Quantifizierung der antimykotischen Aktivität von Peptiden gegen Candida albicans

Wright K. Makambi; Svetlana P. Ikonomova; Amy  J. Karlsson

doi:10.3791/64416

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Methodenartikel

Quantifizierung der antimykotischen Aktivität von Peptiden gegen Candida albicans

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DOI:

10.3791/64416

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13. Januar 2023

Wright K. Makambi¹ , Svetlana P. Ikonomova¹ , Amy J. Karlsson¹

¹Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung quantitativer Daten über die antimykotische Aktivität von Peptiden und anderen Verbindungen, wie z. B. niedermolekularen Antimykotika, gegen Candida albicans. Die Verwendung der optischen Dichte anstelle der Zählung koloniebildender Einheiten zur Quantifizierung der Wachstumshemmung spart Zeit und Ressourcen.

Zusammenfassung

Herkömmliche Methoden zur Durchführung von antimykotischen Empfindlichkeitstests für Candida albicans sind zeitaufwändig und es fehlen quantitative Ergebnisse. Ein gängiger Ansatz beruht beispielsweise darauf, Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen antimykotischer Moleküle behandelt wurden, auf Agarplatten zu plattieren und dann die Kolonien zu zählen, um die Beziehung zwischen Molekülkonzentration und Wachstumshemmung zu bestimmen. Diese Methode erfordert viele Platten und viel Zeit, um die Kolonien zu zählen. Ein anderer gängiger Ansatz eliminiert die Platten und das Zählen von Kolonien, indem mit Antimykotika behandelte Kulturen visuell inspiziert werden, um die Mindestkonzentration zu ermitteln, die zur Hemmung des Wachstums erforderlich ist. Die visuelle Inspektion liefert jedoch nur qualitative Ergebnisse, und Informationen über das Wachstum bei subinhibitorischen Konzentrationen gehen verloren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Messung der Empfindlichkeit von C. albicans gegenüber antimykotischen Peptiden. Durch die Verwendung optischer Dichtemessungen von Kulturen reduziert die Methode den Zeit- und Materialaufwand, der benötigt wird, um quantitative Ergebnisse zum Kulturwachstum bei verschiedenen Peptidkonzentrationen zu erhalten. Die Inkubation des Pilzes mit Peptiden wird in einer 96-Well-Platte unter Verwendung eines geeigneten Puffers durchgeführt, wobei die Kontrollen keine Wachstumshemmung und eine vollständige Wachstumshemmung darstellen. Nach der Inkubation mit dem Peptid werden die resultierenden Zellsuspensionen verdünnt, um die Peptidaktivität zu reduzieren, und dann über Nacht gezüchtet. Nach dem Wachstum über Nacht wird die optische Dichte jeder Vertiefung gemessen und mit den Positiv- und Negativkontrollen verglichen, um die resultierende Wachstumshemmung bei jeder Peptidkonzentration zu berechnen. Die Ergebnisse mit diesem Assay sind vergleichbar mit den Ergebnissen mit der traditionellen Methode der Beschichtung der Kulturen auf Agarplatten, aber dieses Protokoll reduziert den Plastikmüll und den Zeitaufwand für die Zählung der Kolonien. Obwohl sich die Anwendungen dieses Protokolls auf antimykotische Peptide konzentriert haben, wird die Methode auch auf die Untersuchung anderer Moleküle mit bekannter oder vermuteter antimykotischer Aktivität anwendbar sein.

Einleitung

Candida albicans ist ein Mitglied der menschlichen Mikrobiota, die zahlreiche Stellen besiedelt, darunter die Mundhöhle, die Haut, den Magen-Darm-Trakt und die Vagina¹. Bei Patienten, die aufgrund von Krankheiten wie dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) und immunsuppressiven Behandlungen immungeschwächt sind, kann die Besiedlung von C. albicans zu einer lokalen oder systemischen Candidose führen ^2,3. Die Verwendung von derzeit verfügbaren niedermolekularen antimykotischen Therapeutika wie Amphotericin B, Azolen oder Echinocandinen kann durch Löslichkeits- und Toxizitä....