Kultivierungsmethoden von Spirochäten aus Borrelia burgdorferi , Sensu Lato Complex und Rezidivfieber Borrelien

Borrelien sind eine Gattung von Spirochätenbakterien, die drei Hauptgruppen umfasst: die Gruppe der Lyme-Borreliose (LB), die Gruppe des Rückfallfiebers (RF) und eine weniger gut charakterisierte Gruppe, die anscheinend auf Reptilien beschränkt ist. Die Borrelien-Taxonomie ist mit dem Aufkommen molekularer Methoden, die Genom- und Proteomvergleiche ermöglichen, im Fluss, wie es bei den meisten anderen taxonomischen Gruppen der Fall ist 1,2,3,4,5,6,7. Die LB-Gruppe (auch Borreliose-Gruppe genannt) wird traditionell als Borrelia burgdorferi sensu lato bezeichnet, nach ihrem am besten charakterisierten Mitglied Borrelia burgdorferi sensu stricto. In diesem Artikel wird die derzeit am weitesten verbreitete Terminologie verwendet: die LB-, die RF- und die Reptilien-assoziierte Gruppe, und die Kulturprotokolle für die LB- und die RF-Gruppe beschrieben.

Wie für ein Mitglied der Familie Spirochaetaceae zu erwarten, können Borrelien die charakteristisch lange und dünne Spiralform annehmen, typischerweise 20-30 μm lang und 0,2-0,3 μm breit. Borrelienzellen sind jedoch hochgradig pleomorph und können aufgrund ihrer komplexen zellulären und genetischen Struktur sowohl in Kultur als auch in vivo viele andere Formen annehmen ^1,8. In seiner Spirochätalform resultiert die planare Sinuswellenmorphologie aus der Rotation der axialen Endoflagellen im periplasmatischen Raum zwischen der inneren und äußeren Membran. Diese Struktur ermöglicht es den Zellen, sehr beweglich zu sein, wobei die äußere Membran Proteine enthält, die es der Zelle ermöglichen, mit dem Wirtsgewebe zu interagieren ^9,10. Die Expression der Proteine der äußeren Membran ist streng reguliert und beeinflusst nicht nur die Invasion des Wirtsgewebes, sondern auch die Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts¹¹. Diese komplexe Genexpression ermöglicht es den Borrelienzellen, zwischen den sehr unterschiedlichen Umgebungen von Wirbeltierwirten und wirbellosen Vektoren zu pendeln. Das Genom von Borrelien ist bei Prokaryoten ungewöhnlich und besteht aus einem linearen und nicht aus einem zirkulären Chromosom. Neben dem linearen Chromosom enthalten Borrelien-Arten 7-21 Plasmide, einige linear und einige kreisförmig. Die Plasmide beherbergen die Mehrheit der Gene, die für die Anpassung und Virulenz des Wirts erforderlich sind, und es wird angenommen, dass die zirkulären Plasmide, die aus Prophagen stammen, für den Großteil des horizontalen Genflusses zwischen Spirochätalzellen verantwortlich^{sind 12,13}. In Übereinstimmung mit einer Rolle bei der Wirtsanpassung verlieren einige, möglicherweise viele oder alle Mitglieder der Lyme-Borreliose-Gruppe Plasmide in Kultur¹⁴. Der am besten untersuchte "laborangepasste" Stamm von B. burgdorferi, B31, weist nur sieben der neun Plasmide auf, die in Wildisolaten dieser Art gefunden wurden¹⁵. In ähnlicher Weise verliert B. garinii Plasmide in Kultur¹⁶. Einige Studien haben gezeigt, dass RF-Spezies und B. miyamotoi Plasmide behalten, wenn sie kultiviert werden ^14,17, aber neuere Arbeiten zeigen veränderte Plasmide und Infektiosität bei langfristiger In-vitro-Kultivierung ¹⁸.

Kulturbasierte Methoden sind nach wie vor der Goldstandard für den Labornachweis bakterieller Infektionen, sowohl für die Forschung als auch für die klinische Arbeit^14,17. Die Kultivierung von Krankheitserregern aus Körperflüssigkeiten oder Geweben detektiert direkt replizierende Krankheitserreger und liefert Ausgangsmaterial für die Forschung^14,17. Dieses Protokoll demonstriert die Methodik und die Rezepturen, die für die erfolgreiche Kultivierung der Spirochäten der LB-Gruppe sowie von RF-Borrelien und B. miyamotoi erforderlich sind. Das Basismedium für die Züchtung von Borrelia-Spirochäten ist das Barbour-Stoenner-Kelly-Medium (BSK-II oder das kommerziell erhältliche BSK-H), mit oder ohne Antibiotika, um das Wachstum kontaminierender Prokaryoten zu reduzieren. Dieses Medium wurde von einem Medium adaptiert, das ursprünglich zur Unterstützung von RF Borrelia¹⁹ verwendet wurde, und wurde von Stoenner²⁰ und dann von Barbour²¹ weiter modifiziert. Seitdem wurden viele Modifikationen entwickelt, von denen jede Auswirkungen auf die bakterielle Physiologie hat, die das Wachstum, die Infektiosität und die Pathogenität beeinflussen können²². Dieses Medium unterstützt zuverlässig das Wachstum von Spirochäten in etablierten Kulturen und wurde verwendet, um Spirochäten aus Zecken-, Säugetier- und klinischen Proben zu isolieren²³. Die neuere Variante, modifiziertes Kelly-Pettenkofer (MKP)-Medium, kann bei der Isolierung neuer Borrelienisolate aus Umweltproben einen besseren Isolationserfolg, eine bessere Morphologie und eine bessere Motilität bieten, wenn die Anzahl der in der Probe vorhandenen Spirochäten, die für die Aussaat der Kultur zur Verfügung stehen, gering ist^23,24. In allen Fällen hängt der Erfolg der Kultivierung entscheidend vom frisch zubereiteten Medium und der Verwendung geeigneter Zutaten ab. Nicht alle kommerziellen Inhaltsstoffe produzieren ein hochwertiges Medium. Beimpfte Kulturen können bequem und ohne Schütteln in einem herkömmlichen Inkubator bei 32-34 °C in Gegenwart einer geringen Menge an Restsauerstoff in der Umgebung inkubiert werden. Borrelien-Spirochäten sind anaerob Pflanzen, sind aber in der Natur Schwankungen der Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentration ausgesetzt und reagieren mit Veränderungen der Genexpression^26,27,28,29. Daher sollten Genexpressions-, Wachstums- und andere Stoffwechselstudien den Sauerstoff- und Kohlendioxidgehalt mit Hilfe eines sauerstoffkontrollierten Inkubators oder einer anaeroben Kammer kontrollieren. In Kultur werden Kulturen wöchentlich oder häufiger entweder mit Dunkelfeldmikroskopie oder Phasenkontrastmikroskopie auf das Vorhandensein von Spirochäten überprüft. Kulturausstriche können entweder mit Silberfärbungen, Immunhistochemie oder durch die Verwendung fluoreszenzmarkierter Stämme gefärbt werden^29,30. Die PCR mit anschließender DNA-Sequenzierung ist eine empfindliche und spezifische Methode zum Nachweis und zur genetischen Identifizierung bzw. Bestätigung der Borrelienspezies ^30,31,32,33.

Es gibt viele kleinere Variationen von BSK-II, und einige sind im Handel erhältlich. Das hier in Abschnitt 1 beschriebene Protokoll wurde von Barbour (1984)²¹ übernommen. Flüssiges MKP-Medium ist ein neueres Medium und wird in Abschnitt 2 beschrieben. Es wird gemäß einem zuvor berichteten Protokoll^33,34 hergestellt, das, ähnlich wie BSK-Medium^, aus zwei Schritten besteht: der Herstellung des Basismediums und der Herstellung des vollständigen Mediums. Borrelien-Nährmedium kann mit oder ohne Antibiotika hergestellt werden, wie in Abschnitt 3 beschrieben; das Antibiotikagesetz zur Verringerung kontaminierender Bakterien, die bei der Impfung mit klinischen Proben oder Umweltproben eingeführt werden, wie in Abschnitt 4 beschrieben; Bei der Inokulation mit reiner Borrelien-Sp.-Kultur sind möglicherweise keine Antibiotika erforderlich. Es ist oft wichtig, langfristige Borrelienvorräte anzulegen, und ein Protokoll dafür wird in Abschnitt 5 beschrieben. Abschnitt 6 beschreibt die Verwendung dieser Medien zur Isolierung reiner Borrelien-Sensu-Lato-Klone aus klinischen oder Umweltproben. Es gibt eine Reihe möglicher Ansätze³⁶; Im Folgenden finden Sie eine, die sich als wirksam erwiesen hat. Das in diesem Protokoll verwendete Beschichtungsmedium ist eine Modifikation des BSK-II-Beschichtungsmediums³⁷ und des MKP-Mediums³⁴ (wobei das Kaninchenserum auf 10 % erhöht ^wurde38).

Alle Studien mit Proben, die von menschlichen Probanden entnommen wurden, wurden vom Institutional Review Board der jeweiligen Universität und/oder medizinischen Einrichtung genehmigt, und die Teilnehmer wurden vor der Entnahme der Proben eine schriftliche Einverständniserklärung einholen. Alle Studien mit Tierproben wurden genehmigt und nach den Richtlinien der Institutionellen Tierethikkommission durchgeführt. Gegebenenfalls wurden Genehmigungen für Umweltprobenahmen eingeholt.

HINWEIS: Der Erfolg der Kultur hängt entscheidend von der Qualität der Zutaten ab. Kommerzielles BSK-Medium ist verfügbar und unterstützt robust das Wachstum von im Labor angepassten reinen B. burgdorferi und verwandten Arten, bei denen hochdosiertes Inokulum zur Aussaat der Kultur verwendet werden kann. Für Isolate von Stämmen aus primärem biologischem Material wird ein frisch präpariertes Medium bevorzugt und ist oft notwendig.

Borrelien sp. sind bekannte oder vermutete Krankheitserreger, und auch ungescreentes menschliches oder tierisches Gewebe kann eine biologische Gefahr darstellen. Der Umgang mit potenziell infektiösem Material erfordert persönliche Schutzausrüstung und sterile Technik für die Sicherheit der Ermittler. Außerdem ist das Medium so nährstoffreich, dass die Kultur leicht kontaminiert werden kann. Für diese Arbeiten ist in der Regel ein Containment der Biosicherheitsstufe 2 erforderlich, und alle Arbeiten mit Borrelia sp. oder Proben sollten in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.

1. Anleitung zur Herstellung des BSK-II-Mediums

1. Aufbereitung des kompletten BSK-II-Mediums
   1. Besorgen Sie sich Reagenzien zur Herstellung von 1 l des Mediums, wie in Tabelle 1 gezeigt.
      HINWEIS: Die Reinheit von BSA (oder mangelnde Reinheit) ist entscheidend für ein optimales Wachstum. Insbesondere die BSA-Reinheit unterscheidet sich zwischen Hersteller und Charge. In Tabelle 2 finden Sie eine Liste der erfolgreicheren und weniger erfolgreichen Produkte. Mehrere Muster von verschiedenen Anbietern zu erhalten, sie auf optimales Wachstum zu testen und dann eine große Menge der besten Charge zu kaufen, ist eine effektive Strategie, um dieses Problem zu entschärfen und ein gutes Medium zu produzieren.
   2. Beginnen Sie mit dem Auflösen des BSA in einem Becherglas durch Einrühren des Wassers, was mindestens eine halbe Stunde dauert.
   3. Fügen Sie alle trockenen Chemikalien hinzu und lassen Sie sie sich auflösen. Fügen Sie dann die CMRL hinzu.
   4. Stellen Sie den pH-Wert des BSK-II-Mediums bei Bedarf mit 1 M NaOH auf 7,6 ein.
   5. Fügen Sie dem BSK-II-Medium Kaninchenserum in einer Konzentration von 6%-10% hinzu. Sterilisieren Sie das BSK-II-Medium (0,22 μm Porengröße). Die benötigte Serummenge hängt von der Borrelienart ab. Verwenden Sie 6%-7% für die RF-Arten und -Stämme und für Borrelia burgdorferi sensu lato. Wenn das Wachstum nicht stark ist, fügen Sie dem Medium ein weiteres steriles Kaninchenserum von 1%-2% hinzu.
   6. Frieren Sie den Vorrat des BSK-II-Mediums in 100 ml oder 400 ml Aliquots ein.
   7. Für HF-Stämme wird Gelatine benötigt. Fügen Sie 100 ml 7%ige sterile Gelatine (leicht erwärmt, um sie in eine Lösung zu geben) zu 400 ml BSK-II-Medium hinzu. Erwärmen Sie den BSK-II mit Gelatine bei 37 °C, damit die Gelatine schmilzt, bevor Sie die Kultur beimpfen.
      Anmerkungen: Das Medium kann vor der Filtersterilisation und der Zugabe von Kaninchenserum und Gelatine (für RF-Spirochäten) oder nach der Filtersterilisation und der Zugabe von Serum (und Gelatine) eingefroren werden (-20 °C). Das Medium ist stabil, wenn es lange gefroren ist. Wenn Sie es im Kühlschrank aufbewahren, verwenden Sie das Medium innerhalb von 1 Monat. RF-Arten wachsen am besten mit frischem Medium, das normalerweise nicht älter als 1 Woche ist. Wenn es nicht gefroren ist, überprüfen Sie die Qualität des Mediums visuell auf Trübung. Entsorgen Sie das Medium, das verunreinigt zu sein scheint, Inhaltsstoffe ausfällt oder anderweitig zweifelhaft ist.
   8. Wenn dem Medium Antibiotika zugesetzt werden sollen, fügen Sie sie frisch hergestelltem Medium oder zuvor gefrorenen Aliquots hinzu. Letzteres ist der flexiblere Ansatz. Verwenden Sie Antibiotikakonzentrationen, wie von Oliver et ^al.39 beschrieben.
   9. Während Sie ein Röhrchen des Mediums auftauen, wiegen Sie die Antibiotika mit einer Präzisionswaage in sterile (autoklavierte) 1,7-ml-Röhrchen oder sterile konische 15-ml-Röhrchen ein. Bereiten Sie die Stammlösungen wie folgt vor: Lösen Sie 25 mg Amphotericin B in 10 ml DMSO, 20 mg Phosphomycin in 1 ml autoklaviertem destilliertem Wasser und 50 mg Rifampicin in 1 ml DMSO auf.
   10. Sterilisieren Sie die Antibiotika (0,2 μm Spritzenvorsatzfilter) und füllen Sie sie in ein neues Röhrchen geeigneter Größe.
   11. Verdünnen Sie die Antibiotika im Verhältnis 1:1000 des Mediums, um ihre Endkonzentration zu erreichen. Für 500 ml BSK werden 0,5 ml Amphotericin-B-Stammlösung (2,5 mg/ml in DMSO), 0,5 ml Phosphomycin-Stammlösung (20 mg/ml in sterilem_H2O) und 0,5 ml Rifampicin-Stammlösung (US: Rifampin) (50 mg/ml in DMSO) hinzugefügt.
   12. Verwenden Sie das mit Antibiotika versetzte Medium oder aliquot und frieren Sie es bei -20 °C ein.

Tabelle 1: Zusammensetzung von 1 l BSK-II-Medium.

Tabelle 2: BSA-Quellen und Eignung für BSK-II-Medium.

2. Anleitung zur Herstellung von MKP

1. Aufbereitung des Grundmediums
   1. Alle pulverförmigen Komponenten, wie unten in Tabelle 3 aufgeführt, sorgfältig abgewogen und in 3 /4 des Endvolumens von_ddH2O(ca. 750 ml) unter Rühren bis zum vollständigen Auflösen auflösen, was ~1 h dauert.
   2. Nach vollständigem Auflösen wird der pH-Wert mit NaOH auf 7,6 und das Volumen auf 1000 ml eingestellt und anschließend durch Filtration (0,22 μm Filter) sterilisiert.
      HINWEIS: Das Basismedium kann bis zu 3 Monate bei -20 °C gelagert werden.
2. Aufbereitung von MKP-Komplettmedium
   1. Mischen Sie alle in Tabelle 4 aufgeführten Komponenten steril. Sterilisieren Sie die Gelatine durch Autoklavieren und handhaben Sie sie steril. Arbeiten Sie in einer sterilen biologischen Sicherheitswerkbank und verwenden Sie ein steriles, gefiltertes Serum.
   2. Aliquot MKP in 50-ml-Röhrchen. Geben Sie ein kleines Aliquot für mehrere Tage bei 33 °C und prüfen Sie dann unter einem Dunkelfeldmikroskop, ob keine Kontamination vorliegt.
      Anmerkungen: Bewahren Sie MKP complete medium bei +4 °C nicht länger als 1 Monat auf und frieren Sie es nicht ein. Das komplette Medium kann zusätzlich durch Filtration mit einem 0,22 μm Filter sterilisiert werden.

Tabelle 3: Zusammensetzung von 1 l basischem MKP-Medium (modifiziertes Kelly-Pettenkofer-Medium).

Tabelle 4: Zusammensetzung des MKP-Komplettmediums (modifizierter Kelly-Pettenkofer).

3. Kultur von Borrelien, mit oder ohne Antibiotika

1. Führen Sie alle Versuchsschritte unter sterilen Arbeitsbedingungen in einer biologischen Sicherheitswerkbank durch. Desinfizieren Sie die Oberfläche und alle Materialien mit 70%igem Ethanol und übergeben Sie sie sofort in die biologische Sicherheitswerkbank. UV-sterilisieren Sie alle nicht-biologischen Materialien in der biologischen Sicherheitswerkbank für 5 min vor Beginn der Arbeiten.
2. Verwenden Sie ein möglichst frisches Medium.
3. Um eine Kultur zu starten, wird das Medium in einem Inkubator vorgewärmt (33 °C - 37 °C). Bei Bedarf schütteln.
   HINWEIS: Je nach Volumen des Mediums kann dieser Schritt mehrere Stunden dauern.
4. Fügen Sie ~1 ml aufgetaute Borrelienkultur aus einem Glycerin oder einem ähnlichen Vorrat, die zuvor bei -80 °C gelagert und bei Raumtemperatur (RT) aufgetaut wurde, sobald sie flüssig ist, zu 5-15 ml vorgewärmtem BSK-Medium hinzu. Beimpfen Sie die Kultur in ein kleines Volumen (5-15 ml BSK) mit handelsüblichen Glas- oder Kunststofffläschchen mit Schraubverschluss. Füllen Sie die Röhrchen fast voll, um eine mikro- oder anaerobe Atmosphäre zu schaffen. Verschließen Sie die Röhrchen fest; Wenn es auf diese Weise kultiviert wird, wird CO₂ nicht benötigt.
5. Kultivieren Sie RF-Arten (und B. persica) bei 37 °C in einem Inkubator ohne Rühren oder Rühren. Kultivieren Sie B. burgdorferi sensu lato Arten bei 33-34 °C.
6. Überwachen Sie das Wachstum der Borrelienkultur mit Hilfe von Phasenkontrast- oder Dunkelfeldmikroskopie bei 200- bis 400-facher Vergrößerung (Abbildung 3). Um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, mischen Sie die Kultur mit einer serologischen Pipette oder für mehr Durchmischung mit einer 3-ml-Transferpipette, während Sie auf und ab pipettieren.
   HINWEIS: Borrelien sind bei höherer Vergrößerung (200X-400X) am besten sichtbar, lassen sich aber am besten bei 200-facher Vergrößerung auf einem Hämozytometer⁴⁰ zählen. Die Bewegung und Morphologie der Borrelien weisen auf das Vorhandensein dieser Bakterien hin.
7. Um das Bakterienwachstum zu quantifizieren, zählen Sie mehrere (10) einzelne kleine Quadrate im sechzehnfeldrigen Gittermuster der Zählfläche auf beiden Seiten des Hämozytometers und des Durchschnitts. Multiplizieren Sie die durchschnittliche Zellzahl pro kleinem Quadrat mit dem Umrechnungsfaktor, der für das Hämozytometer geeignet ist, das zur Bestimmung der Zellzahl pro ml verwendet wird.
8. Überwachen Sie das Bakterienwachstum in Intervallen von 1-2 Tagen. Das exponentielle Wachstum von Borrelien ist abhängig von der Lebensfähigkeit und Zelldichte und kann bei 34 °C 1 Woche oder länger dauern. Verdünnen Sie die exponentiellen Phasenkulturen im Verhältnis 1:2 oder 1:4 mit dem Medium in einem 1,7-ml-Röhrchen, bevor Sie sie auf das Hämozytometer laden. Berücksichtigen Sie den Verdünnungsfaktor bei der Bestimmung der Zellzahl. Besprühen Sie nach Gebrauch die Oberflächen und das Hämozytometer mit verdünntem Bleichmittel (10 %) und/oder 70 % Ethanol.
   HINWEIS: Borrelien befinden sich in exponentiellem Wachstum, wenn die Zellkonzentrationen 1-5 x 10^{7 Zellen/} ml betragen. Innerhalb dieses Bereichs wachsen die Zellen gut.
9. Eine ausgedehnte Kultur verbraucht Nährstoffe und verändert den pH-Wert des Mediums, so dass eine Subkultivierung erforderlich ist. Unter sterilen Bedingungen in einer biologischen Sicherheitswerkbank 1/10 des Kulturvolumens in ein neues Röhrchen überführen und mit dem neuen Medium füllen (ein frisches Aliquot desselben Mediums, das für die Aufzucht der vorherigen Passage verwendet wurde). Eine Verdünnung von 1:10 ist optimal. Wenn das Kulturvolumen geändert werden soll, passen Sie die Inokulummenge entsprechend an und setzen Sie die Inkubation fort. Die Anzahl der Passagen nimmt mit jedem Medienwechsel zu.
10. Für die Extraktion von DNA oder die Isolierung von Borrelienzellen zentrifugieren Sie die Exponentialphase Borrelien für 10 min bei 4000 x g, um die Bakterien zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand in geeigneten biologisch gefährlichen Abfällen. Verarbeiten Sie die pelletierten Bakterien mit einem handelsüblichen DNA-Extraktionskit oder resuspendieren Sie die Bakterien in einem geeigneten Medium für das beabsichtigte Experiment.
11. Sterilisieren Sie am Ende jeder Manipulation alle Geräte mit Ethanol und UV-Strahlung, je nach Bedarf. Sammeln Sie die flüssigen Abfälle, einschließlich der überschüssigen Kultur, in einer Abfallflasche und fügen Sie Bleichmittel bis zu einer Endkonzentration von 10 % hinzu. Stellen Sie diese Flasche auf -80 °C, bevor Sie sie entsorgen. Alternativ können Sie die flüssigen Abfälle sterilisieren und ohne Bleichmittel oder Alkohol durch Autoklavieren kultivieren.

4. Langzeitlagerung von Borrelienkulturen

1. Aufbereitung des Glycerinvorrats der Borrelienkultur
   1. Man nehme ~1,8 ml Aliquots exponentieller Phasenkulturen, Zellkonzentrationen ~10^{7-10 8} Zellen/ml, und füge steriles Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 10 % hinzu (Konzentrationen von 5 %-20 % Arbeit).
   2. In kryogene Durchstechflaschen mit 2 ml Schraubverschluss geben. Bei -80 °C lagern.
   3. Halten Sie einen Vorrat mit mindestens 10 Tuben jeder Sorte im Gefrierschrank bereit.
2. Ein alternatives Lagerrezept zur Herstellung eines Glycerinvorrats für die dauerhafte Lagerung
   1. Mischen Sie 2/3 der Borrelienkultur mit 1/3 von 15% Glycerin in Brucella-Brühe . Verwenden Sie 2,8 g Brucella-Bouillon gelöst in 100 ml_ddH2O, das steril filtriert wurde (0,22 μm).
   2. Halten Sie den Glycerinvorrat der Proben bei -70 °C bis -80 °C.

5. Isolierung von Spirochäten aus umweltbedingten oder klinischen Quellen

HINWEIS: Wenn Material aus menschlichen, tierischen oder ökologischen Quellen isoliert wird, müssen gegebenenfalls Forschungsethik, Tierpflege oder ökologische Zertifizierungen eingeholt werden.

1. Kultivierung von Borrelien aus harten Zecken
   1. Sammle erwachsene Weibchen, Männchen und/oder Nymphenzecken.
   2. Sterilisieren Sie alle Zeckenproben an der Oberfläche, indem Sie sie 2 Minuten lang in 70%iges Ethanol tauchen und in einer biologischen Sicherheitswerkbank an der Luft trocknen. Mit einem sterilen Skalpell einzeln in mehrere Stücke zerlegen. Geben Sie die Stücke in ein 2-ml-Röhrchen mit 1,5 ml Medium, das mit Antibiotika ergänzt wird.
   3. Inkubieren Sie die Kulturen bei 34 °C und überprüfen Sie die ersten 2 Wochen zweimal wöchentlich für die ersten 2 Wochen und wöchentlich für 6 Wochen durch Dunkelfeld- oder Phasenkontrastmikroskopie auf Spirochäten. Subkulturkultur-positive Proben in 5 ml desselben Mediums.
      HINWEIS: Kontaminierte Kulturen können bis zu einem gewissen Grad durch Filtration mit einem 0,2-μm-Filter gereinigt werden. Möglicherweise sind Antibiotika erforderlich, um die Kontamination vollständig aufzulösen.
2. Kultivierung von Borrelien aus Blutproben
   HINWEIS: Die Blutprobe sollte je nach Quelle des Materials von einem qualifizierten Arzt, Tierarzt oder Forscher entnommen werden. Zwischen der Probe sollten weniger als 24 Stunden bei RT vergehen
   Entnahme und Ankunft im Labor.
   1. Entnahme von 10 ml Blut, gesammelt in Blutentnahmeröhrchen aus Glas mit saurer Citrat-Dextrose (ACD; "gelbe Spitze") als Gerinnungshemmung. Bei Raumtemperatur stehen lassen. Es wird empfohlen, dass zwischen Blutentnahme und Impfung weniger als 24 Stunden vergehen.
   2. Zentrifugieren Sie das Blut mit einem Gerinnungshemmer für 10 Minuten bei 200-400 x g , um das Plasma von den Blutzellen zu trennen.
   3. Entfernen Sie das Plasma vorsichtig aus dem Röhrchen und beimpfen Sie 1 ml Plasma in 5 ml vorgewärmtes MKP-Komplettmedium. MKP kann mit Antibiotika ergänzt werden. Inkubieren Sie Kulturen bei 33 °C mit täglicher visueller Inspektion und wöchentlicher Dunkelfeld- oder Phasenkontrastmikroskopie, bis ein Borrelienwachstum festgestellt wird (häufiger bei RF-Borrelien), was bis zu 9 Wochen dauern kann.
      Anmerkungen: Wenn Sie größere oder kleinere Impfvolumina verwenden, halten Sie das Verhältnis von Impfmittel zu Medium von 1:5 bei. Verwenden Sie Seren oder Plasma anstelle von Vollblut.
3. Kultivierung von Borrelien aus Hautbiopsie
   1. Oberflächensterilisation der Hautbiopsie (idealerweise ein 3 mm x 3 mm x 3 mm großer Würfel; d. h. mit 70 % Ethanol und Wasserstoffperoxid). Die Biopsieprobe wird in physiologische Kochsalzlösung gelegt.
      HINWEIS: Eine Biopsieprobe sollte je nach Quelle des Materials von einem qualifizierten Arzt, Tierarzt oder Forscher entnommen werden. Zwischen der Probenentnahme und dem Eintreffen im Labor sollten weniger als 24 Stunden bei der RT vergehen.
   2. Würfeln Sie die Probe mit einer sterilen Rasierklinge in einer sterilen Glas-Petrischale in zwei bis sechs kleinere Stücke, während Sie sie in die physiologische Kochsalzlösung eintauchen. Alle Proben und ~1 ml der physiologischen Kochsalzlösung, in der die Hautbiopsie gelagert wurde, werden in 5 ml vorgewärmtes Medium überführt, das mit Antibiotika angereichert ist, und bei 33 °C inkubiert.
   3. Bei übermäßigem Wachstum kontaminierender Bakterien sind Antibiotika wie in Schritt 1.1.10 oben beschrieben oder durch Zugabe von zwei Tabletten Sulfamethoxazol (23,75 mg; Endkonzentration 5 mg/ml) + Trimethoprim (1,25 mg; 0,25 mg/ml) oder Bactrim (minimale Hemmkonzentration >128 μg/ml), zwei Tabletten Amikacin (2 x 30 μg; Endkonzentration 12 μg/ml) zuzugeben. und zwei Tabletten Phosfomycin (2 x 200 μg; Endkonzentration 80 μg/ml).
      HINWEIS: Achten Sie in jedem Fall darauf, dass die minimale Hemmkonzentration dieses Antibiotikums für die Borrelienarten, für die eine Kultur versucht wird, unterschritten wird^41,42,43.
   4. Wenn die Kultur positiv für Borrelien ist, bewahren Sie die Kultur für weitere 3-4 Tage auf oder bis die Menge an Borrelien 10+ Spirochäten in einem Mikroskopfeld mit einem 40-fachen Objektiv erreicht. Erstellen Sie einen Glycerinvorrat für die dauerhafte Lagerung.

6. Isolierung monoklonaler Populationen von B. burgdorferi sensu lato Spirochäten und B. miyamotoi aus Flüssigkulturen durch Kultivierung auf festen Medien

1. Für die Herstellung von Platten erwärmen Sie 300 ml 1,5-faches MKP-Komplettmedium (ohne Gelatine). Erwärmen Sie außerdem 200 ml 1,7%ige Agarose (autoklaviert in deionisiertem Wasser, gelagert bei RT und vor Gebrauch in der Mikrowelle) auf 55 °C. Mischen Sie beide Flüssigkeiten.
2. Pipettieren Sie 15 ml dieser Mischung in jede der 16 tiefen Petrischale, um die untere Agar-Oseschicht herzustellen.
3. Den Rest des Mediums bei 55 °C im Wasserbad zurückhalten.
   HINWEIS: Die Borrelien werden in die oberste Agaroseschicht eingemischt.
4. Quantifizieren Sie zunächst die Dichte der Borrelienkulturen mit einem Hämozytometer und verdünnen Sie sie in einem flüssigen Medium auf die gewünschte Dichte.
   HINWEIS: 500, 200, 100 und 50 Spirochäten pro Platte funktionieren gut.
5. Nachdem die Bodenplatten fest geworden sind, geben Sie 10 ml der restlichen Agarosemischung in ein 15-ml-Röhrchen, das die entsprechende Anzahl von Spirochäten enthält.
6. Gießen Sie die Suspension auf die untere Agarose in der beschrifteten Petrischale.
   HINWEIS: Da Borrelien-Spirochäten empfindlich auf hohe Temperaturen reagieren, sollte darauf geachtet werden, dass die Bakterien nicht über einen längeren Zeitraum 55 °C ausgesetzt werden. Gießen Sie den oberen Agar sofort nach der Zugabe zu den Bakterienzellen im Medium.
7. Nachdem die Platten vollständig erstarrt sind, verschließen Sie die Petrischalen und stellen Sie sie kopfüber bei 34-35 °C in 2,5% CO₂ auf.
   Anmerkungen: Die Kolonien erscheinen 1 Woche nach dem Ausplattieren, wenn das Verfahren erfolgreich ist.
8. Um die einzelnen Kolonien zu screenen und zu expandieren, wählen Sie einzelne Kolonien aus den Platten aus und geben Sie sie in 1,5 ml modifiziertes flüssiges MKP oder ein anderes geeignetes Medium in sterile 2-ml-Kulturröhrchen.
9. Die Kulturen werden bei 34 °C inkubiert und mittels Dunkelfeld- oder Phasenmikroskopie auf Spirochäten untersucht. Verwenden Sie diese Kulturen für Analysen oder Bestände, die wie oben beschrieben erstellt wurden.

Borrelien-Nährmedien BSK und MKP sowie Varianten sind reichhaltige Nährmedien mit Inhaltsstoffen, die nacheinander vorbereitet und sterilisiert werden müssen. Bei korrekter Zubereitung sollte BSK-Medium rot-orange und klar sein (Abbildung 1). Trübungen und Niederschläge, die nach der Erwärmung bestehen bleiben, deuten auf problematische Inhaltsstoffe, Mediumproduktion oder Kontamination hin. Ein solches Medium wird am besten verworfen. Wenn Gelatine zu BSK und mit MKP hinzugefügt wird, ist das Medium im gekühlten Zustand gallertartig; Beim Erwärmen ist es flüssig, wenn auch leicht viskos.

Das Wachstum von reinen Borrelienkulturen ändert nichts an der Trübung des Mediums. Das Wachstum von Bakterienkulturen, Borrelien sowie Verunreinigungen ändert jedoch aufgrund des pH-Indikators die Farbe des Mediums. Eine Überwucherung durch andere Bakterien führt zu Trübung und verklumpten Materialien (Abbildung 2).

Das Kulturwachstum kann durch Phasenkontrast- oder Dunkelfeldmikroskopie beobachtet werden (Abbildung 3 und Abbildung 4). Borrelienzellen in der exponentiellen Phase sind typischerweise schlank und geknickt und bis zu einem gewissen Grad beweglich. Wenn die Kulturen in die stationäre Phase übergehen, werden immer mehr runde Körper sichtbar (Abbildung 5). Klinische oder umweltbedingte Isolate enthalten häufig mehrere Borrelienstämme und/oder -arten. Um reine Klone zu isolieren, können Flüssigkulturen plattiert werden, um monoklonale Kolonien zu isolieren (Abbildung 6); Manchmal können mehrere Runden der Kolonieisolierung erforderlich sein.

Abbildung 1: BSK- und MKP-Medium . (A) BSK (mit Antibiotika) mit einer Reinkultur von Borrelia burgdorferi. Mit oder ohne B. burgdorferi bleibt das Medium ohne sichtbare Trübung und ist orange-bernsteinfarben (Farbe variiert leicht je nach Inhaltsstoffen). (B) MKP medium, ungeimpft, auftauend. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Kontaminiertes BSK- und MKP-Medium mit übermäßigem Wachstum konkurrierender Bakterien. Das Medium ist verfärbt, trübe und mit der Zeit sterben konkurrierende Bakterien ab und fallen auf den Boden des Röhrchens aus. (A) Überwucherte BSK-Röhre. (B) Altes BSK-Röhrchen mit ausgefällten kontaminierenden Bakterien. (C) MKP-Röhrchen mit (links) und ohne (Mittel-)Kultur und kontaminierter Kultur (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Verwendung eines Hämozytometers zur Überwachung des Borrelienwachstums . Borrelia burgdorferi Stamm B31 (eine durch Pfeile gekennzeichnete Untergruppe) auf einem Hämozytometer (eine Linie des kleinen Gitters ist durch die Pfeilspitze gekennzeichnet) unter 200-fachem Phasenkontrast. Diese Vergrößerung und dieser Prozess ermöglichen die Überwachung von Kulturen und die Abschätzung der Zelldichte. Die Maßstabsleiste beträgt 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Dunkelfeldaufnahme von Borrelia burgdorferi. Dunkelfeldaufnahme des Borrelia burgdorferi-Stammes SCW-53 bei hoher Dichte in exponentieller Phase nach 5-7 Tagen Kultivierung in MKP-Medium (400-fache Vergrößerung). Die Maßstabsleiste beträgt 20 μm. Dieser Stamm wurde aus der harten Zecke Ixodes affinis isoliert, die in South Carolina, USA, gesammelt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Borrelien in alten Kulturen. Da Borrelienzellen in alten Kulturen in die stationäre Phase übergehen, werden zunehmend runde Körperformen als Ersatz für die Spirochätalform angesehen. Dabei kann es sich um ruhende Formen oder abgestorbene Zellen handeln. Linke Tafel, Dieterle-Beize; Mittelfeld, immunhistochemische Färbung; und rechtes Bild, fluoreszierende In-situ-Hybridisierung einer Borrelienkultur (aufgrund ihrer Herkunft vermutlich B. burgdorferi , aber die Art und der Stamm wurden molekular nicht identifiziert), die mit Hundeurin inokuliert wurde. Die Erfassung der Daten in Abbildung 5 wurde vom Tierpflegeausschuss der Mrt. Allison University mit der Zulassungsnummer 16-1 genehmigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Borrelia burgdorferi sensu lato komplexe Spirochäten. Kolonien von Borrelia burgdorferi sensu lato komplexen Spirochäten, die auf festem Medium gezüchtet wurden, um reine klonale Populationen zu isolieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Interessenkonflikte wurden nicht erklärt.