Methodenartikel

Agarose-Flüssiggele, die durch Scherverarbeitung während der Gelierung für suspendierten 3D-Biodruck gebildet werden

DOI:

10.3791/64458

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26. Mai 2023

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1Department of Pharmacy, University of Huddersfield, 2School of Chemical Engineering, University of Birmingham, 3Chemical and Biological Engineering, University of Colorado Boulder, 4School of Biological Sciences, University of Manchester

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Scherverarbeitung während der Hydrogelbildung führt zur Herstellung von Mikrogelsuspensionen, die scherdünn sind, sich aber nach Beseitigung der Scherkräfte schnell restrukturieren. Solche Materialien wurden als Stützmatrix für das Bioprinting komplexer, zellbeladener Strukturen verwendet. Hier werden Verfahren zur Herstellung des Stützbettes und kompatibler Biotinten beschrieben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Verwendung von granularen Matrices zur Unterstützung von Bauteilen während des Bioprinting-Prozesses wurde erstmals 2015 von Bhattacharjee et al. beschrieben, und seitdem wurden mehrere Ansätze für die Herstellung und Verwendung von unterstützenden Gelbetten im 3D-Bioprinting entwickelt. In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Herstellung von Mikrogelsuspensionen unter Verwendung von Agarose (bekannt als flüssige Gele) beschrieben, bei dem die Partikelbildung durch die Anwendung von Scherung während der Gelierung gesteuert wird. Durch diese Verarbeitung entstehen sorgfältig definierte Mikrostrukturen mit anschließenden Materialeigenschaften, die sowohl chemisch als auch mechanisch deutliche Vorteile gegenüber der Einbettung von Druckmedien bieten. Dazu gehören das Verhalten als viskoelastische, festkörperartige Materialien bei Nullscherung, die Begrenzung der Diffusion über große Entfernungen und die Demonstration des charakteristischen scherverdünnenden Verhaltens von ausgeflockten Systemen.

Bei der Beseitigung von Scherspannungen haben flüssige Gele jedoch die Fähigkeit, ihre elastischen Eigenschaften schnell wiederzuerlangen. Dieser Mangel an Hysterese steht in direktem Zusammenhang mit den definierten Mikrostrukturen, auf die zuvor hingewiesen wurde. Aufgrund der Verarbeitung erleichtern reaktive, nicht gelierte Polymerketten an der Partikelgrenzfläche Wechselwirkungen zwischen den Partikeln - ähnlich einem Velcro-Effekt. Diese schnelle Wiederherstellung der elastischen Eigenschaften ermöglicht das Bioprinting von hochauflösenden Teilen aus niedrigviskosen Biomaterialien, da die schnelle Umformung des Stützbetts die Biotinte in situ einschließt und ihre Form beibehält. Ein weiterer Vorteil von Agarose-Flüssiggelen sind die asymmetrischen Gelier-/Schmelzübergänge (Geliertemperatur von ~30 °C und Schmelztemperatur von ~90 °C). Diese thermische Hysterese der Agarose ermöglicht es, das biogedruckte Teil in situ zu drucken und zu kultivieren, ohne dass das unterstützende flüssige Gel schmilzt. Dieses Protokoll zeigt, wie flüssige Agarosegele hergestellt werden, und demonstriert ihre Verwendung zur Unterstützung der Herstellung einer Reihe komplexer Hydrogelteile im Rahmen der additiven Fertigung mit suspendierten Schichten (SLAM).

Einleitung

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Hydrogele sind perfekte Materialien, um das Zellwachstum zu unterstützen1. Je nach verwendetem Material gelieren sie über sanfte Mechanismen, die die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigen 2,3. Der hohe Wassergehalt (typischerweise >90 %) bedeutet, dass Nährstoffe und Sauerstoff leicht in das Material diffundieren können und Abfallprodukte des Zellstoffwechsels ausdiffundieren4. So hat sich gezeigt, dass die Lebensfähigkeit von Zellen über Zeiträume von mehr als 1 Jahr erhalten bleibt5, und es gibt jetzt Beispiele für Hydrogele, die verwendet werden, um Zellen für zukünftige therapeutische Zwecke zu lagern oder zu "pausieren"6. Sie werden in der Gewebezüchtung häufig zur Herstellung gewebeähnlicher Strukturen eingesetzt, aber ihre Verwendung ist tendenziell durch die Schwierigkeit begrenzt, sowohl die Struktur als auch die Zusammensetzung des Materials zu kontrollieren. Historisch gesehen ist die Hydrogelfestigkeit aufgrund des hohen Wassergehalts und der geringen Volumina, die von der Polymermatrix, die die Struktur bildet, eingenommen wird, vergleichsweise gering (im Vergleich zu vielen Hartgeweben). Darüber hinaus bieten viele Wege zur Gelierung (thermisch, ionotrop, Fibrillogenese) eine relativ langsame Kinetik, was bedeutet, dass sich ihre mechanischen Eigenschaften mit der Zeit stetig entwickeln. Mit Ausnahme von sich gegenseitig durchdringenden Netzwerken führen eine geringe mechanische Steifigkeit und langsame Aushärtungszeiten häufig dazu, dass Biotinten bei der Abscheidung nicht frei stehen können und dazu neigen, bei der ersten Extrusion zu "sacken" und an Definition zu verlieren.

Um dieses Schlüsselproblem zu lösen, wurden eingebettete Drucktechniken entwickelt, die beim Drucken unterstützen, während sich die mechanischen Eigenschaften des Konstrukts entwickeln 7,8. Sobald sich die Mikrostruktur des Gels vollständig entwickelt hat und die mechanischen Eigenschaften ein Optimum erreicht haben, kann die Trägermatrix entfernt werden, typischerweise durch schonendes Waschen oder Schmelzen der Trägerphase. Erste Arbeiten zu diesem Ansatz verwendeten eine viskose pluronische Dispersion, in der die Sekundärphase verteilt war9. In jüngerer Zeit verwendeten Bhattacharjee et al. Gele in Form von granuliertem Carbopol, um zu zeigen, dass Zellanordnungen im Stützgel10 suspendiert werden können. Anschließend berichteten Hinton et al. über die Extrusion von gelbasierten Materialien, die Zellen enthalten, in ein Trägerbett, das aus einer Mikrogelsuspension bestand, die aus körniger Gelatine11 gebildet wurde. Nach der Extrusion des zellhaltigen Hydrogels und dessen anschließender Aushärtung wurde die Gelatine durch sanftes Erhitzen des Trägerbades entfernt, wodurch ein Schmelzen der Gelatine möglich wurde. Leider weist dieser Prozess immer noch einige Einschränkungen auf. Zum Beispiel ist die chemische Struktur von Gelatine im Vergleich zu Kollagen (folglich ist sie eine hydrolysierte Form von Kollagen) so, dass viele chemische Einheiten in ihrem Rückgrat mit biologischen Einheiten interagieren können; So könnte eine verbleibende Stützmatrix nachgelagerte biologische Prozesse stören. Darüber hinaus stellen tierische Produkte eine restriktive Verwendung dar, wenn es um die Übersetzbarkeit einer Technologie geht. Dies stellt eine Herausforderung dar, wenn das hergestellte Teil für den klinischen Einsatz vorgesehen ist oder wenn es sogar zur Beantwortung grundlegender biologischer Fragen verwendet werden soll, bei denen diese Oberflächenkontamination ein erhebliches Problem verursachen kann.

In der Folge haben wir ein verfeinertes Verfahren entwickelt, das die Herstellung von Hydrogelen in der Schwebe innerhalb einer unterstützenden Matrix ermöglicht, die unter physiologischen Bedingungen keine Ladung aufweist und aus nicht-tierischen Materialien gebildet wird. Obwohl das Verfahren mit einer Reihe von biopolymeren Trägern verwendet werden kann, bietet Agarose ein Material, das gegenüber biologischen Wechselwirkungen inert ist, da es auf Zucker basiert und bei physiologischem pH-Wertvon 12,13 neutral geladen ist. Anstatt ein bereits vorhandenes Gel zu fragmentieren, wird das Trägermaterial durch das Aufbringen von Scherung während der Gelierunggebildet 14,15,16. Dadurch entsteht eine Matrix von Partikeln, die an ihrer Oberfläche dendronartige Merkmale aufweisen und in einer sekundären Matrix aus ungelliertem Polymer17,18 dispergiert sind. Das Ergebnis ist ein Material mit interessanten Materialeigenschaften 19,20,21,22, das in ähnlicher Weise wie zuvor beschriebene körnige Gele scherdünn werden kann, aber dazu neigt, die Viskosität schneller wiederherzustellen, wenn die Scherung entfernt wird 23. Sobald das zelltragende Material, das in die Trägermatrix extrudiert wird, vollständig ausgereift ist, kann die Stützmatrix durch sanftes Rühren entfernt werden, bevor es in Kultur gegeben wird. Es hat sich gezeigt, dass es möglich ist, mit diesem Verfahren Materialien mit komplexen Strukturen herzustellen und die biologischen Strukturen sowohl der Haut als auch der osteochondralen Region zu rekapitulieren23,24,25. Dieses Methodenpapier beschreibt detailliert, wie das Trägermaterial hergestellt wird, und hebt geeignete Biotinten hervor, die in einer Vielzahl komplexer Strukturen verwendet werden.

Protokoll

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HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Vorbereitung des Fluidgel-Suspensionsbettes

  1. Bereiten Sie 1.000 ml dispergierte Agarose (0,5 Gew.-%) vor, indem Sie 5 g Agarosepulver zu 1.000 ml Reinstwasser (Typ 1, >18 mΩ·cm-1) in einer 2.000-ml-Glasflasche hinzufügen.
  2. Geben Sie einen 70-mm-Magnetrührstab in die wässrige Mischung und sichern Sie den Flaschenverschluss, indem Sie ihn zuerst fest anziehen und dann um eine Vierteldrehung lösen.
  3. Lösen Sie die Mischung auf und sterilisieren Sie sie, indem Sie die Glasflasche in den Korb des Autoklaven stellen, den Deckel schließen und einen Zyklus von 15 Minuten bei 121 °C und 1 Bar durchlaufen lassen.
    HINWEIS: Dieses Protokoll wird immer für Autoklavierungslösungen in weiteren Schritten verwendet.
  4. Nehmen Sie die Flasche aus dem Autoklaven, sobald der Autoklav auf 80 °C abgekühlt ist, und stellen Sie sie auf einen Magnetrührer (unbeheizt), wobei das Rühren auf 800 U/min eingestellt ist.
    ACHTUNG: Die Flasche und die Flüssigkeit bleiben heiß.
  5. Kühlen Sie das Sol unter Umgebungsbedingungen unter ständigem Rühren ab, bis die Temperatur unter seinem T-Gel (Gelierpunkt) von 32 °C liegt.
  6. Nehmen Sie die Flasche aus dem Rührer und lagern Sie sie bei 4 °C.
    Anmerkungen: Das flüssige Gel kann bis zur Verwendung aufbewahrt werden.

2. Herstellung von Biotinten

  1. Bereiten Sie eine Biotinte auf Gellanbasis mit einem 1%igen (w/w) Sol von Gellangummi mit niedrigem Acylgehalt in Reinstwasser (Typ 1, >18 mΩ·cm-1) vor.
    1. 0,5 g Gellanpulver in ein Wiegeschiff geben.
    2. Geben Sie 49,5 g Reinstwasser zusammen mit einem Magnetrührer in eine 100-ml-Glasflasche.
    3. Falten Sie das Wiegeschiffchen mit Gellan-Power in zwei Hälften und geben Sie das Pulver langsam unter ständigem Rühren in das Wasser.
    4. Das Sol mit einem Autoklaven auflösen, sterilisieren und auf 20 °C abkühlen lassen.
    5. Lagern Sie die Biotinte bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
  2. Bereiten Sie eine Pektin-Kollagen-gemischte Biotinte in Reinstwasser (Typ 1, >18 mΩ·cm-1) vor.
    1. Bereiten Sie 5%ige (w/v) methoxypektinarme Lösungen vor, indem Sie 2,5 g Pektinpulver in ein Wiegeschiff abwiegen.
    2. Geben Sie 50 ml Reinstwasser zusammen mit einem Magnetrührer in eine 100-ml-Glasflasche.
    3. Falten Sie das Wiegeschiffchen mit Pektinkraft in zwei Hälften und geben Sie das Pulver langsam unter ständigem Rühren in das Wasser.
    4. Die wässrige Mischung autoklavieren und auf 20 °C abkühlen lassen.
    5. Stellen Sie Pektin-Kollagen-Mischungen im Verhältnis 1:1 und 2:1 her, indem Sie entweder 3 ml der Pektinlösung zu 3 ml Kollagenlösung oder 4 ml der Pektinlösung zu 2 ml Kollagenlösung hinzufügen. Mischen Sie die Mischungen vorsichtig mit einer Pipette, indem Sie die Mischung 10x herausziehen und dosieren.
      Anmerkungen: Dieses Verfahren wird am besten mit kalten Materialien auf Eis durchgeführt, um eine vorzeitige Gelierung des Kollagens zu verhindern. Die Vorkühlung von Pektin und Kollagen kann durch Lagerung bei 4 °C vor dem Mischen erreicht werden.
    6. Bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C lagern.
  3. Bereiten Sie eine Alginat-Kollagen-gemischte Biotinte in Reinstwasser (Typ 1, >18 mΩ·cm-1) vor.
    1. 2 g Alginatpulver in ein Wiegeschiff geben.
    2. Geben Sie 50 ml Reinstwasser zusammen mit einem Magnetrührer in eine 100-ml-Glasflasche.
    3. Falten Sie das Wiegeschiffchen mit Alginatkraft in zwei Hälften und geben Sie das Pulver langsam unter ständigem Rühren in das Wasser.
    4. Die Dispersion unter ständigem Rühren auf 60 °C erhitzen, bis sich das Alginat vollständig aufgelöst hat (klare, leicht braune Flüssigkeit), und dann auf 20 °C abkühlen.
    5. Verdünnen Sie die Alginatlösung mit Zellkulturmedium, wie z. B. Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM), indem Sie 25 ml der Alginatlösung zu 25 ml DMEM hinzufügen.
    6. Bereiten Sie Alginat-Kollagen-Mischungen (1:1) vor, indem Sie 3 ml der Alginat/DMEM-Lösung zu 3 ml Kollagenlösung hinzufügen. Mischen Sie die Mischungen vorsichtig mit einer Pipette, indem Sie die Mischung 10x herausnehmen und dosieren und bei 4 °C lagern.
      Anmerkungen: Dieses Verfahren wird am besten mit kalten Materialien auf Eis durchgeführt, um eine vorzeitige Gelierung des Kollagens zu verhindern. Die Vorkühlung von Pektin und Kollagen kann durch Lagerung bei 4 °C vor dem Mischen erreicht werden.

3. Rheologische Charakterisierung von Biotinten

  1. Schalten Sie das Rheometer ein, setzen Sie 40 mm gezackte Geometrien ein und lassen Sie es 30 Minuten stehen.
  2. Nullen Sie die Spalthöhe des Rheometers mit der Null-Spalthöhen-Funktion.
  3. Fügen Sie ~2 ml Probe auf die Bodenplatte hinzu und senken Sie die obere Geometrie ab, um eine Spalthöhe von 1 mm zu erzielen.
  4. Trimmen Sie die Probe, indem Sie überschüssiges Material entfernen, das zwischen den Platten ausgestoßen wurde. Verwenden Sie dazu eine flache, nicht scheuernde Kante, um überschüssige Flüssigkeit aus dem Spalt zu ziehen, und saugen Sie sie mit Seidenpapier auf.
    HINWEIS: Die Schritte 3.2 bis 3.4 werden wiederholt, um die Probe vor jedem der folgenden Schritte zu wechseln.
  5. Führen Sie Viskosimetrieprofile durch, um die Injizierbarkeit der Biotinte zu bestimmen.
    1. Wählen Sie Viskosimetrietest aus den Benutzeroptionen aus.
    2. Geben Sie die Parameter für einen schergeschwindigkeitsgesteuerten Rampenversuch ein: 0,1 bis 500 s-1 mit einer Rampenzeit von 1 min.
    3. Wiederholen Sie den Viskosimetrie-Rampentest an neuen Proben unter Spannungskontrolle unter Verwendung der oberen und unteren Spannungen, die aus dem schergeschwindigkeitsgesteuerten Rampentest in Schritt 3.5.2 ermittelt wurden.
  6. Führen Sie kleine Verformungstests durch, um die Geliereigenschaften der Biotinte zu bestimmen.
    1. Wählen Sie oszillatorische Tests aus den Benutzeroptionen aus.
    2. Eingabeparameter in einen Einzelfrequenztest unter konstanter Dehnung: Frequenz 1 Hz, Dehnung 0,5 % über 1 h, während die Tinte geliert.
  7. Durchführung von In-situ-Amplituden- und Frequenzmessungen an gelierten Proben.
    1. Wählen Sie Oszillationstest aus den Benutzeroptionen .
    2. Wählen Sie den Amplituden-Sweep und geben Sie die Parameter für einen Amplituden-Sweep-Test ein, der dehnungsgesteuert ist: 0,01 bis 500 % bei einer konstanten Frequenz von 1 Hz .
    3. Laden Sie eine neue Probe und wählen Sie Oszillationstest aus den Benutzeroptionen. Wählen Sie dann den Frequenztest und geben Sie Frequenzparameter zwischen 0,01 und 10 Hz und eine Dehnung aus, die innerhalb des linearen viskoelastischen Bereichs (LVR) der Spektren liegt, die aus den in Schritt 3.7.2 erhaltenen Amplituden-Sweep-Daten ermittelt wurden (typischerweise ein Wert zwischen 50 % und 80 % des LVR).

4. Entwerfen und Drucken von 3D-Strukturen mit einem 3D-Biodrucker

  1. Starten Sie die CAD-Software , um die Generierung eines CAD-Modells zu starten.
    1. Wählen Sie Extras | Materialien in der CAD-Software, um die Druckparameter für die gewählte Biotinte zu definieren.
    2. Eingabe von Druckparametern, die für den verwendeten Drucker relevant sind; Geben Sie beispielsweise für die 3D-Erkennung den geschätzten Filamentdurchmesser (~200-500 μm für die meisten Biotinten) in die Registerkarte Dicke ein, um die Z-Dicke jeder Schicht zu bestimmen.
      HINWEIS: Die Delamination des endgültigen Konstrukts weist darauf hin, dass der Dickenwert erhöht werden muss, während der Auflösungsverlust die Notwendigkeit einer Reduzierung der Dicke unterstreicht.
    3. Entwerfen Sie die gewünschte Struktur Schicht für Schicht über die Registerkarten Ebene in der Software. Gruppieren Sie die Layer auf der Registerkarte Gruppieren, und weisen Sie jeden Layer auf der Registerkarte Ebene einer Ebene auf der Z-Ebene zu.
      1. Um beispielsweise eine Gitterstruktur zu erzeugen (unter Verwendung einer in Schritt 2.3 hergestellten Biotinte mit Alginat-Kollagen-Mischung), erstellen Sie eine Schicht mit den Filamenten entlang der x-Achse und eine zweite Schicht mit den Filamenten entlang der y-Achse. Weisen Sie beide einer separaten Ebene zu.
    4. Bestimmen Sie auf der Registerkarte Gruppe die Bauhöhe, indem Sie die Anzahl der sich wiederholenden Einheiten in der Struktur auswählen.
    5. Klicken Sie auf das Werkzeug Generieren , um einen G-Code für den Entwurf zu erstellen und ein 3D-Rendering der Struktur anzuzeigen.
  2. Schließen Sie BioCAD und starten Sie die Mensch-Maschine-Schnittstelle (HMI) 3D Discovery, um den Druckvorgang zu starten.
    1. Montieren Sie den Druckkopf gemäß den Anweisungen des Herstellers. Montieren Sie das Mikroventil am Druckkopf und schrauben Sie die gewählte Extrusionsdüse ein.
    2. Klicken Sie auf die Funktion Nadellängenmessung , um den Druckkopf zu kalibrieren.
    3. Legen Sie ein Kulturgefäß (z. B. eine 6-Well-Platte) auf die Druckplattform.
    4. Aliquotieren Sie die Biotinte in die Druckpatrone und schrauben Sie sie in den Druckkopf oberhalb des Mikroventils.
    5. Schließen Sie den montierten Druckkopf an das pneumatische Drucksystem an und wählen Sie den Druckkopf auf dem HMI aus, um ihn einzuschalten.
    6. Klicken Sie auf Druck prüfen , um die Einstellung des Extrusionsdrucks zu ermöglichen.
    7. Sobald ein geeigneter Druck ausgewählt wurde (~30-120 kPa je nach gewünschter Auflösung), öffnen Sie den zuvor generierten G-Code und klicken Sie auf Ausführen , um den Druckvorgang zu starten.

5. Herstellung von Hautanaloga

  1. Kultivieren Sie humane dermale Fibroblasten (HDFs) und aus Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ADSCs) in DMEM, ergänzt mit fötalem Kälberserum (FBS) (10 %), HEPES-Puffer (2,5 %) und Penicillin/Streptomycin (1 %), in T75-Flaschen, bis eine Konfluenz von 90 % erreicht ist. Kultivieren Sie humane epidermale Keratinozyten (HEKs) in Keratinozyten-Nährmedien (KGM), bis eine Konfluenz von 70%-80% erreicht ist. Halten Sie alle Zellen während der Kultur unter Bedingungen von 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luft in einem Inkubator.
  2. Für die Herstellung von HDFs und ADSCs für dermale und fetthaltige Biotinten waschen Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig 3 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in Kolben pipettieren, den Kolben kippen, um das PBS über die Zellen zu wirbeln, und aspirieren, wobei Sie darauf achten müssen, die anhaftenden Zellen nicht zu stören.
    1. Um die Zellen anzuheben, pipettieren Sie 3 ml 1x Zelldissoziationsenzym in den Kolben, um die Zellen zu bedecken, und stellen Sie den Kolben für 3 Minuten in einen Inkubator, wobei Sie den Kolben fest gegen die Handfläche klopfen, um die Zellen zu entfernen. Neutralisieren Sie die Wirkung des Enzyms mit 6 ml vollständigem DMEM.
      Anmerkungen: Weitere 2 Minuten inkubieren, wenn die Zellen nach dem Klopfen anhaften.
    2. Für die Herstellung der dermalen und adipösen Biotinten pipettieren Sie die Zellsuspensionen in separate 15-ml-Röhrchen und entnehmen Sie jeweils 10 μl für die Zellzählung mit einem Hämozytometer. Zentrifugieren Sie die restlichen Zellsuspensionen bei 300 × g für 5 Minuten, um die Zellen zu pelletieren.
    3. Saugen Sie den Überstand an und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören, fügen Sie die entsprechende Polymerlösung (hergestellt in Schritt 2.2) hinzu und mischen Sie unter sanfter Stimulation durch Pipettieren mit den folgenden Dichten:
      1. Für die Fettschicht pipettieren Sie 5 × 105 ADSCs mL-1 pro 1:1 Kollagen-Pektin-Mischung.
      2. Für die Papillarschicht pipettieren Sie 3 × 106 HDFs ml-1 pro 2:1 Kollagen-Pektin-Mischung.
      3. Für die retikuläre Schicht pipettieren Sie 1,5 × 106 HDFs ml-1 pro 2:1-Kollagen-Pektin-Mischung .
  3. Legen Sie zum Drucken jede Biotinte in eine separate Patrone und drucken Sie das Konstrukt in dem unterstützenden flüssigen Gel in einer Petrischale aus Glas gemäß den Anweisungen in Abschnitt 4.
    1. Sobald der Druck abgeschlossen ist, injizieren Sie 2 ml 200 mM CaCl2∙2H2Oum das Konstrukt herum und 3 ml adipogene Medien (vollständiges DMEM, ergänzt mit 500 μM Isobutylmethylxanthin [IBMX], 50 μM Indometacin und 1 μM Dexamethason) mit einer Spritze und einer Nadel in das flüssige Gel. Über Nacht in einen Inkubator geben.
    2. Am nächsten Tag das Konstrukt mit einem Spatel aus dem Stützbad nehmen, vorsichtig in PBS waschen und 14 Tage lang in adipogenem Medium in einer 6-Well-Platte kultivieren.
    3. Entfernen Sie nach 14 Tagen so viel Medium, dass eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche an der Oberfläche des Konstrukts entsteht, und säen Sie 2 × 106 Keratinozyten auf das Konstrukt, um eine epidermale Schicht zu bilden.
    4. Kultivieren Sie weitere 1 Woche vor der Analyse.

6. Anfertigung des Modells der Halsschlagader

  1. Legen Sie die Gellangummi-Biotintenlösung (wie in Schritt 2.1 vorbereitet) in eine Druckerpatrone ein.
  2. Drucken Sie das Modell der Halsschlagader in einer Petrischale aus, die das flüssige Gel-Trägermaterial gemäß den Druckanweisungen in Abschnitt 4 enthält.
  3. Sobald der Druck abgeschlossen ist, injizieren Sie 2 ml 200 mM CaCl2∙2H2Omit einer Spritze und einer Nadel um das Konstrukt herum.
  4. Nach mindestens 3 Stunden das Konstrukt mit einem Spatel aus dem Stützbad nehmen und vorsichtig in PBS waschen.

Ergebnisse

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Biotinte von Alginat und Kollagen Typ I
Es wurde beobachtet, dass die Druckauflösung (aufgezeichnet als Funktion des Filamentdurchmessers) direkt über Änderungen des Extrusionsdrucks einstellbar ist (Abbildung 1A-C). Der Extrusionsdruck und die Druckauflösung standen in direktem Zusammenhang mit den kleinsten Filamentdurchmessern, die durch den Druck bei einem Extrusionsdruck von 30 kPa erzeugt wurden. Interessanterweise konnten bei einem Extrusionsdruck von 30 kPa Filamente erzeugt werden, die dem Innendurchmesser der Extrusionsdüse entsprachen (mittlerer Filamentdurchmesser: 323 μm ± 50 μm; Düsendurchmesser: 300 μm), was darauf hindeutet, dass eine "maximale Auflösung" erreicht werden konnte. Darüber hinaus konnten die Druckparameter für diese Auflösung erfolgreich auf die Erzeugung eines Alginat/Kollagen-Gefäßröhrchens angewendet werden, das extrahiert und perfundiert werden kann (Abbildung 1D).

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Abbildung 1: Erzeugung von hochauflösenden Ausdrucken mittels SLAM. Anpassung der Druckauflösung von Alginat/Kollagen-Gittern in Abhängigkeit vom Filamentdurchmesser durch Extrusion bei (A) 30 kPa, (B) 60 kPa und (C) 120 kPa. (D) Erzeugung eines Alginat/Kollagen-Gefäßschlauchs. Maßstabsbalken = 400 μm (A-C), 10 mm (D). Abkürzung: SLAM = Suspended Layer Additive Manufacturing. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Haut-Analoga
SLAM wurde auch verwendet, um eine hautähnliche Struktur zu erzeugen (Abbildung 2A) unter Verwendung einer Biotinte, die aus einer Mischung von Kollagen I und Pektin gebildet wird. Um einen Gradienten der mechanischen Eigenschaften zu erreichen, der denen in der Haut ähnelt, wurden unterschiedliche Anteile von Pektin und Kollagen in der dermalen (5 % w/w Pektin gemischt im Verhältnis 2:1 mit einem Kollagenstock von 5 mg∙mL− 1) und im hypodermalen (5 % w/w Pektin gemischt im Verhältnis 1:1 mit einem Kollagenstock von 5 mg∙mL−1 ) verwendet. Die resultierende Struktur (Abbildung 2Bi-Bii) war nach dem Eintauchen in DMEM gut integriert, ohne Anzeichen von Delamination. Wichtig ist, dass nach einem Zeitraum von 14 Tagen Kultur ein hohes Maß an Zellviabilität in der gesamten Struktur (Abbildung 2Biii) bestand. Interessanterweise versteiften sich die Materialien im Laufe der Kulturperiode24, was auf eine Umgestaltung des Materials hindeutet.

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Abbildung 2: Herstellung einer hautähnlichen Struktur . (A) Eine schematische Darstellung, die zeigt, wie der SLAM-Prozess verwendet wurde, um eine Schichtstruktur zu erzeugen, die in menschliche dermale Fibroblasten eingebettet ist. Das Suspensionsbett wurde hier aus Partikeln hergestellt, die aus Agarose gebildet wurden, während die hypodermalen und dermalen Schichten aus unterschiedlichen Anteilen von Pektin und Kollagen gebildet waren I. (B) Die Schichtstruktur sollte die dreischichtige Struktur der Haut darstellen (i). Da diese Struktur erfolgreich repliziert wurde (ii), wurde in allen Proben ein hohes Maß an Zellviabilität festgestellt, wie die Calcein-AM-Färbung zeigte (iii). Maßstabsleiste = 5 mm (Bii). Abkürzung: SLAM = Suspended Layer Additive Manufacturing. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Halsschlagader
Um die Grenzen der Methode zu erweitern, wurde eine Auswahl komplexerer Drucke hergestellt. In einem solchen Beispiel wurde eine gegabelte Halsschlagader mit 1%iger Gellan-Biotinte gedruckt (Abbildung 3A), die dann durch Extrusion von 200 mM CaCl2 innerhalb des Fluidgelbetts vernetzt und nach der Gelierung einfach von der Halterung abgehoben wurde (Abbildung 3C). Obwohl die Precursor-Drucklösungen eine niedrige Viskosität aufwiesen, gelang es dem Stützbett, die komplexe Geometrie herzustellen. Die Arterie behielt ihre Struktur während der Ablagerung, Vernetzung und Extraktion bei (Abbildung 3), ohne dass die Druckcodes geändert werden mussten, um zusätzliche Gerüste einzubauen.

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Abbildung 3: Herstellungsprozess der Gellan-Halsschlagader unter Verwendung von SLAM . (A) Extrusion von Gellan innerhalb des Fluidgelbetts während des Drucks, (B) abgeschlossener Karotisarteriedruck innerhalb des flüssigen Gels während der Vernetzung und (C) endgültiges Modell der Halsschlagader nach Entnahme aus dem flüssigen Gelträger. Maßstabsbalken = 10 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diskussion

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Berücksichtigung der Auswahl der verwendeten Materialien für das Stützbett
Während der Entwicklungsphase gab es verschiedene Anforderungen an das Stützbett. Zu diesen Eigenschaften gehörten: i) Aufrechterhaltung einer ausreichenden Struktur, um das extrudierte Material zu suspendieren; ii) Scherverdünnungskapazität, damit sich der Druckkopf frei durch das Trägermaterial bewegen kann; iii) schnelle Umstrukturierung (selbstheilende Eigenschaften), die eine Stütze um die abgeschiedene Biotinte bildet; iv) thermisch stabil sowohl bei Raumtemperatur als auch bei physiologischen Temperaturen; v) neutrales (d. h. ungeladenes) Material, das relativ bioinert ist, über einen Bereich von pH-Wert und Elektrolyten (ionische Spezies und Konzentrationen), wodurch Wechselwirkungen mit Zellen und geladenen Biotinten verhindert werden; vi) ungiftig; und vii) vorzugsweise aus einer nicht-tierischen Quelle.

Obwohl es viele Biopolymermaterialien gibt, die mehrere dieser inhärenten Eigenschaften beibehalten und in der Lage sind, eine suspendierte additive 3D-Fertigung durchzuführen, ohne alle diese Eigenschaften zu erfüllen11, 26, 27, bestand die Absicht hier darin, ein Stützbett herzustellen, das bestimmte praktische Probleme im Zusammenhang mit anderen Stützmaterialien überwinden würde. Aufgrund der chemischen Eigenschaften von Agarose und insbesondere bei der Formulierung als partikuläres flüssiges Gel konnten alle diese Eigenschaften erreicht werden. Dies ermöglichte ein Stützbett, das für eine Vielzahl von Biotinten verwendet werden konnte23,24,25,28. In der Tat bot die bioinerte Natur des Materials das Potenzial, die gedruckte Struktur während der gesamten Kultur in situ beizubehalten, so dass sich viele verschiedene Biotinten in ausreichender Zeit entwickeln konnten, ohne die Biologie zu verändern. Darüber hinaus ermöglichte die partikuläre, dünner werdende Beschaffenheit eine einfache Entfernung aus dem endgültigen gedruckten Konstrukt, während der ungiftige, nicht tierische Ursprung das Potenzial für eine schnelle Translation in die Klinik ermöglicht und Hindernisse in Bezug auf ethische und regulatorische Anforderungen überwindet.

Überlegungen bei der Auswahl der Materialien für die Biotinten
Beim Direktextrusions-Bioprinting werden Biotinten auf ein 2D-Druckbett aufgebracht. Es ist von Vorteil, dass Monomer-Biotintenlösungen ein scherverdünnendes Verhalten aufweisen. Um jedoch High-Fidelity-Konstrukte mit physiologisch relevanten Abmessungen herzustellen, müssen sie eine niedrige Thixotropie aufweisen und sich auf ausreichend hohe Viskositäten erholen, damit sie bei der Abscheidung feste Filamente bilden 29,30,31. Mit erhöhter Viskosität ist der für die Extrusion erforderliche Druck viel höher, was sich oft negativ auf die Lebensfähigkeit der verkapselten Zelle auswirkt31,32. Das Suspensions-Bioprinting beseitigt diese Einschränkung, da das extrudierte Material während der gesamten Vernetzung durch das Suspensionsbad unterstützt wird. Diese Entwicklung erweitert das Spektrum der einsetzbaren Biotintenformulierungen enorm. Neuere Arbeiten haben beispielsweise gezeigt, dass niedrig konzentrierte Kollagenlösungen in hochkomplexe Geometrien gedruckt werden, die der inneren Struktur des Herzens entsprechen33,34,35. In den Anwendungen, die in diesem Verfahren erwähnt werden, ermöglichte der eingebettete Druck die Auswahl von Biomaterialtinten, die die physiologische Umgebung, für die sie bestimmt waren, am besten zu replizieren, anstatt ihre Fähigkeit zu drucken.

Einschränkungen bei der Strukturgröße
In der Biofabrikationsliteratur wurde gezeigt, dass verschiedene Arten von Bioprintern, die von alternativen Druckkopftechnologien angetrieben werden, in eingebettete Fertigungstechniken integriert werden können. Die hier demonstrierte Technologie ist nicht anders, mit Beispielen, die einen pneumatischen Biodrucker auf Mikroextrusionsbasis (INKREDIBLE) umfassen, wie von Senior et al. demonstriert, und extrusionsbasierte Biodrucker mit steuerbaren Mikroventilen (3D Discovery)23. Obwohl dies die Technologie für eine Reihe von Anwendern zugänglich macht, die möglicherweise bereits einen Bioprinter besitzen, hängen die Einschränkungen der erreichbaren Größe der Struktur letztendlich von den jeweiligen Bioprinter-Spezifikationen ab. Zunächst wird die Haupteinschränkung für die Erzeugung großer Strukturen durch die Größe des Druckbetts, die Grenzen der X-, Y- und Z-Trajektorien sowie die Größe des Gefäßes, in dem das unterstützende flüssige Gel enthalten ist, definiert.

Einschränkungen bei der Auflösung
Bei der Herstellung komplizierter, mikrometergroßer Strukturen hängt die resultierende Auflösung stark von der Präzision des Druckers (Kontrolle über Schrittweite, Extrusionsgrad), dem Innendurchmesser der Druckdüse und einer Reihe einstellbarer Softwareparameter ab, darunter Druckgeschwindigkeit, Druckdruck und Flussgeschwindigkeit36. Darüber hinaus scheint die Kontrolle über die Tröpfchengröße entscheidend zu sein, um die Erzeugung hochauflösender Strukturen zu erleichtern, wobei die besten Ergebnisse in Extrusionsdruckern mit einem steuerbaren Mikroventil beobachtet werden. Letztendlich, wenn alle Parameter optimiert sind, können Druckauflösungen erreicht werden, die dem Innendurchmesser von Extrusionsdüsen mit dem abgeschiedenen Filament in der Größenordnung der Mikrometerskala37 entsprechen oder sogar kleiner sind. Dies ist jedoch auf die Optimierung aller zuvor genannten Druckparameter angewiesen, und die Auflösung kann durch den Druckmechanismus und die Präzision erheblich eingeschränkt werden. Die pneumatische Extrusion scheint beispielsweise nicht die gleiche Druckauflösung zu ermöglichen wie die Extrusion mit einem steuerbaren Mikroventil. Es besteht daher ein potenzieller Kosteneffekt, um die maximale Druckauflösung zu erreichen, da solche Systeme einen deutlich erhöhten Aufwand für den Benutzer verursachen.

Zukunftsaussichten und Potenziale
Derzeit besteht ein großes Interesse an der Verwendung von suspendierten Fertigungsprozessen, um die Herstellung komplexer weicher Strukturen mit eingebetteten Zellen zu ermöglichen, und es wird in den kommenden Jahren zweifellos erhebliche Fortschritte geben. Es gibt kontinuierliche Fortschritte bei der Verbesserung der Druckauflösung, obwohl es abzuwarten bleibt, wie notwendig dies sein wird, da die meisten biologischen Systeme in der Lage sind, sich auf molekularer Ebene neu anzuordnen. Während der Schwerpunkt des Interesses in den Medien auf der Verwendung von 3D-gedrucktem Gewebe liegt, um menschliches Gewebe nach Verletzungen oder Krankheiten direkt zu ersetzen, sind robuste medizinische Verfahren, die durch diese Prozesse ermöglicht werden, noch einige Jahre entfernt38,39. Es ist wahrscheinlicher, dass die Auswirkungen dieser komplexen Kultursysteme auf das Screening von Arzneimitteln oder sogar auf die Verwendung als Werkzeuge zur Verbesserung unseres Verständnisses biologischer Prozesse zurückzuführen sind38. Insbesondere die Entwicklungsbiologie könnte hier stark profitieren, wo die genaue Kontrolle über die spezielle Ablagerung von Molekülen es den Forschern ermöglichen wird, die Rolle multifaktorieller Systeme bei der Gewebeentwicklung zu erforschen.

Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

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Die Autoren danken dem EPSRC (EP/L016346/1), dem MRC und der Doctoral Training Alliance Biosciences for Health für die Finanzierung und Unterstützung dieser Arbeit.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3D Discovery BioprinterRegenHUBIOFACTORYMikroventil-Extrusions-Bioprinter
Agarose Merck9012-36-6Material zur Herstellung von flüssigen Gel-Stützbädern 
Tisch-AutoklavPrestige MedicalB8L75814Classic
Brilliant Blue GMerck6104-58-1Farbstoff zum Färben von Strukturen 
Calciumchlorid-DihydratMerck 10035-04-8Wird verwendet, um gedruckte Strukturen zu vernetzen 
DexamethasonMerck D4902-25MGWird in adipogenen Medien
verwendet DMEMMerckD6429Zellkulturmedien
Duran  Flaschen MerckZ305219Glasflaschen 
EVOS XL Core Imaging SystemEVOS™AMEX1000Hellfeldmikroskop mit Phasenkontrast
FBSFisher Scientific10500-064Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien
Gellan-GummiSpezielle InhaltsstoffeLow-Acyl-Gellan-Gummi, das zur Herstellung der Biotinte für das Modell der Halsschlagader verwendet wird
HEPES-PufferMerckH9897-10PAKPuffer für Zellkulturmedien
IndomethacinMerckI7378Verwendung in adipogenen Medien
Isobutyl-methylxanthin (IBMX)MerckI7018-100MGVerwendung in adipogenen Medien
Keratinozyten-WachstumsmediumLonza00192060Verwendung als Medium zur Kultivierung von Keratinozyten
Niedriges MethoxypektinCP KelcoLM-5CSPektin zur Herstellung von Pektin/Kollagen-Mischungen
Penicillin-StreptomycinMerckP4333-100MLZur Hemmung des Bakterienwachstums
PureCol EZ Gel-LösungMerck5074Kollagenlösung zur Herstellung von Alginat/Kollagen-Mischungen
NatriumalginatMerck9005-38-3Alginatpulver zur Herstellung von Alginat/Kollagen-Mischungen 
TrypLE auswählen Fisher Scientific12563011Zelldissoziationsenzym
T75 KolbenStarLabCC7682-4175Zur Kultivierung von Zellen
5060341112638

Referenzen

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