Method Article

Kultivierungsmethoden von Spirochäten aus Borrelia burgdorferi , Sensu Lato Complex und Rezidivfieber Borrelien

DOI:

10.3791/64431

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November 25th, 2022

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1Department of Biology, Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology, Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences, Institute of Parasitology

In This Article

Summary

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Die In-vitro-Kultur ist eine direkte Nachweismethode für das Vorhandensein lebender Bakterien. Dieses Protokoll beschreibt Methoden für die Kultivierung verschiedener Borrelien-Spirochäten, einschließlich der Borrelia burgdorferi sensu lato-Komplexes, der Rezidivfieber-Borrelienarten und der Borrelia miyamotoi. Diese Arten sind anspruchsvoll und wachsen langsam, können aber kultiviert werden.

Abstract

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Die Borrelien bestehen aus drei Artengruppen, der Lyme-Borreliose-Gruppe (LB), die auch als B. burgdorferi sensu lato (s.l.) bekannt ist und kürzlich in Borreliella, die Rückfallfiebergruppe (RF) Borrelien und eine dritte reptilienassoziierte Gruppe von Spirochäten umklassifiziert wurde. Kulturbasierte Methoden sind nach wie vor der Goldstandard für den Labornachweis bakterieller Infektionen sowohl für die Forschung als auch für die klinische Arbeit, da die Kultivierung von Krankheitserregern aus Körperflüssigkeiten oder Geweben replizierende Krankheitserreger direkt detektiert und Ausgangsmaterial für die Forschung liefert. Borrelien und Borreliella-Spirochäten sind anspruchsvoll und langsam wachsend und werden daher üblicherweise nicht für klinische Zwecke kultiviert. Für die Forschung ist jedoch Kultur notwendig. Dieses Protokoll demonstriert die Methodik und die Rezepturen, die für die erfolgreiche Kultivierung von LB- und RF-Spirochäten erforderlich sind, einschließlich aller anerkannten Arten aus dem B. burgdorferi s.l.-Komplex, einschließlich B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis undRF-Spirochäten, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis und B. miyamotoi. Das Basismedium für die Zucht von LB- und RF-Spirochäten ist das Barbour-Stoenner-Kelly-Medium (BSK-II oder BSK-H), das das Wachstum von Spirochäten in etablierten Kulturen zuverlässig unterstützt. Um neu isolierte Borrelienisolate aus Zecken- oder Wirtsproben züchten zu können, bei denen die anfängliche Spirochätenzahl im Inokulum niedrig ist, wird modifiziertes Kelly-Pettenkofer (MKP)-Medium bevorzugt. Dieses Medium unterstützt auch das Wachstum von B. miyamotoi. Der Erfolg der Kultivierung von RF-Spirochäten hängt auch entscheidend von der Qualität der Inhaltsstoffe ab.

Introduction

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Borrelien sind eine Gattung von Spirochätenbakterien, die drei Hauptgruppen umfasst: die Gruppe der Lyme-Borreliose (LB), die Gruppe des Rückfallfiebers (RF) und eine weniger gut charakterisierte Gruppe, die anscheinend auf Reptilien beschränkt ist. Die Borrelien-Taxonomie ist mit dem Aufkommen molekularer Methoden, die Genom- und Proteomvergleiche ermöglichen, im Fluss, wie es bei den meisten anderen taxonomischen Gruppen der Fall ist 1,2,3,4,5,6,7. Die LB-Gruppe (auch Borreliose-Gruppe genannt) wird traditionell als Borrelia burgdorferi sensu lato bezeichnet, nach ihrem am besten charakterisierten Mitglied Borrelia burgdorferi sensu stricto. In diesem Artikel wird die derzeit am weitesten verbreitete Terminologie verwendet: die LB-, die RF- und die Reptilien-assoziierte Gruppe, und die Kulturprotokolle für die LB- und die RF-Gruppe beschrieben.

Wie für ein Mitglied der Familie Spirochaetaceae zu erwarten, können Borrelien die charakteristisch lange und dünne Spiralform annehmen, typischerweise 20-30 μm lang und 0,2-0,3 μm breit. Borrelienzellen sind jedoch hochgradig pleomorph und können aufgrund ihrer komplexen zellulären und genetischen Struktur sowohl in Kultur als auch in vivo viele andere Formen annehmen 1,8. In seiner Spirochätalform resultiert die planare Sinuswellenmorphologie aus der Rotation der axialen Endoflagellen im periplasmatischen Raum zwischen der inneren und äußeren Membran. Diese Struktur ermöglicht es den Zellen, sehr beweglich zu sein, wobei die äußere Membran Proteine enthält, die es der Zelle ermöglichen, mit dem Wirtsgewebe zu interagieren 9,10. Die Expression der Proteine der äußeren Membran ist streng reguliert und beeinflusst nicht nur die Invasion des Wirtsgewebes, sondern auch die Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts11. Diese komplexe Genexpression ermöglicht es den Borrelienzellen, zwischen den sehr unterschiedlichen Umgebungen von Wirbeltierwirten und wirbellosen Vektoren zu pendeln. Das Genom von Borrelien ist bei Prokaryoten ungewöhnlich und besteht aus einem linearen und nicht aus einem zirkulären Chromosom. Neben dem linearen Chromosom enthalten Borrelien-Arten 7-21 Plasmide, einige linear und einige kreisförmig. Die Plasmide beherbergen die Mehrheit der Gene, die für die Anpassung und Virulenz des Wirts erforderlich sind, und es wird angenommen, dass die zirkulären Plasmide, die aus Prophagen stammen, für den Großteil des horizontalen Genflusses zwischen Spirochätalzellen verantwortlichsind 12,13. In Übereinstimmung mit einer Rolle bei der Wirtsanpassung verlieren einige, möglicherweise viele oder alle Mitglieder der Lyme-Borreliose-Gruppe Plasmide in Kultur14. Der am besten untersuchte "laborangepasste" Stamm von B. burgdorferi, B31, weist nur sieben der neun Plasmide auf, die in Wildisolaten dieser Art gefunden wurden15. In ähnlicher Weise verliert B. garinii Plasmide in Kultur16. Einige Studien haben gezeigt, dass RF-Spezies und B. miyamotoi Plasmide behalten, wenn sie kultiviert werden 14,17, aber neuere Arbeiten zeigen veränderte Plasmide und Infektiosität bei langfristiger In-vitro-Kultivierung 18.

Kulturbasierte Methoden sind nach wie vor der Goldstandard für den Labornachweis bakterieller Infektionen, sowohl für die Forschung als auch für die klinische Arbeit14,17. Die Kultivierung von Krankheitserregern aus Körperflüssigkeiten oder Geweben detektiert direkt replizierende Krankheitserreger und liefert Ausgangsmaterial für die Forschung14,17. Dieses Protokoll demonstriert die Methodik und die Rezepturen, die für die erfolgreiche Kultivierung der Spirochäten der LB-Gruppe sowie von RF-Borrelien und B. miyamotoi erforderlich sind. Das Basismedium für die Züchtung von Borrelia-Spirochäten ist das Barbour-Stoenner-Kelly-Medium (BSK-II oder das kommerziell erhältliche BSK-H), mit oder ohne Antibiotika, um das Wachstum kontaminierender Prokaryoten zu reduzieren. Dieses Medium wurde von einem Medium adaptiert, das ursprünglich zur Unterstützung von RF Borrelia19 verwendet wurde, und wurde von Stoenner20 und dann von Barbour21 weiter modifiziert. Seitdem wurden viele Modifikationen entwickelt, von denen jede Auswirkungen auf die bakterielle Physiologie hat, die das Wachstum, die Infektiosität und die Pathogenität beeinflussen können22. Dieses Medium unterstützt zuverlässig das Wachstum von Spirochäten in etablierten Kulturen und wurde verwendet, um Spirochäten aus Zecken-, Säugetier- und klinischen Proben zu isolieren23. Die neuere Variante, modifiziertes Kelly-Pettenkofer (MKP)-Medium, kann bei der Isolierung neuer Borrelienisolate aus Umweltproben einen besseren Isolationserfolg, eine bessere Morphologie und eine bessere Motilität bieten, wenn die Anzahl der in der Probe vorhandenen Spirochäten, die für die Aussaat der Kultur zur Verfügung stehen, gering ist23,24. In allen Fällen hängt der Erfolg der Kultivierung entscheidend vom frisch zubereiteten Medium und der Verwendung geeigneter Zutaten ab. Nicht alle kommerziellen Inhaltsstoffe produzieren ein hochwertiges Medium. Beimpfte Kulturen können bequem und ohne Schütteln in einem herkömmlichen Inkubator bei 32-34 °C in Gegenwart einer geringen Menge an Restsauerstoff in der Umgebung inkubiert werden. Borrelien-Spirochäten sind anaerob Pflanzen, sind aber in der Natur Schwankungen der Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentration ausgesetzt und reagieren mit Veränderungen der Genexpression26,27,28,29. Daher sollten Genexpressions-, Wachstums- und andere Stoffwechselstudien den Sauerstoff- und Kohlendioxidgehalt mit Hilfe eines sauerstoffkontrollierten Inkubators oder einer anaeroben Kammer kontrollieren. In Kultur werden Kulturen wöchentlich oder häufiger entweder mit Dunkelfeldmikroskopie oder Phasenkontrastmikroskopie auf das Vorhandensein von Spirochäten überprüft. Kulturausstriche können entweder mit Silberfärbungen, Immunhistochemie oder durch die Verwendung fluoreszenzmarkierter Stämme gefärbt werden29,30. Die PCR mit anschließender DNA-Sequenzierung ist eine empfindliche und spezifische Methode zum Nachweis und zur genetischen Identifizierung bzw. Bestätigung der Borrelienspezies 30,31,32,33.

Es gibt viele kleinere Variationen von BSK-II, und einige sind im Handel erhältlich. Das hier in Abschnitt 1 beschriebene Protokoll wurde von Barbour (1984)21 übernommen. Flüssiges MKP-Medium ist ein neueres Medium und wird in Abschnitt 2 beschrieben. Es wird gemäß einem zuvor berichteten Protokoll33,34 hergestellt, das, ähnlich wie BSK-Medium, aus zwei Schritten besteht: der Herstellung des Basismediums und der Herstellung des vollständigen Mediums. Borrelien-Nährmedium kann mit oder ohne Antibiotika hergestellt werden, wie in Abschnitt 3 beschrieben; das Antibiotikagesetz zur Verringerung kontaminierender Bakterien, die bei der Impfung mit klinischen Proben oder Umweltproben eingeführt werden, wie in Abschnitt 4 beschrieben; Bei der Inokulation mit reiner Borrelien-Sp.-Kultur sind möglicherweise keine Antibiotika erforderlich. Es ist oft wichtig, langfristige Borrelienvorräte anzulegen, und ein Protokoll dafür wird in Abschnitt 5 beschrieben. Abschnitt 6 beschreibt die Verwendung dieser Medien zur Isolierung reiner Borrelien-Sensu-Lato-Klone aus klinischen oder Umweltproben. Es gibt eine Reihe möglicher Ansätze36; Im Folgenden finden Sie eine, die sich als wirksam erwiesen hat. Das in diesem Protokoll verwendete Beschichtungsmedium ist eine Modifikation des BSK-II-Beschichtungsmediums37 und des MKP-Mediums34 (wobei das Kaninchenserum auf 10 % erhöht wurde38).

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Protocol

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Alle Studien mit Proben, die von menschlichen Probanden entnommen wurden, wurden vom Institutional Review Board der jeweiligen Universität und/oder medizinischen Einrichtung genehmigt, und die Teilnehmer wurden vor der Entnahme der Proben eine schriftliche Einverständniserklärung einholen. Alle Studien mit Tierproben wurden genehmigt und nach den Richtlinien der Institutionellen Tierethikkommission durchgeführt. Gegebenenfalls wurden Genehmigungen für Umweltprobenahmen eingeholt.

HINWEIS: Der Erfolg der Kultur hängt entscheidend von der Qualität der Zutaten ab. Kommerzielles BSK-Medium ist verfügbar und unterstützt robust das Wachstum von im Labor angepassten reinen B. burgdorferi und verwandten Arten, bei denen hochdosiertes Inokulum zur Aussaat der Kultur verwendet werden kann. Für Isolate von Stämmen aus primärem biologischem Material wird ein frisch präpariertes Medium bevorzugt und ist oft notwendig.

Borrelien sp. sind bekannte oder vermutete Krankheitserreger, und auch ungescreentes menschliches oder tierisches Gewebe kann eine biologische Gefahr darstellen. Der Umgang mit potenziell infektiösem Material erfordert persönliche Schutzausrüstung und sterile Technik für die Sicherheit der Ermittler. Außerdem ist das Medium so nährstoffreich, dass die Kultur leicht kontaminiert werden kann. Für diese Arbeiten ist in der Regel ein Containment der Biosicherheitsstufe 2 erforderlich, und alle Arbeiten mit Borrelia sp. oder Proben sollten in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.

1. Anleitung zur Herstellung des BSK-II-Mediums

  1. Aufbereitung des kompletten BSK-II-Mediums
    1. Besorgen Sie sich Reagenzien zur Herstellung von 1 l des Mediums, wie in Tabelle 1 gezeigt.
      HINWEIS: Die Reinheit von BSA (oder mangelnde Reinheit) ist entscheidend für ein optimales Wachstum. Insbesondere die BSA-Reinheit unterscheidet sich zwischen Hersteller und Charge. In Tabelle 2 finden Sie eine Liste der erfolgreicheren und weniger erfolgreichen Produkte. Mehrere Muster von verschiedenen Anbietern zu erhalten, sie auf optimales Wachstum zu testen und dann eine große Menge der besten Charge zu kaufen, ist eine effektive Strategie, um dieses Problem zu entschärfen und ein gutes Medium zu produzieren.
    2. Beginnen Sie mit dem Auflösen des BSA in einem Becherglas durch Einrühren des Wassers, was mindestens eine halbe Stunde dauert.
    3. Fügen Sie alle trockenen Chemikalien hinzu und lassen Sie sie sich auflösen. Fügen Sie dann die CMRL hinzu.
    4. Stellen Sie den pH-Wert des BSK-II-Mediums bei Bedarf mit 1 M NaOH auf 7,6 ein.
    5. Fügen Sie dem BSK-II-Medium Kaninchenserum in einer Konzentration von 6%-10% hinzu. Sterilisieren Sie das BSK-II-Medium (0,22 μm Porengröße). Die benötigte Serummenge hängt von der Borrelienart ab. Verwenden Sie 6%-7% für die RF-Arten und -Stämme und für Borrelia burgdorferi sensu lato. Wenn das Wachstum nicht stark ist, fügen Sie dem Medium ein weiteres steriles Kaninchenserum von 1%-2% hinzu.
    6. Frieren Sie den Vorrat des BSK-II-Mediums in 100 ml oder 400 ml Aliquots ein.
    7. Für HF-Stämme wird Gelatine benötigt. Fügen Sie 100 ml 7%ige sterile Gelatine (leicht erwärmt, um sie in eine Lösung zu geben) zu 400 ml BSK-II-Medium hinzu. Erwärmen Sie den BSK-II mit Gelatine bei 37 °C, damit die Gelatine schmilzt, bevor Sie die Kultur beimpfen.
      Anmerkungen: Das Medium kann vor der Filtersterilisation und der Zugabe von Kaninchenserum und Gelatine (für RF-Spirochäten) oder nach der Filtersterilisation und der Zugabe von Serum (und Gelatine) eingefroren werden (-20 °C). Das Medium ist stabil, wenn es lange gefroren ist. Wenn Sie es im Kühlschrank aufbewahren, verwenden Sie das Medium innerhalb von 1 Monat. RF-Arten wachsen am besten mit frischem Medium, das normalerweise nicht älter als 1 Woche ist. Wenn es nicht gefroren ist, überprüfen Sie die Qualität des Mediums visuell auf Trübung. Entsorgen Sie das Medium, das verunreinigt zu sein scheint, Inhaltsstoffe ausfällt oder anderweitig zweifelhaft ist.
    8. Wenn dem Medium Antibiotika zugesetzt werden sollen, fügen Sie sie frisch hergestelltem Medium oder zuvor gefrorenen Aliquots hinzu. Letzteres ist der flexiblere Ansatz. Verwenden Sie Antibiotikakonzentrationen, wie von Oliver et al.39 beschrieben.
    9. Während Sie ein Röhrchen des Mediums auftauen, wiegen Sie die Antibiotika mit einer Präzisionswaage in sterile (autoklavierte) 1,7-ml-Röhrchen oder sterile konische 15-ml-Röhrchen ein. Bereiten Sie die Stammlösungen wie folgt vor: Lösen Sie 25 mg Amphotericin B in 10 ml DMSO, 20 mg Phosphomycin in 1 ml autoklaviertem destilliertem Wasser und 50 mg Rifampicin in 1 ml DMSO auf.
    10. Sterilisieren Sie die Antibiotika (0,2 μm Spritzenvorsatzfilter) und füllen Sie sie in ein neues Röhrchen geeigneter Größe.
    11. Verdünnen Sie die Antibiotika im Verhältnis 1:1000 des Mediums, um ihre Endkonzentration zu erreichen. Für 500 ml BSK werden 0,5 ml Amphotericin-B-Stammlösung (2,5 mg/ml in DMSO), 0,5 ml Phosphomycin-Stammlösung (20 mg/ml in sterilemH2O) und 0,5 ml Rifampicin-Stammlösung (US: Rifampin) (50 mg/ml in DMSO) hinzugefügt.
    12. Verwenden Sie das mit Antibiotika versetzte Medium oder aliquot und frieren Sie es bei -20 °C ein.
BestandteileMenge (/L)
BSA-Fraktion V50 g
CMRL-1066 (10x)100 ml
Neopepton5 g
Hepes6 g
Zitronensäure-Trinatriumsalz-Dihydrat0,7 g
Traubenzucker5 g
TC Hefeolat2 g
Brenztraubensäure (Na-Salz)0,8 g
N-Acetyl-D-glucoseamin0,4 g
Natriumbicarbonat2,2 g
Wasser (hochrein)900 ml

Tabelle 1: Zusammensetzung von 1 l BSK-II-Medium.

QuelleEignung
Serva GmbH, Heidelberg, DeutschlandJa
Proliant Biologicals, Boone IA, Vereinigte Staaten von AmerikaJa
Sigma (Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich), St. Louis, MO, Vereinigte StaatenNein

Tabelle 2: BSA-Quellen und Eignung für BSK-II-Medium.

2. Anleitung zur Herstellung von MKP

  1. Aufbereitung des Grundmediums
    1. Alle pulverförmigen Komponenten, wie unten in Tabelle 3 aufgeführt, sorgfältig abgewogen und in 3 /4 des Endvolumens vonddH2O(ca. 750 ml) unter Rühren bis zum vollständigen Auflösen auflösen, was ~1 h dauert.
    2. Nach vollständigem Auflösen wird der pH-Wert mit NaOH auf 7,6 und das Volumen auf 1000 ml eingestellt und anschließend durch Filtration (0,22 μm Filter) sterilisiert.
      HINWEIS: Das Basismedium kann bis zu 3 Monate bei -20 °C gelagert werden.
  2. Aufbereitung von MKP-Komplettmedium
    1. Mischen Sie alle in Tabelle 4 aufgeführten Komponenten steril. Sterilisieren Sie die Gelatine durch Autoklavieren und handhaben Sie sie steril. Arbeiten Sie in einer sterilen biologischen Sicherheitswerkbank und verwenden Sie ein steriles, gefiltertes Serum.
    2. Aliquot MKP in 50-ml-Röhrchen. Geben Sie ein kleines Aliquot für mehrere Tage bei 33 °C und prüfen Sie dann unter einem Dunkelfeldmikroskop, ob keine Kontamination vorliegt.
      Anmerkungen: Bewahren Sie MKP complete medium bei +4 °C nicht länger als 1 Monat auf und frieren Sie es nicht ein. Das komplette Medium kann zusätzlich durch Filtration mit einem 0,22 μm Filter sterilisiert werden.
BestandteileMenge (/L)
CMRL-1066 (10x ohne Glutamin)100 mL (wenn flüssig)/9,7 g/L bei Pulver
Neopepton3 g
Hepes6 g
Zitronensäure0,7 g
Traubenzucker3 g
Brenztraubensäure0,8 g
N-Acetylglucoseamin0,4 g
Natriumbicarbonat2 g

Tabelle 3: Zusammensetzung von 1 l basischem MKP-Medium (modifiziertes Kelly-Pettenkofer-Medium).

BestandteileMenge (ml)
Grundmedium500
7% Gelatine (in H2O) (frisch autoklaviert, aber nicht heiß)100
Kaninchen Serum36
35% BSA17.5

Tabelle 4: Zusammensetzung des MKP-Komplettmediums (modifizierter Kelly-Pettenkofer).

3. Kultur von Borrelien, mit oder ohne Antibiotika

  1. Führen Sie alle Versuchsschritte unter sterilen Arbeitsbedingungen in einer biologischen Sicherheitswerkbank durch. Desinfizieren Sie die Oberfläche und alle Materialien mit 70%igem Ethanol und übergeben Sie sie sofort in die biologische Sicherheitswerkbank. UV-sterilisieren Sie alle nicht-biologischen Materialien in der biologischen Sicherheitswerkbank für 5 min vor Beginn der Arbeiten.
  2. Verwenden Sie ein möglichst frisches Medium.
  3. Um eine Kultur zu starten, wird das Medium in einem Inkubator vorgewärmt (33 °C - 37 °C). Bei Bedarf schütteln.
    HINWEIS: Je nach Volumen des Mediums kann dieser Schritt mehrere Stunden dauern.
  4. Fügen Sie ~1 ml aufgetaute Borrelienkultur aus einem Glycerin oder einem ähnlichen Vorrat, die zuvor bei -80 °C gelagert und bei Raumtemperatur (RT) aufgetaut wurde, sobald sie flüssig ist, zu 5-15 ml vorgewärmtem BSK-Medium hinzu. Beimpfen Sie die Kultur in ein kleines Volumen (5-15 ml BSK) mit handelsüblichen Glas- oder Kunststofffläschchen mit Schraubverschluss. Füllen Sie die Röhrchen fast voll, um eine mikro- oder anaerobe Atmosphäre zu schaffen. Verschließen Sie die Röhrchen fest; Wenn es auf diese Weise kultiviert wird, wird CO2 nicht benötigt.
  5. Kultivieren Sie RF-Arten (und B. persica) bei 37 °C in einem Inkubator ohne Rühren oder Rühren. Kultivieren Sie B. burgdorferi sensu lato Arten bei 33-34 °C.
  6. Überwachen Sie das Wachstum der Borrelienkultur mit Hilfe von Phasenkontrast- oder Dunkelfeldmikroskopie bei 200- bis 400-facher Vergrößerung (Abbildung 3). Um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, mischen Sie die Kultur mit einer serologischen Pipette oder für mehr Durchmischung mit einer 3-ml-Transferpipette, während Sie auf und ab pipettieren.
    HINWEIS: Borrelien sind bei höherer Vergrößerung (200X-400X) am besten sichtbar, lassen sich aber am besten bei 200-facher Vergrößerung auf einem Hämozytometer40 zählen. Die Bewegung und Morphologie der Borrelien weisen auf das Vorhandensein dieser Bakterien hin.
  7. Um das Bakterienwachstum zu quantifizieren, zählen Sie mehrere (10) einzelne kleine Quadrate im sechzehnfeldrigen Gittermuster der Zählfläche auf beiden Seiten des Hämozytometers und des Durchschnitts. Multiplizieren Sie die durchschnittliche Zellzahl pro kleinem Quadrat mit dem Umrechnungsfaktor, der für das Hämozytometer geeignet ist, das zur Bestimmung der Zellzahl pro ml verwendet wird.
  8. Überwachen Sie das Bakterienwachstum in Intervallen von 1-2 Tagen. Das exponentielle Wachstum von Borrelien ist abhängig von der Lebensfähigkeit und Zelldichte und kann bei 34 °C 1 Woche oder länger dauern. Verdünnen Sie die exponentiellen Phasenkulturen im Verhältnis 1:2 oder 1:4 mit dem Medium in einem 1,7-ml-Röhrchen, bevor Sie sie auf das Hämozytometer laden. Berücksichtigen Sie den Verdünnungsfaktor bei der Bestimmung der Zellzahl. Besprühen Sie nach Gebrauch die Oberflächen und das Hämozytometer mit verdünntem Bleichmittel (10 %) und/oder 70 % Ethanol.
    HINWEIS: Borrelien befinden sich in exponentiellem Wachstum, wenn die Zellkonzentrationen 1-5 x 107 Zellen/ ml betragen. Innerhalb dieses Bereichs wachsen die Zellen gut.
  9. Eine ausgedehnte Kultur verbraucht Nährstoffe und verändert den pH-Wert des Mediums, so dass eine Subkultivierung erforderlich ist. Unter sterilen Bedingungen in einer biologischen Sicherheitswerkbank 1/10 des Kulturvolumens in ein neues Röhrchen überführen und mit dem neuen Medium füllen (ein frisches Aliquot desselben Mediums, das für die Aufzucht der vorherigen Passage verwendet wurde). Eine Verdünnung von 1:10 ist optimal. Wenn das Kulturvolumen geändert werden soll, passen Sie die Inokulummenge entsprechend an und setzen Sie die Inkubation fort. Die Anzahl der Passagen nimmt mit jedem Medienwechsel zu.
  10. Für die Extraktion von DNA oder die Isolierung von Borrelienzellen zentrifugieren Sie die Exponentialphase Borrelien für 10 min bei 4000 x g, um die Bakterien zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand in geeigneten biologisch gefährlichen Abfällen. Verarbeiten Sie die pelletierten Bakterien mit einem handelsüblichen DNA-Extraktionskit oder resuspendieren Sie die Bakterien in einem geeigneten Medium für das beabsichtigte Experiment.
  11. Sterilisieren Sie am Ende jeder Manipulation alle Geräte mit Ethanol und UV-Strahlung, je nach Bedarf. Sammeln Sie die flüssigen Abfälle, einschließlich der überschüssigen Kultur, in einer Abfallflasche und fügen Sie Bleichmittel bis zu einer Endkonzentration von 10 % hinzu. Stellen Sie diese Flasche auf -80 °C, bevor Sie sie entsorgen. Alternativ können Sie die flüssigen Abfälle sterilisieren und ohne Bleichmittel oder Alkohol durch Autoklavieren kultivieren.

4. Langzeitlagerung von Borrelienkulturen

  1. Aufbereitung des Glycerinvorrats der Borrelienkultur
    1. Man nehme ~1,8 ml Aliquots exponentieller Phasenkulturen, Zellkonzentrationen ~107-10 8 Zellen/ml, und füge steriles Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 10 % hinzu (Konzentrationen von 5 %-20 % Arbeit).
    2. In kryogene Durchstechflaschen mit 2 ml Schraubverschluss geben. Bei -80 °C lagern.
    3. Halten Sie einen Vorrat mit mindestens 10 Tuben jeder Sorte im Gefrierschrank bereit.
  2. Ein alternatives Lagerrezept zur Herstellung eines Glycerinvorrats für die dauerhafte Lagerung
    1. Mischen Sie 2/3 der Borrelienkultur mit 1/3 von 15% Glycerin in Brucella-Brühe . Verwenden Sie 2,8 g Brucella-Bouillon gelöst in 100 mlddH2O, das steril filtriert wurde (0,22 μm).
    2. Halten Sie den Glycerinvorrat der Proben bei -70 °C bis -80 °C.

5. Isolierung von Spirochäten aus umweltbedingten oder klinischen Quellen

HINWEIS: Wenn Material aus menschlichen, tierischen oder ökologischen Quellen isoliert wird, müssen gegebenenfalls Forschungsethik, Tierpflege oder ökologische Zertifizierungen eingeholt werden.

  1. Kultivierung von Borrelien aus harten Zecken
    1. Sammle erwachsene Weibchen, Männchen und/oder Nymphenzecken.
    2. Sterilisieren Sie alle Zeckenproben an der Oberfläche, indem Sie sie 2 Minuten lang in 70%iges Ethanol tauchen und in einer biologischen Sicherheitswerkbank an der Luft trocknen. Mit einem sterilen Skalpell einzeln in mehrere Stücke zerlegen. Geben Sie die Stücke in ein 2-ml-Röhrchen mit 1,5 ml Medium, das mit Antibiotika ergänzt wird.
    3. Inkubieren Sie die Kulturen bei 34 °C und überprüfen Sie die ersten 2 Wochen zweimal wöchentlich für die ersten 2 Wochen und wöchentlich für 6 Wochen durch Dunkelfeld- oder Phasenkontrastmikroskopie auf Spirochäten. Subkulturkultur-positive Proben in 5 ml desselben Mediums.
      HINWEIS: Kontaminierte Kulturen können bis zu einem gewissen Grad durch Filtration mit einem 0,2-μm-Filter gereinigt werden. Möglicherweise sind Antibiotika erforderlich, um die Kontamination vollständig aufzulösen.
  2. Kultivierung von Borrelien aus Blutproben
    HINWEIS: Die Blutprobe sollte je nach Quelle des Materials von einem qualifizierten Arzt, Tierarzt oder Forscher entnommen werden. Zwischen der Probe sollten weniger als 24 Stunden bei RT vergehen
    Entnahme und Ankunft im Labor.
    1. Entnahme von 10 ml Blut, gesammelt in Blutentnahmeröhrchen aus Glas mit saurer Citrat-Dextrose (ACD; "gelbe Spitze") als Gerinnungshemmung. Bei Raumtemperatur stehen lassen. Es wird empfohlen, dass zwischen Blutentnahme und Impfung weniger als 24 Stunden vergehen.
    2. Zentrifugieren Sie das Blut mit einem Gerinnungshemmer für 10 Minuten bei 200-400 x g , um das Plasma von den Blutzellen zu trennen.
    3. Entfernen Sie das Plasma vorsichtig aus dem Röhrchen und beimpfen Sie 1 ml Plasma in 5 ml vorgewärmtes MKP-Komplettmedium. MKP kann mit Antibiotika ergänzt werden. Inkubieren Sie Kulturen bei 33 °C mit täglicher visueller Inspektion und wöchentlicher Dunkelfeld- oder Phasenkontrastmikroskopie, bis ein Borrelienwachstum festgestellt wird (häufiger bei RF-Borrelien), was bis zu 9 Wochen dauern kann.
      Anmerkungen: Wenn Sie größere oder kleinere Impfvolumina verwenden, halten Sie das Verhältnis von Impfmittel zu Medium von 1:5 bei. Verwenden Sie Seren oder Plasma anstelle von Vollblut.
  3. Kultivierung von Borrelien aus Hautbiopsie
    1. Oberflächensterilisation der Hautbiopsie (idealerweise ein 3 mm x 3 mm x 3 mm großer Würfel; d. h. mit 70 % Ethanol und Wasserstoffperoxid). Die Biopsieprobe wird in physiologische Kochsalzlösung gelegt.
      HINWEIS: Eine Biopsieprobe sollte je nach Quelle des Materials von einem qualifizierten Arzt, Tierarzt oder Forscher entnommen werden. Zwischen der Probenentnahme und dem Eintreffen im Labor sollten weniger als 24 Stunden bei der RT vergehen.
    2. Würfeln Sie die Probe mit einer sterilen Rasierklinge in einer sterilen Glas-Petrischale in zwei bis sechs kleinere Stücke, während Sie sie in die physiologische Kochsalzlösung eintauchen. Alle Proben und ~1 ml der physiologischen Kochsalzlösung, in der die Hautbiopsie gelagert wurde, werden in 5 ml vorgewärmtes Medium überführt, das mit Antibiotika angereichert ist, und bei 33 °C inkubiert.
    3. Bei übermäßigem Wachstum kontaminierender Bakterien sind Antibiotika wie in Schritt 1.1.10 oben beschrieben oder durch Zugabe von zwei Tabletten Sulfamethoxazol (23,75 mg; Endkonzentration 5 mg/ml) + Trimethoprim (1,25 mg; 0,25 mg/ml) oder Bactrim (minimale Hemmkonzentration >128 μg/ml), zwei Tabletten Amikacin (2 x 30 μg; Endkonzentration 12 μg/ml) zuzugeben. und zwei Tabletten Phosfomycin (2 x 200 μg; Endkonzentration 80 μg/ml).
      HINWEIS: Achten Sie in jedem Fall darauf, dass die minimale Hemmkonzentration dieses Antibiotikums für die Borrelienarten, für die eine Kultur versucht wird, unterschritten wird41,42,43.
    4. Wenn die Kultur positiv für Borrelien ist, bewahren Sie die Kultur für weitere 3-4 Tage auf oder bis die Menge an Borrelien 10+ Spirochäten in einem Mikroskopfeld mit einem 40-fachen Objektiv erreicht. Erstellen Sie einen Glycerinvorrat für die dauerhafte Lagerung.

6. Isolierung monoklonaler Populationen von B. burgdorferi sensu lato Spirochäten und B. miyamotoi aus Flüssigkulturen durch Kultivierung auf festen Medien

  1. Für die Herstellung von Platten erwärmen Sie 300 ml 1,5-faches MKP-Komplettmedium (ohne Gelatine). Erwärmen Sie außerdem 200 ml 1,7%ige Agarose (autoklaviert in deionisiertem Wasser, gelagert bei RT und vor Gebrauch in der Mikrowelle) auf 55 °C. Mischen Sie beide Flüssigkeiten.
  2. Pipettieren Sie 15 ml dieser Mischung in jede der 16 tiefen Petrischale, um die untere Agar-Oseschicht herzustellen.
  3. Den Rest des Mediums bei 55 °C im Wasserbad zurückhalten.
    HINWEIS: Die Borrelien werden in die oberste Agaroseschicht eingemischt.
  4. Quantifizieren Sie zunächst die Dichte der Borrelienkulturen mit einem Hämozytometer und verdünnen Sie sie in einem flüssigen Medium auf die gewünschte Dichte.
    HINWEIS: 500, 200, 100 und 50 Spirochäten pro Platte funktionieren gut.
  5. Nachdem die Bodenplatten fest geworden sind, geben Sie 10 ml der restlichen Agarosemischung in ein 15-ml-Röhrchen, das die entsprechende Anzahl von Spirochäten enthält.
  6. Gießen Sie die Suspension auf die untere Agarose in der beschrifteten Petrischale.
    HINWEIS: Da Borrelien-Spirochäten empfindlich auf hohe Temperaturen reagieren, sollte darauf geachtet werden, dass die Bakterien nicht über einen längeren Zeitraum 55 °C ausgesetzt werden. Gießen Sie den oberen Agar sofort nach der Zugabe zu den Bakterienzellen im Medium.
  7. Nachdem die Platten vollständig erstarrt sind, verschließen Sie die Petrischalen und stellen Sie sie kopfüber bei 34-35 °C in 2,5% CO2 auf.
    Anmerkungen: Die Kolonien erscheinen 1 Woche nach dem Ausplattieren, wenn das Verfahren erfolgreich ist.
  8. Um die einzelnen Kolonien zu screenen und zu expandieren, wählen Sie einzelne Kolonien aus den Platten aus und geben Sie sie in 1,5 ml modifiziertes flüssiges MKP oder ein anderes geeignetes Medium in sterile 2-ml-Kulturröhrchen.
  9. Die Kulturen werden bei 34 °C inkubiert und mittels Dunkelfeld- oder Phasenmikroskopie auf Spirochäten untersucht. Verwenden Sie diese Kulturen für Analysen oder Bestände, die wie oben beschrieben erstellt wurden.

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Results

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Borrelien-Nährmedien BSK und MKP sowie Varianten sind reichhaltige Nährmedien mit Inhaltsstoffen, die nacheinander vorbereitet und sterilisiert werden müssen. Bei korrekter Zubereitung sollte BSK-Medium rot-orange und klar sein (Abbildung 1). Trübungen und Niederschläge, die nach der Erwärmung bestehen bleiben, deuten auf problematische Inhaltsstoffe, Mediumproduktion oder Kontamination hin. Ein solches Medium wird am besten verworfen. Wenn Gelatine zu BSK und mit MKP hinzugefügt wi...

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Discussion

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Die Laborkultur von Bakterien ist das Sprungbrett für die Forschung. Der tiefgreifende Vorteil, den die Fähigkeit zur Kultivierung mit sich bringt, wird durch den mehr als ein Jahrhundert dauernden Kampf gegen die Kultivierung von Treponema pallidum, der Spirochäte, die der ätiologische Erreger der Syphilis ist, veranschaulicht44. Borrelien-Spirochäten sind auch eine Herausforderung für die Kultur, aber Kultur ist möglich 23,24,34,44,45,46,47,48,49.

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interessenkonflikte wurden nicht erklärt.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde teilweise vom Natural Science and Engineering Research Council of Canada und der Canadian Lyme Lyme Disease Foundation (AB und VL), dem Schwedischen Forschungsrat (SB, M-LF und IN), TAČR GAMA 2 Projekt - "Unterstützung der Verifizierung des Anwendungspotenzials 2.0 am Biologiezentrum CAS" (TP01010022) (MG und NR) und durch einen Zuschuss des Gesundheitsministeriums der Tschechischen Republik NV19-05-00191 (MG und NR) unterstützt. Wir danken S. Vranjes (2021, AG Rudenko) für das Bild in Abbildung 4 und J. Thomas-Ebbett (2021, AG Lloyd) für die Bilder in Abbildung 5. Wir danken allen Forschern, die zu diesem Gebiet beigetragen haben, und entschuldigen uns bei denen, deren Arbeiten wir aus Platzgründen nicht zitieren konnten.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,7 mL RöhrchenVWR87003-294Standardartikel - jeder Lieferant wird
0,2  &Mikro; m Steriler Spritzenvorsatzfilter VWR28145-501Standardartikel - jeder Lieferant wird
10 & Mikro tun; L Barriere-PipettenspitzeNeptuneBT10XLS3Standardartikel - jeder Anbieter stellt
10 mL Serologische Pipetten her Celltreat229011BStandardartikel - jeder Lieferant wird
1000 & Mikro tun; L Barriere PipettenspitzeNeptuneBT1000.96Standardartikel - jeder Lieferant wird
15 ml RöhrchenCelltreat188261Standardartikel machen - jeder Lieferant wird
20 & Mikro machen; L Barriere-PipettenspitzeNeptuneBT20Standardartikel - jeder Lieferant wird
20 ml sterile Spritze herstellen  BD309661Standardartikel - jeder Lieferant wird
200 & Mikro tun; L Barriere-PipettenspitzeNeptuneBT200Standardartikel - jeder Lieferant wird
25 ml Kulturröhrchen mit Schraubverschlussherstellen Fisher Scientific14-933CStandardartikel - jeder Lieferant wird
25 mL Serologische PipettenCelltreat229025BStandardartikel - jeder Lieferant wird
3 ml sterile SpritzeBD309657Standardartikel herstellen - jeder Lieferant wird
35% BSA durchführen SigmaA-7409Quelle ist wichtig - siehe Hinweis
5 mL Serologische Pipetten Celltreat229006BStandardartikel - jeder Lieferant stellt
50 ml Röhrchenher Celltreat229421Standardartikel - jeder Lieferant stellt
6,5 ml MKP Glasröhrchen her SchottSchott Nr. 26 135 115Standardartikel - jeder Lieferant wird
AmikacineSigmaPHR1654Standardartikel herstellen - jeder Lieferant wird
Amphotericin BSigmaA9528-100MGStandardartikel verwenden - jeder Lieferant wird
Bactrim/Rimethoprim/SulfamethoxazolSigmaPHR1126-1GStandardartikel verwenden - jeder Lieferant wird
BBL Brucella BrüheBD211088Standardartikel - jeder Lieferant führt
BiosicherheitswerkbankLabconco302419100Standardartikel - jeder Lieferant führt
Blutentnahmeröhrchen (gelber Oberteil - ACD) durch. Vacutainer Blutentnahmeröhrchen aus Glas mit saurer Citrat-Dextrose (ACD)Standardartikel - jeder Lieferant wird
BSK-H Medium [w 6% Kaninchenserum] Darlynn BiologicalsBB83-500Standardartikel - jeder Lieferant wird
zentrifugieren EppendorfModell 5430Standardartikel - jeder Lieferant wird tun
Zitronensäure TrisodiumSalzDihydratSigmaC-8532 100 gStandardartikel - jeder Lieferant wird CMRL
Gibco BRL21540 500 mLStandardartikel tun - jeder Lieferant wird kaufen
CMRL-1066Gibco21-510-018Standardartikel - jeder Lieferant wird
Kryoröhrchen (Nalgene)Fisher Scientific5000-0020Standardartikel - jeder Lieferant wird
Deep Petri mit Stapelring 100 mm & mal 25 mmSigmaP7741Standardartikel - jeder Lieferant wird
tun Digitaler InkubatorVWRModell 1545Standardartikel - jeder Lieferant wird
DMSOThermoFisherD12345Standardartikel herstellen - jeder Lieferant wird
Filter für die FiltersterilisationherstellenMillipore 0,22 μm m GPExpressPLUS MembranSCGPU05REStandardartikel - jeder Lieferant wird
GelatineDifco BD214340 500 gStandardartikel - jeder Lieferant wird
GlaskulturröhrchenFisher Scientific99449-20Standardartikel herstellen - jeder Lieferant wird
kaufen GlukoseSigmaG-7021 1 kgStandardartikel - jeder Lieferant wird
GlycerolSigmaG5516herstellenStandardartikel - jeder Lieferant wird
Hemafuge (Hämatokrit & Immunhämatologie-Zentrifuge )LabwissenModell 3220Standardartikel - jeder Lieferant macht
HEPESSigma H-3784 100 gStandardartikel - jeder Lieferant wird
N-AcetylglukosaminSigma A-3286 25 gStandardartikel - jeder Lieferant macht
NeopeptonDifco  BD211681 500 gStandardartikel - jeder Lieferant macht
Neubauer HämatozytometerSigma Z359629Standardartikel - jeder Anbieter wird
PhasenkontrastmikroskopeLeitzStandardartikel - jeder Lieferant wird
PhosphomycinSigmaP5396-1GStandardartikel herstellen - jeder Lieferant wird
PhosphomycinSigmaP5396Standardartikel herstellen - jeder Lieferant wird
PipetboyIntegraStandardartikel herstellen - jeder Lieferant wird
Präzisions-StandardwaageOHAUSModell TS200SStandardartikel - jeder Lieferant tun Lieferant wird
Brenztraubensäure (Na-Salz)SigmaP-8574 25 gStandardartikel - jeder Lieferant wird
Kaninchenserum machen Gibco16-120-032Quelle ist wichtig 
Kaninchen-Serum SigmaR-4505  100 mLQuelle ist wichtig 
RifampicinSigmaR3501-1GStandardartikel - jeder Lieferant wird
NatriumbicarbonatSigmaS-5761        500 gStandardartikel - jeder Lieferant wird
Sufametaxazol verwenden SigmaPHR1126Standardartikel - jeder Lieferant wird
TC YeastolateDifco machen  BD255752 100 gStandardartikel - jeder Lieferant wird
TransferpipettenVWR470225-044Standardartikel - jeder Lieferant wird
TrimethoprimSigmaPHR1056Standardartikel herstellen - jeder Lieferant wird es tun
herstellen herstellen herstellen

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