemäß den Anweisungen des Herstellers |
| Semi-Mikro-UV-transparente Küvetten | USA Scientific | 9750-9150 | |
| Natriumbicarbonat | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Natriumchlorid | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Natriumpyruvat | Millipore Sigma | P8674-25G | |
| Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Streptomycinsulfatlösung | Millipore Sigma | S6501-50G | |
| Trinatriumcitrat-Dihydrat | Millipore Sigma | S1804-500G | Natriumcitrat für BSK |
Referenzen
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
- Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorf....
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Nachdrucke und Genehmigungen
