Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Etablierung von 3D-Endometrium-Organoiden aus der Gebärmutter der Maus

7.9K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/64448

⸱

6. Januar 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung von Endometrium-Epithel-Organoiden der Maus für die Genexpression und histologische Analysen.

Zusammenfassung

Endometriumgewebe kleidet die innere Höhle der Gebärmutter aus und steht unter der zyklischen Kontrolle von Östrogen und Progesteron. Es ist ein Gewebe, das aus luminalem und Drüsenepithel, einem Stromakompartiment, einem vaskulären Netzwerk und einer komplexen Immunzellpopulation besteht. Mausmodelle waren ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Endometrium zu untersuchen und kritische Mechanismen aufzudecken, die Implantation, Plazenta und Krebs steuern. Die jüngste Entwicklung von 3D-Endometrium-Organoidkulturen stellt ein hochmodernes Modell dar, um die Signalwege zu analysieren, die der Biologie der Gebärmutterschleimhaut zugrunde liegen. Die Etablierung von Endometrium-Organoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen, die Analyse ihrer Transkriptome und die Visualisierung ihrer Morphologie in Einzelzellauflösung sind entscheidende Werkzeuge für die Erforschung von Endometriumerkrankungen. Dieser Artikel skizziert Methoden zur Etablierung von 3D-Kulturen von Endometriumepithel aus Mäusen und beschreibt Techniken zur Quantifizierung der Genexpression und zur Analyse der Histologie der Organoide. Ziel ist es, eine Ressource bereitzustellen, die zur Etablierung, Kultur und Untersuchung der Genexpression und morphologischen Eigenschaften von Endometriumepithel-Organoiden verwendet werden kann.

Einleitung

Das Endometrium - das innere Schleimhautgewebe der Gebärmutterhöhle - ist ein einzigartiges und hochdynamisches Gewebe, das eine entscheidende Rolle für die reproduktive Gesundheit einer Frau spielt. Während der reproduktiven Lebensspanne hat das Endometrium das Potenzial, Hunderte von Zyklen der Proliferation, Differenzierung und des Abbaus zu durchlaufen, die durch die konzertierte Wirkung der Eierstockhormone - Östrogen und Progesteron - koordiniert werden. Studien an gentechnisch veränderten Mäusen haben grundlegende biologische Mechanismen aufgedeckt, die der Reaktion der Gebärmutterschleimhaut auf Hormone und der Kontrolle der Embryoimplantation, der Stromazelldezidualisierung und der Schwangerschaft zugrunde liegen1. In-vitro-Studien waren jedoch aufgrund von Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung nicht transformierter primärer Endometriumgewebe der Maus in traditionellen 2D-Zellkulturen begrenzt 2,3. Jüngste Fortschritte in der Kultur von Endometriumgewebe als 3D-Organsysteme oder Organoide bieten eine neue Möglichkeit, biologische Signalwege zu untersuchen, die die Regeneration und Differenzierung von Endometriumzellen steuern. Endometrium-Organoidsysteme der Maus und des Menschen wurden aus reinem Endometriusepithel entwickelt, das in verschiedenen Matriceseingekapselt ist 4,5, während menschliches Endometrium als gerüstfreie epitheliale/stromale Co-Kulturen 6,7 und in jüngerer Zeit als kollagenverkapselte Epithel-/Stroma-Assembloide kultiviert wurde8 . Das Wachstum und das regenerative Potenzial von epithelialen Organoidkulturen wird durch einen definierten Cocktail aus Wachstumsfaktoren und niedermolekularen Inhibitoren unterstützt, die empirisch bestimmt wurden, um das Wachstum und die Regeneration der Organoide zu maximieren 4,5,9. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, Endometrium-Organoide einzufrieren und aufzutauen, die langfristige Einlagerung von Endometrium-Organoiden von Mäusen und Menschen für zukünftige Studien.

Gentechnisch veränderte Mäuse haben die komplexen Signalwege aufgedeckt, die die frühe Schwangerschaft und Dezidualisierung steuern, und wurden als Modelle für Schwangerschaftsverlust, Endometriumkarzinom und Endometriose verwendet. Diese genetischen Studien wurden weitgehend mit zellspezifischer Deletion von loxP-flankierten Allelen ("gefloxt") unter Verwendung von Cre-Rekombinasen erreicht, die spezifisch im weiblichen Fortpflanzungsgewebe aktiv sind. Zu diesen Mausmodellen gehören der weit verbreitete Progesteronrezeptor-cre 10, der eine starke Rekombinaseaktivität im Epithel- und Stromagewebe des Endometriums aufweist, Lactoferrin i-cre, das bei erwachsenen Mäusen eine endometriumepitheliale Rekombination induziert11, oder Wnt7a-cre, das eine epithelialspezifische Deletion in Müller-abgeleiteten Geweben auslöst12 . Die Kultivierung von Endometriumgewebe aus gentechnisch veränderten Mausmodellen als 3D-Organoide bietet eine hervorragende Möglichkeit, die Biologie des Endometriums zu untersuchen und die Identifizierung von Wachstumsfaktoren und Signalwegen zu erleichtern, die die Erneuerung und Differenzierung von Endometriumzellen steuern13,14. Verfahren zur Isolierung und Kultur von Endometriumgewebe der Maus sind in der Literatur beschrieben und berichten über die Verwendung verschiedener enzymatischer Strategien zur Isolierung von Uterusepithel für die anschließende Kultivierung von Endometriumepithel-Organoiden4. Während die bisherige Literatur einen kritischen Rahmen für Endometriumepithel-Organoid-Kulturprotokolle 4,5,6 bietet, bietet diese Arbeit eine klare, umfassende Methode zur Generierung, Wartung, Verarbeitung und Analyse dieser Organoide. Die Standardisierung dieser Techniken ist wichtig, um den Fortschritt auf dem Gebiet der Reproduktionsbiologie von Frauen zu beschleunigen. Hier berichten wir über eine detaillierte Methodik zur enzymatischen und mechanischen Reinigung von Endometrium-Epithelgewebe der Maus für die anschließende Kultur von Endometrium-Organoiden in einem Gelmatrix-Gerüst. Wir beschreiben auch die Methoden für nachgeschaltete histologische und molekulare Analysen der Gelmatrix-verkapselten Maus-Endometrium-Epithel-Organoide.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Die Handhabung von Mäusen und experimentelle Studien wurden gemäß Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Baylor College of Medicine genehmigt wurden, und gemäß den Richtlinien des NIH-Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Isolierung von Uterusepithel aus Mäusen mit enzymatischen und mechanischen Methoden

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Schritte beschrieben, die erforderlich sind, um epitheliale Endometrium-Organoide von Mäusen unter Verwendung eines Gelmatrix-Gerüsts zu etablieren, zu passieren, einzufrieren und aufzutauen. Frühere Studien haben ergeben, dass während der Brunstphase4 optimale Kulturen von Endometrium-Organoiden der Maus aus Mäusen etabliert werden, was durch zytologische Untersuchung eines Vaginalabstrichs bestimmt werden kann15. Für alle Experimente wurden erwachsene weibliche WT-Mäuse (6-8 Wochen alt, Hybride C57BL/6J und 129S5/SvEvBrd) verwendet. Die Mäuse wurden gemäß den von der IACUC genehmigten Richtlinien mit Isofluran-Sedierung und anschließender zervikaler Disartikulation auf humane Weise eingeschläfert. Sobald die Mäuse eingeschläfert sind, sollten die folgenden Schritte befolgt werden. Weitere Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Lösungen finden Sie in der Materialtabelle .

  1. Lassen Sie die Gelmatrix vor Gebrauch ca. 1-2 h auf Eis auftauen.
  2. Um die Maus zu sezieren, verwenden Sie eine Schere, um einen Mittellinienschnitt am Bauch zu machen, und schälen Sie die Haut vorsichtig zurück, um die darunter liegende Peritonealschicht freizulegen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Peritonealschicht hochzuhalten, und machen Sie seitliche Schnitte mit der Schere, um den Bauchinhalt freizulegen.
    1. Lokalisieren Sie die Gebärmutterhörner, indem Sie die Bauchfettpolster vorsichtig zur Seite schieben. Sezieren Sie sie, indem Sie sie zuerst an der zervikalen Verbindung halten und mit einer Schere entlang des Mesenterialfetts schneiden. Entfernen Sie nach der Dissektion der Gebärmutter der Maus mit einer kleinen Schere gründlich Fettgewebe aus dem Uterushorn.
      HINWEIS: Halten Sie die Sterilität während der Zellisolierung aufrecht, indem Sie alle Operationswerkzeuge vor Gebrauch sterilisieren, den Mäusebauch mit 70% Ethanol besprühen und alle Schritte nach der Dissektion unter einer sterilen Gewebekulturhaube durchführen.
  3. Schneiden Sie jedes Gebärmutterhorn in kleine Fragmente, die jeweils ca. 4-5 mm groß sind.
  4. Legen Sie alle Uterusfragmente aus einer Gebärmutter in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die 0,5 ml 1% Trypsin enthält. Lassen Sie die enzymatische Lösung in das Uteruslumen eindringen, wodurch das Endometriumepithel vom darunter liegenden Stroma enzymatisch getrennt wird.
  5. Die 24-Well-Platte wird in einem 37 °C warmen befeuchteten Gewebekultur-Inkubator für ca. 1 h inkubiert.
  6. Nach der 1-stündigen Inkubation werden die Uterusfragmente auf eine 35 mm große Gewebekulturplatte übertragen, die 1 ml Phosphat-gepufferte Lösung (DPBS) von Dulbecco enthält.
  7. Verwenden Sie unter einem Dissektionsmikroskop eine feine Pinzette und eine 1-ml-Pipette, um das Uterusepithel mechanisch von der Gebärmuttersonde zu trennen. Während Sie ein Ende eines Uterusfragments mit der Pinzette nach unten halten, führen Sie die Pipettenspitze vorsichtig in Längsrichtung über das Fragment und drücken Sie das Epithel aus dem anderen Ende der Gebärmutterröhre. Beobachten Sie die vom Uterusfragment abgetrennten Epithelblätter unter dem Dissektionsmikroskop.
  8. Verwenden Sie die 1-ml-Pipette, um die Epithelschichten zu sammeln und vorsichtig in ein 1,5-ml-Röhrchen zu überführen.
  9. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Uterusfragmente und übertragen Sie alle Epithelblätter in dasselbe Sammelröhrchen.
  10. Die dissoziierten Epithelschichten werden durch Zentrifugation für 5 min bei 375 × g pelletiert.
  11. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, um eine Störung des Zellpellets zu vermeiden.
  12. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 ml 2,5 mg/ml Kollagenase + 2 mg/ml DNase-Lösung. Pipettieren Sie ca. 10x auf und ab, oder bis eine einzellige Suspension erreicht ist.
  13. Fügen Sie 0,5 ml DMEM/F12 + 10% fetales Rinderserum (FBS) + Antibiotika hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 375 × g.
    HINWEIS: Weitere Informationen über das Breitbandantibiotikum, das für die Zellkultur verwendet wird, finden Sie in der Materialtabelle.
  14. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + Antibiotika. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 375 × g.

2. Verarbeitung des Stromakompartiments

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Protokolle beschrieben, die für die Isolierung des Stromakompartiments des Endometriums der Maus erforderlich sind. Angesichts des zunehmenden Interesses an epithelialen/stromalen Kokulturexperimenten ist es wichtig, neben den Epithelzellen, die Organoide erzeugen, auch die Stromazellpopulationen verarbeiten zu können.

  1. Sobald das gesamte Epithel enzymatisch und mechanisch von den Uterusfragmenten getrennt wurde, sind die verbleibenden röhrenförmigen Strukturen die "stromalen / myometrischen" Kompartimente. Sammeln Sie dieses Gewebe in einer 2,5 mg/ml Kollagenase + 2 mg/ml DNase in HBSS-Lösung.
  2. Die stroma-/myometriale Probe wird 15 Minuten lang auf einem 37 °C-Shaker inkubiert.
  3. Nach der Inkubation werden 500 μL DMEM/F12 + 10% FBS + Antibiotika pro Maus hinzugefügt und die nicht dissoziierten Fragmente durch einen 40 μm Zellfilter filtriert.
  4. Die Zellen werden durch Zentrifugation für 5 min bei 375 × g pelletiert.
  5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + Antibiotika. Geben Sie die Mischung tropfenweise in 10 ml DMEM/F12 + 10% FBS + Antibiotika in eine 10 cm Zellkulturplatte. Die Platte wird bei 37 °C in einem befeuchteten Zellkulturbrutschrank inkubiert.
  6. Um Kokulturen von Endometriumepithel- und Stromazellen der Maus zu erzeugen, sind die für menschliche Endometrium-Organoide beschriebenen Methoden unter Verwendung von gerüstfreien oder Kollagenmatrixsystemen 6,8 anzuwenden.
    HINWEIS: Obwohl diese Techniken noch nicht für Mäuse veröffentlicht wurden, können sie basierend auf den veröffentlichten Protokollen mit menschlichem Endometrium angepasst werden.

3. Verkapselung von Uterusepithel in Gelmatrix zur Etablierung von Organoiden

HINWEIS: Bewahren Sie die Gelmatrix auf Eis auf, bis sie gebrauchsfertig ist.

  1. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Volumen der Gelmatrix, das 20x so groß ist wie das des Zellpellets (d. h. wenn das Zellpellet 20 μl beträgt, resuspendieren Sie die Zellen mit 400 μl Gelmatrix). Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig, um das Auftreten von Blasen zu vermeiden.
  2. Lassen Sie die Gelmatrix/Zellsuspension ~10 min bei Raumtemperatur einwirken.
  3. Sobald die Gelmatrix/Zellsuspension zu einem halbfesten Gel wird, verwenden Sie eine P200-Mikropipette mit einer breiten 200-μl-Spitze, um 25 μl der Gelmatrix/Zellsuspension vorsichtig abzusaugen. Dosieren Sie drei separate 25-μl-Kuppeln pro Vertiefung einer 12-Well-Platte und lassen Sie die Gelmatrix 15 Minuten lang in einem 37 °C warmen befeuchteten Gewebekulturinkubator aushärten.
  4. Nachdem die Gelmatrix ausgehärtet ist, geben Sie 750 μL Organoidmedium in jede Vertiefung, die Gelmatrixkuppeln enthält. Inkubation bei 37 °C in einem befeuchteten Gewebekulturbrutscher.
    HINWEIS: Die Formulierung der organoiden Medien ist in der Materialtabelle angegeben. Organoide bilden sich typischerweise innerhalb von 4 Tagen nach der ersten Kultur.

4. Genexpressionsanalyse von Endometrium-Organoiden nach Behandlung mit Östradiol

ANMERKUNG: In diesem Abschnitt werden die Methoden beschrieben, die zur Profilierung der Genexpression von Endometriumepithel-Organoiden mittels real-time qPCR nach Behandlung mit Östradiol verwendet werden (E2; siehe Tabelle 1). Da das Endometrium unter der zyklischen Kontrolle des Ovarialhormons E2 steht, ist das Testen der Reaktionsfähigkeit der Organoide auf E2 ein wichtiges Maß für die physiologische Funktion. Wir haben qualitativ hochwertige RNA erhalten und genügend mRNA generiert, um die Genexpression mittels qPCR und/oder RNA-Sequenzierung aus unseren Endometrium-Epithel-Organoiden zu profilieren. In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie Organoide gesammelt und für die nachgelagerte Analyse der Genexpression aufbereitet werden. Das gewählte Behandlungsmedium entspricht demjenigen, das zur Behandlung kultivierter Endometriumzellen verwendet wird. Es ist jedoch zu beachten, dass dieses Behandlungsmedium entsprechend optimiert werden kann, wie es bei der Behandlung von humanen Endometrium-3D-Kulturen mit den Hormonen 8,16,17 der Fall ist.

  1. Kultur der Endometrium-Organoide wie oben beschrieben.
  2. Entfernen Sie das Organoidmedium und ersetzen Sie es vier Tage nach der Aussaat durch 750 μL Hungermedium. Über Nacht inkubieren.
  3. Entfernen Sie am nächsten Morgen das Hungermedium. Fügen Sie 750 μL Behandlungsmedium hinzu, das entweder Vehikel oder 10 nM E2 enthält. Inkubieren für 48 h.
  4. Fahren Sie mit der RNA-Isolierung gemäß dem Protokoll des Kit-Herstellers fort.

5. Histologische Analyse von Endometrium-Organoiden

HINWEIS: Die Abbildung der morphologischen Merkmale von Endometrium-Organoiden ist entscheidend für die Beurteilung der zellulären Wirkung von Wachstumsfaktoren, genetischen Manipulationen oder niedermolekularen Inhibitoren. In diesem Abschnitt werden die Techniken beschrieben, die zur Fixierung, Verarbeitung und Abbildung von Endometriumepithelorganoiden unter Verwendung histologischer Färbungen und Antikörper-Immunfluoreszenzfärbung verwendet werden.

  1. Bereiten Sie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen vor, die 1 mL 4% Paraformaldehyd in 1x PBS enthalten. Legen Sie sie auf Eis.
  2. Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 12-Well-Platte ab, die die Organoide enthält.
  3. Übertragen Sie mit einer 1-ml-Pipettenspitze mit einer geschnittenen Spitze 500 μL 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung und lösen Sie die Gelmatrixdome vorsichtig vom Boden der Platte.
  4. Die gesamten Gelmatrixdome werden vorsichtig in die Pipettenspitze abgesaugt und in das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
  5. Fixieren Sie die Organoide, indem Sie sie über Nacht bei 4 °C auf einen Rotator legen.
  6. Am nächsten Morgen zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 600 × g für 5 Minuten, um die Organoide zu pelletieren. Entfernen Sie die 4%ige Paraformaldehydlösung vorsichtig mit einer Pipette und entsorgen Sie sie. Waschen Sie die Organoide 2x mit 70% Ethanol.
  7. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche alle bis auf 50-100 μL Ethanol aus dem Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen beiseite.
  8. Legen Sie eine Tube Probenverarbeitungsgel für ~ 30 s in ein Wasserbad und in die Mikrowelle, um das Gel zu schmelzen. Stellen Sie sicher, dass das Probenverarbeitungsgel nicht überkocht, indem Sie die Konsistenz des Gels überwachen.
    HINWEIS: Sobald das Probenverarbeitungsgel geschmolzen ist, aber nicht kochend heiß, arbeiten Sie schnell, um die Organoide zu verkapseln.
  9. Übertragen Sie genügend Probenverarbeitungsgel, um die gesamte Oberfläche der Form (ca. 250 μL) zu bedecken.
  10. Während das Probenverarbeitungsgel noch geschmolzen ist, übertragen Sie schnell die 50 μL 70%ige Ethanollösung, die die Organoide enthält. Stellen Sie sicher, dass die Organoide versenkt oder in den unteren Teil der Form gedrückt werden.
  11. Legen Sie die Histologieform auf einen Eimer Eis und lassen Sie das Probenverarbeitungsgel abkühlen und erstarren.
  12. Sobald das Probenverarbeitungsgel vollständig getrocknet ist, übertragen Sie das Probenverarbeitungsgel vorsichtig in einen Probenbeutel und behalten Sie die Ebene im Auge, in der sich die Organoide befinden.
  13. Legen Sie den Beutel in eine Histologiekassette und verarbeiten Sie ihn unter Verwendung von Standardmethoden, die für die Formalinfixierung und die Paraffineinbettung von Gewebenverwendet werden 18.
  14. Nach der Fixierung und Einbettung in Paraffin wird mit einem Mikrotom19 in 5-μm-Abschnitte geschnitten. Fahren Sie mit Standard-Hämatoxylin- und Eosin-Färbungs- oder Immunfärbungsverfahren fort, wie unten beschrieben.

6. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung

  1. Entparaffinieren Sie die Abschnitte wie folgt: Xylol, 2 x 10 min; 100% Ethanol, 2 x 3 min; 80% Ethanol, 3 min; 60% Ethanol, 3 min; dH2O, 2 x 3 min; 1 min in Hämatoxylin; Leitungswasser (3 x 5 s); 1 min in Eosin.
  2. Die Abschnitte wie folgt entwässern: 60% Ethanol, 3 min; 80% Ethanol, 3 min; 95% Ethanol, 3 min; 100% Ethanol, 2 x 3 min; Xylol, 2 x 15 Min.
  3. Montage mit Montagemedium.

7. Immunfluoreszenzfärbung

  1. Entparaffinieren Sie die Abschnitte, wie in Schritt 6.1 beschrieben.
  2. Antigen-Retrieval durchführen
    1. Tauchen Sie die Objektträger in Antigen-Retrieval-Lösung in einem mikrowellengeeigneten Behälter.
    2. Mikrowelle bei hoher Hitze für 20 Minuten in Intervallen von 5 Minuten, um sicherzustellen, dass die Lösung nicht überkocht.
  3. Nachdem der 20-minütige Antigen-Retrieval-Schritt abgeschlossen ist, lassen Sie die Objektträger 40 Minuten lang auf Eis abkühlen, während sie noch in den Antigen-Retrieval-Puffer getaucht sind.
  4. Waschen Sie die Objektträger mit 1x TBST für 3 min
  5. Blockieren Sie die Objektträger, indem Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur in 3% BSA in TBST inkubieren.
  6. Inkubation mit primären Antikörpern
    1. Verdünnen Sie den Antikörper in 3% BSA in TBST (1:50-1:1.000, abhängig von Ab).
    2. Über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer brüten.
    3. 3 x 5 min mit TBST waschen.
  7. Inkubation von sekundären Antikörpern
    1. Verdünnen Sie den Antikörper in 3% BSA (in TBST) (1:250) oder in 5% normalem Eselserum.
    2. Inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln, da der Antikörper an ein Fluorophor konjugiert ist.
  8. Nukleare Färbung
    1. Verdünntes 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) 1:1.000 in TBST.
    2. Inkubieren Sie für 5 min bei RT.
    3. 2 x 5 min mit TBST waschen.
  9. Montage
    1. Verwenden Sie einen Tropfen Montagemedium, um das Deckglas zu montieren.
    2. Versiegeln Sie das Deckglas am nächsten Tag mit Nagellack.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Phasenkontrastaufnahmen von Endometrium-Organoiden der Maus
Wir haben Organoide aus dem WT-Maus-Endometriumepithel etabliert, wie im beigefügten Protokoll beschrieben (siehe Diagramm in Abbildung 1). Nach der enzymatischen Dissoziation des Endometrialepithels der Maus wurden die Epithelschichten mechanisch von den Stromazellen der Gebärmutter getrennt und weiter mit Kollagenase dissoziiert, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Bei korrekter Durchführung sollte diese ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Hier beschreiben wir Methoden zur Erzeugung von Endometriumepithel-Organoiden aus dem Endometrium der Maus und die Protokolle, die routinemäßig für ihre nachgeschaltete Analyse verwendet werden. Endometrium-Organoide sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Mechanismen zu untersuchen, die Endometrium-bedingte Erkrankungen wie Endometriose, Endometriumkarzinom und Implantationsversagen kontrollieren. Bahnbrechende Studien, die 2017 veröffentlicht wurden, berichteten über die Bedingungen für die Kultivierung langfristige...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Stephanie Pangas und Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) für die kritische Lektüre und Bearbeitung unseres Manuskripts. Die Studien wurden durch die Zuschüsse R00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.M.) und R01-HD110038 (M.M.M.) sowie durch NCI-P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123) unterstützt. Diana Monsivais, Ph.D. erhält einen Next Gen Schwangerschaftspreis des Burroughs Wellcome Fund.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Organoid Media Formulation
<>NameCompanyKatalognummer<>Endkonzentration
Corning Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Basalmembranmatrix, *LDEV-freiCorning354230100%
Trypsin aus der bovinen BauchspeicheldrüseSigma AldrichT1426-1G1%
Advanced DMEM/F12Life Technologies126340101X
N2 ErgänzungLife Technologies175020481X
B-27™ Nahrungsergänzungsmittel (50X), abzüglich Vitamin ALife Technologies125870101X
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µ g/mL
N-Acetyl-L-CysteinSigma AldrichA9165-5G1,25 mM
L-GlutaminLife Technologies250300242 mM
NicotinamidSigma AldrichN0636-100G10 nM
ALK-4, -5, -7 Inhibitor, A83-01Tocris2939500 nM
Rekombinantes humanes EGFPeprotechAF-100-1550 ng/ml
Rekombinantes humanes NogginPeprotech120-10C100 ng/mL
Rekombinantes humanes Rspondin-1Peprotech120-38500 ng/mL
Rekombinantes humanes FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
rekombinantes humanes HGFPeprotech100-3950 ng/mL
WNT3aR& D systems5036-WN200 ng/
mLSonstige Verbrauchsmaterialien und Reagenzien
Name><strong>KatalognummerEndkonzentration
Kollagenase aus Clostridium histolyticumSigma AldrichC0130-1G5 mg/ mL
Desoxyribonuklease I aus der bovinen BauchspeicheldrüseSigma AldrichDN25-100MG2 mg/mL
DPBS, kein Calcium, kein MagnesiumThermoFisher14190-2501X
HBSS, kein Calcium, kein MagnesiumThermoFisher141701121X
Falcon  Polystyrol-Mikrotiterplatten (24-Well)Fisher Scientific#08-772-51
Falcon  Mikrotiterplatten aus Polystyrol (12 Well)Fisher Scientific#0877229
Falcon Zellsiebe, 40 & Mikro; mFisher Scientific#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 & Mikro; g)Genesee Scientific11-331
Trizol-ReagenzInvitrogen15596026
DMEM/F-12, HEPES, kein PhenolrotThermoFisher11039021
fötales Rinderserum, Holzkohle abgestreiftSigma AldrichF6765-500ML2%
Estratiol (E2)Sigma AldrichE1024-1G10 nM
Formaldehyd 16% in wässrig Lösung, EM GradeVWR157104%
Epredia Kassette 1 geschlitzte GewebekassettenFisher Scientific1000961
Epredia Edelstahl-Einbettungs-BasisformenFisher Scientific64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%)Fisher Scientific22-032-601 
HistoclearFisher Scientific50-899-90147
Permount EindeckmediumFisher Scientific50-277-97
Epredia Nylon BiopsiebeutelFisher Scientific6774010
HistoGel Gel für die ProbenverarbeitungVWR83009-992
Hämatoxylinlösung PremiumVWR95057-844
Eosin Y (gelblich) Lösung PremiumVWR95057-848
TBS Puffer, 20X, pH 7,4GenDEPORTT80541X
TBST (10X), pH 7,4GenDEPORTT80561X
ZitronensäureSigma AldrichC0759-1KG
Natriumcitrat tribasisches DihydratSigma AldrichS4641-500G
Tween20Fisher ScientificBP337-500 
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma AldrichA2153-100G3%
DAPI Lösung (1 mg/ml)ThermoFisher622481:1000 Verdünnung
VECTASHIELD Antifade EindeckmediumVector LabsH-1000-10
KlarlackFisher ScientificNC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus ObjektträgerFisher Wissenschaftliche22037246
VWR Micro Cover BrilleVWR48393-106
SuperScript VILO Master MixThermoFisher11755050
SYBR Green PCR Master MixThermoFisher4364346
Krt8 Antikörper (TROMA-I) DSHBTROMA-I 1:50 Verdünnung
Vimentin AntobodyCell Signaling5741S1:200 Verdünnung
Esel Anti-Ratte IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundär
Antikörper, Alexa Fluor 594		ThermoFisherA-212091:250 Verdünnung
Esel Anti-Rabbin IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundär
Antikörper, Alexa Fluor 488		ThermoFisherA-21206:250 Verdünnung
ZEISS Stemi 508 Stereo MikroskopZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverses Routinemikroskop mit DigitalkameraZEISS
Primer SequenceForward (5'-3')Reverse (5'-3')_
Lipocalin 2 (Lcn2)GCAGGTGGTACGTTGTGGGCTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf)TGAGGCCTTGGACTCTGTACCCACTTTTCTCTCGTTC
Progesteron (Pgr)CCCACAGGAGTTTTTCAAGCTCTAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Gapdh)CAATGTGTCCGTCGTGGATCTGCCTGCTTCACCTTCTT
1

Referenzen

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84(2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384(2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603(2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623(2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378(2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760(2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making - A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12(2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088(2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102(2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863(2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid". Biology. 11 (7), 987(2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138(2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Developmental Biology. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042(2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610(2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125(2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739(2021).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Uterusepithel3D Organoidkulturmechanische Dissoziationenzymatische DissoziationGenexpressionImmunf rbungstromales KompartimentFluoreszenzmikroskopie
Etablierung von 3D-Endometrium-Organoiden aus der Gebärmutter der Maus
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.