Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Summary

Fehler in der Chromosomentrennung sind ein häufiges Merkmal bei Eizellen. Daher gibt die Untersuchung des Spindelanordnungs-Checkpoints wichtige Hinweise auf die Mechanismen, die zur Produktion gesunder Eier erforderlich sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt drei komplementäre Assays zur Beurteilung der Integrität des Spindelaufbau-Checkpoints in Maus-Oozyten.

Abstract

Aneuploidie ist die häufigste genetische Anomalie, die beim Menschen zu frühen Fehlgeburten und Schwangerschaftsversagen führt. Die meisten Fehler in der Chromosomentrennung, die zu Aneuploidie führen, treten während der Meiose in Eizellen auf, aber warum die Eizellmeiose fehleranfällig ist, ist noch nicht vollständig geklärt. Während der Zellteilung verhindern Zellen Fehler in der Chromosomentrennung, indem sie den Spindle Assembly Checkpoint (SAC) aktivieren. Dieser Kontrollmechanismus beruht auf der Erkennung von Kinetochor (KT)-Mikrotubuli (MT) und der Erfassung der von Spindelfasern erzeugten Spannung. Wenn KTs nicht gebunden sind, wird der SAC aktiviert und verhindert das Fortschreiten des Zellzyklus. Das SAC wird zuerst durch die MPS1-Kinase aktiviert, die die Rekrutierung und Bildung des mitotischen Checkpoint-Komplexes (MCC) auslöst, der aus MAD1, MAD2, BUB3 und BUBR1 besteht. Dann diffundiert das MCC in das Zytoplasma und sequestriert CDC20, einen anaphasenfördernden Komplex/Zyklosom-Aktivator (APC/C). Sobald KTs an Mikrotubuli gebunden sind und die Chromosomen an der Metaphasenplatte ausgerichtet sind, wird der SAC zum Schweigen gebracht, CDC20 wird freigesetzt und der APC/C wird aktiviert, wodurch der Abbau von Cyclin B und Securin ausgelöst wird, wodurch der Beginn der Anaphase ermöglicht wird. Im Vergleich zu somatischen Zellen ist die SAC in Eizellen nicht so effektiv, da Zellen trotz ungebundener KTs eine Anaphase durchlaufen können. Um zu verstehen, warum die SAC freizügiger ist und ob diese Permissivität eine der Ursachen für Chromosomentrennungsfehler in Eizellen ist, bedarf es noch weiterer Untersuchungen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die drei Techniken zur umfassenden Beurteilung der SAC-Integrität in Maus-Eizellen. Diese Techniken umfassen die Verwendung von Nocodazol zur Depolymerisierung von MTs zur Bewertung der SAC-Antwort, die Verfolgung der SAC-Stummschaltung durch Verfolgung der Kinetik der Securin-Zerstörung und die Bewertung der Rekrutierung von MAD2 zu KTs durch Immunfluoreszenz. Zusammen untersuchen diese Techniken Mechanismen, die benötigt werden, um gesunde Eier zu produzieren, indem sie eine vollständige Bewertung der SAC-Integrität liefern.

Introduction

Aneuploidie, die durch Fehler in der Chromosomentrennung entsteht, ist die Hauptursache für frühe Fehlgeburten und steht in engem Zusammenhang mit Fehlern in der Meiose¹. Die Meiose unterscheidet sich von der Mitose dadurch, dass sie aus zwei Zellteilungsrunden ohne einen dazwischenliegenden DNA-Replikationsschritt besteht. In der Meiose I trennen sich homologe Chromosomen, während Schwesterchromatiden zusammen bleiben. In Eizellen ist dieser Schritt fehleranfällig und führt zur Produktion von aneuploiden Eizellen².

Um Fehler bei der Chromosomentrennung zu vermeiden, aktivieren die meisten Zel....

Protocol

Alle Mäuse, die in diesen Protokollen verwendet wurden, wurden gemäß den Richtlinien des Rutgers University Institutional Animal Use and Care Committee (Protokoll 201702497) und der National Institutes of Health untergebracht und aufgezogen. Diese Aufsichtsbehörden genehmigten alle Versuchsverfahren mit Tierversuchen. Alle Mäuse, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden, waren 6-8 Wochen alte CF-1-Weibchen.

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Bevor Sie mit den SAC-Auswertungen beginnen, entnehmen Sie Maus-Eizellen gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht¹². Die entnommenen Eizellen werden....

Results

Bewertung des SAC-Ansprechens durch Nocodazol-Behandlung
Der Zweck dieses Experiments ist es, die SAC-Aktivierung und -Stärke zu bewerten. Durch die Verwendung von Nocodazol zur Depolymerisation von Spindelmikrotubuli werden alle Kinetochoren gelöst, was zu einem SAC-vermittelten Zellzyklusstillstand führt. Im vorliegenden Bildgebungssystem extrudierten DMSO-behandelte Kontroll-Eizellen etwa 14 Stunden nach der Freisetzung von Milrinon einen Polkörper (Abbildung 1, obere .......

Discussion

Der Kontrollpunkt für die Spindelmontage ist ein kritischer Kontrollmechanismus während der Zellteilung, der Fehler bei der Chromosomentrennung verhindern soll. Dadurch hat die Zelle genügend Zeit, um unsachgemäße KT-MT-Anhänge zu korrigieren. Die Meiose in Eizellen ist ein fehleranfälliger Prozess, bei dem der größte Teil der Chromosomentrennung während der Meiose I auftritt, was zur Bildung von aneuploiden Eiern führt, die die Hauptursache für frühe Fehlgeburten und Unfruchtbarkeit beim Menschen sind^<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	A4503
DAPI	Life Technologies	D1306
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma	D5879
Esel-Anti-Kaninchen-Alexa-568	Life Technologies	A10042
EVOS FL Auto Imaging System	Life Technologies		Fluoreszenzmikroskop
EVOS Onstage Inkubator	Life Technologies		Inkubatorkammer
Glas Boden 96-Well-Platten N 1,5 unbeschichtet	MatTek Corporation	P96G-1.5-5-F
ziege-anti-human-Alexa-633	Life Technologies	A21091
HEPES	Sigma	H3537
Humane Anti-ACA	Antikörper Incorporated	15-234	Verdünnung 1/30
ImageJ	NIH
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Leica SP8 ausgestattet mit einem 63-fachen, 1,40 NA Öl-Immersionsobjektiv	Leica
MgSO4 & Middot; 7H20	Sigma	M7774
Milrinone	Sigma	M4659
Na2HPO4	Sigma	S2429
NaCl	Sigma	S5886
NaN3	Sigma	S2002
Nocodazol	Sigma	M1404
Paraformaldhyde (PFA)	Sigma	P6148
PIPES	Sigma	P6757
Kaninchen Anti-MAD2	Biolegend	924601	Verdünnung 1/1000; früher Covance #PRB-452C
Reversine	Cayman Chemical	10004412
Triton-X	Sigma	274348
Tween-20	Sigma	X100
Vectashield	Vector Laboratorien	H-1000