Methodenartikel
Wir berichten über eine flexible Klimakammer mit Tischaufsatz für die Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen mittels aufrecht stimulierter Raman-Streumikroskopie mit Transitsignaldetektion. Lipidtröpfchen wurden in SKOV3-Zellen, die mit Ölsäure behandelt wurden, für bis zu 24 h in einem Zeitintervall von 3 Minuten abgebildet.
Die stimulierte Raman-Streumikroskopie (SRS) ist eine markierungsfreie chemische Bildgebungstechnologie. Die Lebendzellbildgebung mit SRS wurde für viele biologische und biomedizinische Anwendungen demonstriert. Die Langzeit-Zeitraffer-SRS-Bildgebung von lebenden Zellen ist jedoch noch nicht weit verbreitet. Die SRS-Mikroskopie verwendet häufig ein Wasserimmersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur (NA) und einen Ölimmersionskondensator mit hoher NA, um eine hochauflösende Bildgebung zu erzielen. In diesem Fall beträgt der Abstand zwischen Objektiv und Kondensor nur wenige Millimeter. Daher können die meisten kommerziellen Stage-Top-Klimakammern aufgrund ihrer großen Dicke mit einer starren Glasabdeckung nicht für die SRS-Bildgebung verwendet werden. Dieser Artikel beschreibt das Design und die Herstellung einer flexiblen Kammer, die für die Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen mit transmittierter SRS-Signaldetektion auf einem aufrechten Mikroskoprahmen verwendet werden kann. Die Flexibilität der Kammer wird durch die Verwendung eines weichen Materials - einer dünnen Naturkautschukfolie - erreicht. Das neue Gehäuse- und Kammerdesign kann problemlos in ein bestehendes SRS-Bildgebungssystem integriert werden. Die Tests und vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass das flexible Kammersystem eine stabile, langfristige Zeitraffer-SRS-Bildgebung von lebenden Zellen ermöglicht, die in Zukunft für verschiedene Bioimaging-Anwendungen verwendet werden kann.
Die optische Mikroskopie dient der Beobachtung der Mikrostrukturen von Proben. Die optische Bildgebung ist schnell, weniger invasiv und weniger zerstörerisch als andere Technologien1. Die Bildgebung lebender Zellen mit optischer Mikroskopie wurde entwickelt, um die Dynamik kultivierter lebender Zellen über einen langen Zeitraum zu erfassen2. Verschiedene Arten von optischen Kontrasten liefern unterschiedliche Informationen über biologische Proben. Zum Beispiel zeigt die optische Phasenmikroskopie den feinen Unterschied in den Brechungsindizes in der Probe3. Die Fluoreszenzmikroskopie wird häufig v....
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1. Bauen Sie die Umgebungseinhausung des Mikroskops
Anmerkungen: Dieses große Mikroskopgehäuse wird verwendet, um die Temperatur des Mikroskopgehäuses und der zu stabilisierenden Bildgebungsumgebung bei 37 °C zu steuern (Abbildung 1A).
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Wir haben das flexible Kammersystem für die Zeitraffer-SRS-Bildgebung hergestellt und montiert (Abbildung 1 und Abbildung 2) und dann die Leistung des Systems bewertet. Die Temperatur im Inneren des Mikroskopgehäuses erreichte innerhalb von 1 h die erwarteten 37 °C, was die Raumtemperatur nicht wesentlich beeinflusste (Abbildung 3A). Die Temperatur in der flexiblen Kammer erreichte in 1,5 h 37 °C und wurde mindestens 24 h lang stabi.......
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Die Zeitraffer-Lebendzell-SRS-Mikroskopie ist ein alternatives bildgebendes Verfahren zur markierungsfreien Molekülverfolgung. Im Vergleich zur Fluoreszenzmarkierung ist die SRS-Bildgebung frei von Photobleichung, was eine Langzeitüberwachung von Molekülen ermöglicht. Bisher ist das Lebendzell-Bildgebungssystem auf einer aufrechten SRS-Mikroskopie jedoch nicht kommerziell erhältlich. In dieser Arbeit wurde ein Lebendzell-Bildgebungssystem mit einer stabilen, thermisch isolierten Mikroskopgehäusebox und einer flexiblen in.......
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Wir möchten dem Undergraduate Senior Design Team 2019 (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza und James Walsh) an der Binghamton University für das Design, die Herstellung und das Testen der Mikroskopgehäusebox danken. Wir danken Scott Hancock, Olga Petrova und Fabiola Moreno Olivas von der Binghamton University für die hilfreichen Gespräche. Diese Forschung wurde von den National Institutes of Health unter der Fördernummer R15GM140444 unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ein im Labor gebautes SRS-Mikroskop | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz Lock-in-Verstärker | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Irisblende | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematische Spiegelhalterung | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Mikroskoprahmen | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorisierter Mikroskopietisch | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Öl-Immersions-Kondensor (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Wasser-Immersionsobjektiv (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materialien und Teile für das Mikroskopgehäuse (31'' x 29'' x 28'' L x B x H) | |||
| Airtherm Heizungsmodul | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm Heizungsregler, CO2 und Feuchtigkeitsmonitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Luft/CO2 Mischermodul | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexibler Kanalschlauch (2-1/2'' ID, 2-3/4'' AD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| Hochtemperatur-Glas-Glimmer-Keramik, leicht zu bearbeiten (6'' x 6'', 1/4'' Dicke) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonatplatten (Dicke 0,25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silikonkautschukplatten (36'' x 36'', Dicke 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materialien und Teile für die flexible Kammer | |||
| Heizplatte | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| Hochreiner Inline-Filter, 1/4 | NPT McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Lochsäge (Schnittdurchmesser 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Lochsäge (Schnittdurchmesser 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| Hochtemperatur-Silikonkautschukschlauch, weich, 2 mm ID, 5 mm AD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline-Filter (1/4 NPT, 40 Mikron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Mehrzweck 6061 Aluminium-Rundrohr (1/8'' Wandstärke, 4' ' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Mehrzweck 6061 Aluminium-Rundrohr (3/4'' Wandstärke, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Mehrzweck 6061 Aluminiumstange (12'' x 12'', Dicke 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Mehrzweck 6061 Aluminiumstange (8'' x 8'', Dicke 3/8' ') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objektivrevolver (einzeln) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Probenhalter (modifiziert) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultradünne Naturkautschukfolie (Dicke 0,01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vakuumierbares Glasgefäß | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fidschi) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS-Bildgebungssoftware | |
| Materialien für die Bildgebung lebender Zellen | |||
| Cover sterile Kulturschalen mit Glasboden (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Elektronenmikroskopie Wissenschaft (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM Zellkulturmedium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor Fluoreszenzfarbstoff DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Ölsäure | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 Zelllinie | ATCC | HTB-77 |
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