In vitro Methode zur Untersuchung geschlechtsspezifischer Unterschiede in Bindehautbecherzellen

Summary

Phenolrotfreies/fetales Rinderserum-freies Medium ist eine bessere Option als fortschrittliches RPMI, um exogene Hormone zu eliminieren, ohne die normale Funktion der Bindehautbecherzellen bei der Untersuchung von geschlechtsspezifischen Unterschieden zu verändern.

Abstract

Trockenes Auge ist eine multifaktorielle Erkrankung, die die Gesundheit der Augenoberfläche beeinträchtigt, mit einer deutlich höheren Prävalenz bei Frauen. Die Störung des gelbildenden Mucins, das von Bindehautbecherzellen (CGCs) auf die Augenoberfläche abgesondert wird, trägt zu mehreren Erkrankungen der Augenoberfläche bei. Die Eliminierung exogener Sexualhormone ist unerlässlich, um konsistente Ergebnisse bei der In-vitro-Untersuchung von geschlechtsspezifischen Unterschieden in CGCs zu erhalten. Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Minimierung des Vorhandenseins exogener Hormone bei der Untersuchung geschlechtsspezifischer Unterschiede in CGCs bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer physiologischen Funktion. CGCs von postmortalen menschlichen Spendern beiderlei Geschlechts wurden aus Stücken der Bindehaut in RPMI-Medium mit 10% fötalem Kälberserum (FBS) (als vollständiges Medium bezeichnet) bis zur Konfluenz kultiviert. Knapp 48 Stunden vor Beginn der Versuche wurden CGCs in RPMI-Medium ohne Phenolrot oder FBS, aber mit 1% BSA (als phenolrotfreies Medium bezeichnet) überführt. Die normale zelluläre Funktion wurde untersucht, indem der Anstieg des intrazellulären [Ca 2+] ([Ca²⁺]_i) nach Carbachol-Stimulation (Cch, 1 x ^10-4 M) mittels Fura-2/Acetoxymethyl (AM)-Mikroskopie gemessen wurde. Das Ergebnis zeigt, dass CGCs nach 48 h ihre normale Funktion in den phenolrotfreien Medien aufrechterhielten. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der [Ca²⁺]_i-Reaktion zwischen phenolrotfreiem RPMI-Medium und vollständigem Medium nach Cch-Stimulation beobachtet. Daher empfehlen wir die Verwendung des phenolrotfreien RPMI-Mediums mit 1% BSA, um exogene Hormone zu eliminieren, ohne die normale Funktion von CGCs bei der Untersuchung von geschlechtsspezifischen Unterschieden zu verändern.

Introduction

Geschlechtsspezifische Unterschiede betreffen mehrere Prozesse der Augenoberfläche ^1,2,3. Die klinische Manifestation dieser geschlechtsspezifischen Unterschiede ist der Unterschied in der Prävalenz vieler Augenoberflächenerkrankungen zwischen Männern und Frauen, wie z. B. trockenes Auge und Bindehautentzündung ^4,5,6. Es gibt Hinweise darauf, dass geschlechtsspezifische Unterschiede auf mehreren biologischen Ebenen entstehen, einschließlich der unterschiedlichen Profile von Genen auf....

Protocol

Sämtliches menschliches Gewebe wurde mit vorheriger informierter Zustimmung und Genehmigung des Spenders für die Verwendung in der wissenschaftlichen Forschung an die Augenbank gespendet. Die Verwendung des menschlichen Bindehautgewebes wurde vom Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee überprüft und als ausgenommen eingestuft und nicht der Definition von Forschung mit menschlichen Probanden entsprechend.

1. Primäre menschliche Kelchzellkultur

1. Aus der Augenbank wird menschliches Bindehautgewebe^{entnommen 16}.
2. Bereiten Sie das Nährmedium, RPMI-1640 Nährmedium, ergänzt mit 10....

Results

Humane CGCs in Primärkultur wachsen in etwa 14 Tagen auf 80% Konfluenz. Der Zelltyp wurde durch Immunfluoreszenzfärbung mit Antikörpern gegen die Becherzellmarker CK7 und HPA-1²⁵ bestätigt (Abbildung 1). Auch wenn die Entfernung von FBS aus dem Medium die Sexualhormone eliminieren kann, könnte das Fehlen von FBS möglicherweise die zelluläre Reaktion beeinflussen. Um die Hormoneliminierungsmethode zu verifizieren, wurde ein cholinerger Agonist (Carbachol, Cch 1 × ^.......

Discussion

Die Untersuchung der geschlechtsspezifischen Unterschiede im Augengewebe hilft, die Prozesse von Krankheiten zu verstehen, insbesondere des trockenen Auges und der allergischen Bindehautentzündung, von denen ein Geschlecht überproportional betroffen ist ^4,5,6. Auch wenn für diese Studien Tiermodelle verwendet werden können, sind Daten, die direkt aus menschlichem Gewebe gewonnen werden, aufgrund der höchsten Ähnlichkeit mit den .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05 % Trypsin mit 1x EDTA	Gibco (Grand Island, NY)	25300-054
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure	Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)	BP310-500
Advanced RPMI media	Gibco (Grand Island, NY)	12633020
Carbachol	Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)	144,86
Fötales Bovin-Serum	Forschung & Forschung D (Minneapolis, MN)	S11150H
Fura-2-Acetoxymethylester	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	F1221
Menschliches Bindehautgewebe	Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)	N/A
anorganisches Salz für KRB-Puffer	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)		Jede Marke wirkt
L-Glutamin	Lonza Group (Basel, Schweiz)	17-605F
nicht-essentielle Aminosäuren	Gibco (Grand Island, NY)	11140-050
Penicillin/Streptomycin	Gibco (Grand Island, NY)	15140-122
phenolrotfreie RPMI-Medien	Gibco (Grand Island, NY)	11835055
Pluronsäure F127	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	P2443-250G
RPMI-1640 Kulturmedium	Gibco (Grand Island, NY)	21875034
Skalpell	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	12460451	Jedes sterile chirurgische Skalpell kann
mit Natriumpyruvat	Gibco (Grand Island, NY)	11360-070
Sulfinpyrazon	MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)	S9509-5G