Methodenartikel

Modellierung der menschlichen Kleinhirnentwicklung in vitro in 2D-Struktur

DOI:

10.3791/64462

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16. September 2022

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1Department of Psychiatry, University of Iowa, 2Department of Radiology, University of Iowa, 3Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, 5Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das vorliegende Protokoll erklärt die Erzeugung einer 2D-Monoschicht von Kleinhirnzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Untersuchung der frühen Stadien der Kleinhirnentwicklung.

Zusammenfassung

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Die präzise und rechtzeitige Entwicklung des Kleinhirns ist nicht nur für eine genaue motorische Koordination und Balance, sondern auch für die Kognition von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus wurde eine Störung der Kleinhirnentwicklung mit vielen neurologischen Entwicklungsstörungen in Verbindung gebracht, darunter Autismus, Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung (ADHS) und Schizophrenie. Untersuchungen der Kleinhirnentwicklung beim Menschen waren bisher nur durch Post-mortem-Studien oder Neuroimaging möglich, doch reichen diese Methoden nicht aus, um die molekularen und zellulären Veränderungen in vivo während der frühen Entwicklung zu verstehen, wenn viele neurologische Entwicklungsstörungen entstehen. Das Aufkommen von Techniken zur Erzeugung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) aus somatischen Zellen und die Fähigkeit, iPS-Zellen weiter in Neuronen umzudifferenzieren, haben den Weg für die In-vitro-Modellierung der frühen Gehirnentwicklung geebnet. Die vorliegende Studie bietet vereinfachte Schritte zur Erzeugung von Kleinhirnzellen für Anwendungen, die eine 2-dimensionale (2D) Monoschichtstruktur erfordern. Kleinhirnzellen, die frühe Entwicklungsstadien repräsentieren, werden aus menschlichen iPS-Zellen über die folgenden Schritte abgeleitet: Zuerst werden embryoide Körper in 3-dimensionaler (3D) Kultur hergestellt, dann werden sie mit FGF2 und Insulin behandelt, um die Spezifikation des Kleinhirnschicksals zu fördern, und schließlich werden sie terminalerweise als Monoschicht auf Poly-L-Ornithin (PLO) / Laminin-beschichteten Substraten differenziert. Nach 35 Tagen Differenzierung exprimieren iPSC-abgeleitete Kleinhirnzellkulturen Kleinhirnmarker wie ATOH1, PTF1α, PAX6 und KIRREL2, was darauf hindeutet, dass dieses Protokoll glutamaterge und GABAerge zerebelläre neuronale Vorläufer sowie Purkinje-Zellvorläufer erzeugt. Darüber hinaus zeigen die differenzierten Zellen eine ausgeprägte neuronale Morphologie und sind positiv für Immunfluoreszenzmarker der neuronalen Identität wie TUBB3. Diese Zellen exprimieren axonale Leitmoleküle, einschließlich Semaphorin-4C, Plexin-B2 und Neuropilin-1, und könnten als Modell für die Untersuchung der molekularen Mechanismen des Neuritenwachstums und der synaptischen Konnektivität dienen. Diese Methode erzeugt menschliche Kleinhirnneuronen, die für nachgelagerte Anwendungen nützlich sind, einschließlich Genexpression, physiologischer und morphologischer Studien, die 2D-Monoschichtformate erfordern.

Einleitung

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Das Verständnis der menschlichen Kleinhirnentwicklung und der kritischen Zeitfenster dieses Prozesses ist nicht nur wichtig, um die möglichen Ursachen neurologischer Entwicklungsstörungen zu entschlüsseln, sondern auch um neue Ziele für therapeutische Interventionen zu identifizieren. Die Modellierung der menschlichen Kleinhirnentwicklung in vitro war eine Herausforderung, doch im Laufe der Zeit sind viele Protokolle zur Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hES-Zellen) oder iPS-Zellen mit Kleinhirnlinienschicksalen entstanden 1,2,3,4,5,6,7,8

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Protokoll

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Die Forschung am Menschen wurde unter der Genehmigungsnummer 201805995 des University of Iowa Institutional Review Board und der Zulassungsnummer 2017-02 des Human Pluripotent Stem Cell Committee der University of Iowa genehmigt. Hautbiopsien wurden von den Probanden nach schriftlicher Einverständniserklärung erhalten. Die Fibroblasten wurden in DMEM mit 15% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% MEM-nicht-essentieller Aminosäurenlösung bei 37 °C und 5%CO2 kultiviert. Die Fibroblasten wurden mit einem episomalen Reprogrammierungskit nach dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle) unter Verwendung eines Nukleofektors für die Elektropora....

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Ergebnisse

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Überblick über die 3D-zu-2D-Kleinhirndifferenzierung
Kleinhirnzellen werden ausgehend von iPS-Zellen erzeugt. Abbildung 1A zeigt den gesamten Workflow und die Hinzufügung wichtiger Komponenten zur Unterscheidung. Am Tag 0 werden EBs hergestellt, indem die iPSC-Kolonien (Abbildung 1B) vorsichtig mit einer gezogenen Glaspipette aus CDM mit SB431542 und Y-27632 angehoben und in extrem niedrig befestigte Platten gelegt werden. FGF2 wird an Tag 2 .......

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Diskussion

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Die Fähigkeit, die menschliche Kleinhirnentwicklung in vitro zu modellieren, ist wichtig für die Krankheitsmodellierung sowie für das Verständnis der normalen Gehirnentwicklung. Weniger komplizierte und kostengünstige Protokolle schaffen mehr Möglichkeiten für replizierbare Datengenerierung und breite Implementierung in mehreren wissenschaftlichen Labors. Ein Kleinhirndifferenzierungsprotokoll wird hier unter Verwendung einer modifizierten Methode zur Erzeugung von EBs beschrieben, die keine Enzyme oder Dissozia.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

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Wir danken Jenny Gringer Richards für ihre gründliche Arbeit bei der Validierung unserer Kontrollpersonen, aus der wir die Kontroll-iPSCs generiert haben. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH T32 MH019113 (an D.A.M. und K.A.K.), dem Nellie Ball Trust (an T.H.W. und A.J.W.), NIH R01 MH111578 (an V.A.M. und J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (an A.J.W.) und dem Roy J. Carver Charitable Trust (an V.A.M., J.A.W. und A.J.W.). Die Figuren wurden mit BioRender.com erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 mL Serologische PipetteFisher Scientific13-678-26D
1-Thio-GlycerolSigmaM6145
2 mL Serologische PipetteFisher Scientific13-678-26B
250 mL Filtereinheit, 0,2 & Mikro; m aPES, Ø 50mm Fisher ScientificFB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture DishFalcon353001
4D Nucleofector CoreUnit Lonza276885Nucleofector
5 mL Serologische PipetteFisherScientific 13-678-25D
60 mm Easy Grip GewebekulturschaleFalcon353004
6 Wells ultra-niedrige AufsatzplattenCorning3471
9" Einweg-PasteurpipettenFisher Scientific13-678-20D
Apo-TransferrinSigmaT1147
Rinderserumalbumin (BSA)SigmaA9418
Wasser in ZellkulturqualitätCytivaSH30529.02
Chemisch definiertes LipidkonzentratGibco11905031
Chroman 1Cayman34681
Klasse II, Typ A2, Biologische SicherheitswerkbankNuAire, Inc.NU-540-600Dunstabzugshaube, 24-Well-Platte mit UV-Licht
, TC-behandeltCorning3526
Costar 6-Well-Platte, TC-behandelteCorning3516
DAPI-LösungThermo Scientific62248
DMEMGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO (Dimethlysulfoxid)SigmaD2438
DPBS+/+Gibco14040133
EmricasanCayman22204
Epi5 episomales iPSC-ReprogrammierungskitLife TechnologiesA15960
Essential 8-FlexGibcoA2858501PSC-Medium mit hitzestabilem FGF2
EVOS XL Core Imaging SystemLife TechnologiesAMEX1000
Fötales Kälberserum - Premium SelectAtlanta BiologicalsS11150
FGF2Peprotech100-18B
GlutaMAX NahrungsergänzungsmittelGibco35050061L-Alanin-L-Glutamin Nahrungsergänzungsmittel
Ham's F12 Nutrient MixGibco11765054
HERAcell VIOS 160i CO2-InkubatorThermo Scientific50144906
Mensch Anti-EN2, MausSanta Cruz Biotechnologiesc-293311
Mensch Anti-Ki67/MKI67, KaninchenR& D SystemsMAB7617
Humanes Anti-PTF1a, KaninchenNovus BiologicalsNBP2-98726
Humanes Anti-TUBB3, MausBiolegend801213
IMDMGibco12440053
InsulinGibco12585
Laminin Maus ProteinGibco23017015
Matrigel-MatrixCorning354234Basalmembran-Matrix
MEM-NEAAGibco11140050
Mini-ZentrifugeLabnet InternationalC1310Tisch-Mini-Zentrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 & Mikro; g)New England BioLabsT2040Siliziumdioxid-Spin-Säulen
Monarch Total RNA Miniprep KitNew England BioLabsT2010Siliziumdioxid-Spin-Säulen
N-2-ErgänzungGibco17502-048
Neurobasales MediumGibco21103049
PBS, pH 7,4Gibco10010023
PFA 16%Elektronenmikroskopie15710
Polyamin-ErgänzungsmittelSigmaP8483
Poly-L-Ornithin (PLO)Sigma3655
KaliumchloridSigma746436
SB431542Sigma54317
Durchsichtige selbstverschließbareBeutel SterikingSS-T2 (90x250)Autoklavenbeutel
Natrium Citrat-Dihydrat Fisher ScientificS279-500
Spritzenvorsatzfilter, steril, PES 0,22 & Mikro; m, 30 mm DiaResearch Products International256131
Trans-ISRIBCayman16258
TRIzol ReagenzInvitrogen15596018Phenol und Guanidin isothiocyanat
TrypLE Express Enzym (1x)Gibco12604039Zelldissoziationsreagenz
DampfdruckosmometerWescor, Inc.Modell 5520Osmometer
Y-27632Biogems1293823
,

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).
  2. Erceg, S., et al.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Cerebellar DevelopmentHuman iPSCs2D Monolayer CultureEmbryoid BodiesCerebellar DifferentiationNeuronal ProgenitorsPurkinje Cell ProgenitorsImmunofluorescence MarkersAxonal Guidance MoleculesNeurodevelopmental Disorders

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