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Biochemistry

विट्रो में इस्केमिक स्ट्रोक का अध्ययन करने के लिए मानव रक्त-मस्तिष्क बाधा का एक ट्रिपल प्राथमिक सेल संस्कृति मॉडल

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64469
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2Institute of Physiotherapy and Health Sciences, The Jerzy Kukuczka Academy of Physical Education

Summary

यहां, हम प्राथमिक मानव मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स और पेरिसाइट के आधार पर रक्त-मस्तिष्क बाधा के ट्रिपल सेल कल्चर मॉडल की स्थापना के लिए विधि का वर्णन करते हैं। यह बहुकोशिकीय मॉडल विट्रो में इस्केमिक स्ट्रोक के दौरान न्यूरोवास्कुलर यूनिट डिसफंक्शन के अध्ययन के लिए या दवा उम्मीदवारों की स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है।

Abstract

इस्केमिक स्ट्रोक सीमित चिकित्सीय विकल्पों के साथ दुनिया भर में मृत्यु और विकलांगता का एक प्रमुख कारण है। इस्केमिक स्ट्रोक के न्यूरोपैथोलॉजी को मस्तिष्क में रक्त की आपूर्ति में रुकावट की विशेषता है जिससे कोशिका मृत्यु और संज्ञानात्मक शिथिलता होती है। इस्केमिक स्ट्रोक के दौरान और बाद में, रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) शिथिलता चोट की प्रगति की सुविधा प्रदान करती है और खराब रोगी वसूली में योगदान देती है। वर्तमान बीबीबी मॉडल में मुख्य रूप से एंडोथेलियल मोनोकल्चर और एस्ट्रोसाइट्स या पेरिसाइट के साथ डबल सह-संस्कृतियां शामिल हैं।

ऐसे मॉडलों में एक गतिशील मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट की पूरी तरह से नकल करने की क्षमता की कमी होती है, जो सेल-टू-सेल संचार के लिए आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले बीबीबी मॉडल में अक्सर अमर मानव एंडोथेलियल कोशिकाएं या पशु-व्युत्पन्न (कृंतक, पोर्सिन, या गोजातीय) सेल संस्कृतियां होती हैं जो ट्रांसलेशनल सीमाएं पैदा करती हैं। यह पेपर एक उपन्यास अच्छी तरह से सम्मिलित-आधारित बीबीबी मॉडल का वर्णन करता है जिसमें केवल प्राथमिक मानव कोशिकाएं (मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं, एस्ट्रोसाइट्स और मस्तिष्क संवहनी पेरिसाइट्स) होती हैं जो विट्रो में इस्केमिक मस्तिष्क की चोट की जांच को सक्षम करती हैं।

बाधा अखंडता पर ऑक्सीजन-ग्लूकोज अभाव (ओजीडी) के प्रभावों का मूल्यांकन निष्क्रिय पारगम्यता, ट्रांसेंडोथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) माप और हाइपोक्सिक कोशिकाओं के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन द्वारा किया गया था। प्रस्तुत प्रोटोकॉल विवो में बीबीबी के अंतरकोशिकीय वातावरण को कम करने में एक अलग लाभ प्रदान करता है, जो इस्केमिक मस्तिष्क की चोट की स्थापना में नई चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए अधिक यथार्थवादी इन विट्रो बीबीबी मॉडल के रूप में कार्य करता है।

Introduction

स्ट्रोकदुनिया भर में मृत्यु और दीर्घकालिक विकलांगता के प्रमुख कारणों में से एक है। स्ट्रोक की घटनाएं उम्र के साथ तेजी से बढ़ती हैं, 55 वर्ष की आयु के बाद हर 10 साल मेंदोगुनी हो जाती हैं। इस्केमिक स्ट्रोक थ्रोम्बोटिक और एम्बोलिक घटनाओं के कारण सेरेब्रल रक्त प्रवाह व्यवधान के परिणामस्वरूप होता है, जिसमें सभी स्ट्रोक के मामलों का 80% से अधिक शामिल होताहै। अब भी, इस्केमिक स्ट्रोक के बाद ऊतक मृत्यु को कम करने के लिए अपेक्षाकृत कम उपचार विकल्प उपलब्ध हैं। जो उपचार मौजूद हैं वे समय-संवेदनशील हैं और परिणामस्वरूप हमेशा अच्छे नैदानिक परिणाम नहीं होते हैं। इसलिए, पोस्टस्ट्रोक रिकवरी को प्रभावित करने वाले इस्केमिक स्ट्रोक के जटिल सेलुलर तंत्र पर शोध की तत्काल आवश्यकता है।

बीबीबी रक्त और मस्तिष्क पैरेन्काइमा के बीच अणुओं के आदान-प्रदान के लिए एक गतिशील इंटरफ़ेस है। संरचनात्मक रूप से, बीबीबी में मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं शामिल हैं जो एक तहखाने झिल्ली, पेरिसाइट और एस्ट्रोसाइटिक एंडफीट4 से घिरे जंक्शनल कॉम्प्लेक्स से जुड़ी हुई हैं। पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स मजबूत, तंग जंक्शनोंके गठन के लिए आवश्यक विभिन्न कारकों के स्राव के माध्यम से बीबीबी अखंडता के रखरखाव में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। बीबीबी का टूटना इस्केमिक स्ट्रोक की पहचान में से एक है। सेरेब्रल इस्किमिया से जुड़ी तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया और ऑक्सीडेटिव तनाव के परिणामस्वरूप एस्ट्रोसाइट्स, पेरिसाइट और एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शन प्रोटीन कॉम्प्लेक्स और डिसरेगुलेटेड क्रॉसस्टॉक का विघटन होता है, जिससे बीबीबी 7 में पैरासेल्युलर विलेय पारगम्यता बढ़ जातीहै। बीबीबी डिसफंक्शन मस्तिष्क एडिमा के गठन को बढ़ावा देता है और रक्तस्रावी परिवर्तन के जोखिम को बढ़ाताहै। उपरोक्त सभी को ध्यान में रखते हुए, इस्केमिक स्ट्रोक के दौरान और बाद में बीबीबी स्तर पर होने वाले आणविक और सेलुलर परिवर्तनों को समझने में बहुत रुचि है।

यद्यपि कई इन विट्रो बीबीबी मॉडल हाल के दशकों में विकसित किए गए हैं और विभिन्न अध्ययनों में उपयोग किए जाते हैं, उनमें से कोई भी विवो स्थितियों9 में पूरी तरह से प्रतिकृति नहीं कर सकता है। जबकि कुछ मॉडल एंडोथेलियल सेल मोनोलेयर पर आधारित होते हैं, जो अकेले या पेरिसाइट या एस्ट्रोसाइट्स के साथ संयोजन में अच्छी तरह से सम्मिलित पारगम्य समर्थन पर सुसंस्कृत होते हैं, केवल हाल के अध्ययनों ने ट्रिपल सेल कल्चर मॉडल डिज़ाइन पेश किए हैं। लगभग सभी मौजूदा ट्रिपल कल्चर बीबीबी मॉडल में पशु प्रजातियों या मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त कोशिकाओं से अलग एस्ट्रोसाइट्स और पेरिसाइटके साथ प्राथमिक मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाएं शामिल हैं।

इन विट्रो में मानव बीबीबी को बेहतर ढंग से पुन: प्राप्त करने की आवश्यकता को पहचानते हुए, हमने मानव मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचबीएमईसी), प्राथमिक मानव एस्ट्रोसाइट्स (एचए), और प्राथमिक मानव मस्तिष्क संवहनी पेरिसाइट्स (एचपीवीपी) से बना एक ट्रिपल सेल कल्चर इन विट्रो बीबीबी मॉडल की स्थापना की। यह ट्रिपल कल्चर बीबीबी मॉडल 6-वेल प्लेट पर स्थापित किया गया है, पॉलिएस्टर झिल्ली 0.4 μm छिद्र आकार के साथ सम्मिलित है। ये अच्छी तरह से सम्मिलित सेल लगाव के लिए एक इष्टतम वातावरण प्रदान करते हैं और मध्यम नमूनाकरण या यौगिक अनुप्रयोग के लिए एपिकल (रक्त) और बेसोलेटरल (मस्तिष्क) दोनों डिब्बों तक आसान पहुंच को सक्षम करते हैं। इस प्रस्तावित ट्रिपल सेल कल्चर बीबीबी मॉडल की विशेषताओं का मूल्यांकन टीईईआर और पैरासेलुलर फ्लक्स पोस्ट ओजीडी को मापकर किया जाता है, जिसमें ऑक्सीजन की कमी (<1% ओ2) और पोषक तत्वों (ग्लूकोज मुक्त माध्यम का उपयोग करके) एक ह्यूमिडिफाइड, सीलबंद कक्ष का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। इसके अतिरिक्त, इस मॉडल में प्रेरित इस्केमिक जैसी स्थितियों को हाइपोक्सिक कोशिकाओं के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन द्वारा सटीक रूप से सत्यापित किया जाता है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी कोशिकाओं, सामग्रियों, उपकरणों और समाधानों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. ट्रिपल सेल संस्कृति बीबीबी मॉडल सेटिंग

  1. सीडिंग पेरिसाइट्स
    1. टी 75 कल्चर फ्लास्क में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर के भीतर सेल आसंजन के लिए सक्रिय सतह के साथ एचपीवीपी की खेती करें। एक बार संगम तक पहुंचने के बाद, पुराने पेरिसाइट माध्यम को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को गर्म डलबेको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) के 5 एमएल के साथ धोएं। डीपीबीएस को एस्पिरेट करें और गर्म ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 4 एमएल और डीपीबीएस के 1 एमएल के संयोजन का उपयोग करके फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करें।
      नोट: पी 7 से बाद में मार्ग का उपयोग करने से बचें।
    2. एक सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए फ्लास्क को इनक्यूबेट करें। यह पुष्टि करने के लिए एक माइक्रोस्कोप के तहत देखें कि क्या कोशिकाएं फ्लास्क से अलग हैं। फ्लास्क में 5 एमएल गर्म पेरिसाइट माध्यम (2% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस]) जोड़ें और अलग कोशिकाओं को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. 200 × ग्राम पर 3 मिनट के लिए सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, जिससे कोशिकाओं को ट्यूब के तल में एक गोली बनाने की अनुमति मिलती है। ट्यूब से माध्यम को एस्पिरेट करें, यह सुनिश्चित करें कि सेल गोली बरकरार रहे।
    4. पेरिसाइट माध्यम में सेल गोली को पुन: निलंबित करें; कोशिकाओं के संगम और आवश्यक अच्छी तरह से सम्मिलित करने की संख्या के आधार पर माध्यम की मात्रा की गणना करें। पुन: निलंबित कोशिकाओं के 10 μL लें, उन्हें सेल गिनती स्लाइड में रखें, और कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
    5. सेल घनत्व और बीज 300,000 कोशिकाओं को निर्धारित करें / 1 एमएल पेरिसाइट माध्यम में अच्छी तरह से सम्मिलित (6-वेल प्रारूप) के एब्ल्यूमिनल पक्ष पर डालें।
      नोट: जब एबीवीपी को इंसर्ट के नीचे की ओर सीडिंग किया जाता है, तो पहले अच्छी तरह से सम्मिलित प्लेटों को उल्टा पलटना बहुत महत्वपूर्ण है। जबकि प्लेट को एक सतह पर सपाट रखा जाता है, कुएं के एब्ल्यूमिनल पक्ष को उजागर करने के लिए नीचे के खंड को हटा दें। एब्ल्यूमिनल साइड पर पेरिसाइट सेल सस्पेंशन जोड़ने के बाद, वाष्पीकरण को रोकने के लिए फ्लिप प्लेट के साथ अच्छी तरह से सम्मिलित करें। सभी प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में उल्टा रखें।
  2. सीडिंग एस्ट्रोसाइट्स
    1. संगम तक पहुंचने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर के भीतर टी 75 फ्लास्क में एचए की खेती करें। पेरिसाइट माध्यम के बजाय एस्ट्रोसाइट माध्यम (2% एफबीएस भी युक्त) का उपयोग करके उपरोक्त चरणों 1.1.1-1.1.4 का पालन करें।
      नोट: पी 9 से बाद में अंशों का उपयोग करने से बचें।
    2. ऊतक संवर्धन 6-वेल प्लेटों के तल पर सेल घनत्व और बीज 300,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से निर्धारित करें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्लेट को कवर करें और सभी प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  3. सीडिंग एंडोथेलियल कोशिकाएं
    1. ऊतक संवर्धन व्यंजनों में एचबीएमईसी की खेती 5% सीओ2 इनक्यूबेटर के भीतर 37 डिग्री सेल्सियस पर की जाती है। पेरिसाइट माध्यम के बजाय पूर्ण क्लासिक माध्यम (10% एफबीएस युक्त) का उपयोग करके उपरोक्त चरणों 1.1.1-1.1.4 का पालन करें।
      नोट: पी 12 से बाद में मार्ग का उपयोग करने से बचें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर से एस्ट्रोसाइट्स और अच्छी तरह से डालने वाले 6-वेल प्लेट्स और पेरिसाइट्स युक्त अच्छी तरह से सम्मिलित( 6-वेल प्रारूप) को बाहर निकालें। ऊतक संस्कृति 6-वेल प्लेटों से एस्ट्रोसाइट माध्यम को एस्पिरेट करें। प्रत्येक कुएं में 1 एमएल पेरिसाइट माध्यम और 1 एमएल एस्ट्रोसाइट्स माध्यम जोड़ें।
    3. अच्छी तरह से डालने से पेरिसाइट माध्यम को एस्पिरेट करें और उन्हें ऊतक संस्कृति 6-वेल प्लेटों में रखें जिसमें बीज वाले एस्ट्रोसाइट्स होते हैं। बीज HBMEC 300,000 कोशिकाओं / कुएं के घनत्व पर 2 एमएल पूर्ण क्लासिक माध्यम में एक ही कुएं के एपिकल साइड पर।
      नोट: एंडोथेलियल कोशिकाओं को अगले दिन अच्छी तरह से डालने के बाद अच्छी तरह से डालने के एपिकल साइड पर बीज दिया जाना चाहिए और ऊतक संस्कृति 6-वेल प्लेटों पर एस्ट्रोसाइट्स को अच्छी तरह से डालने के बाद। बीबीबी जैसे गुणों को प्रेरित करने के लिए कोशिकाओं को 6 दिनों के लिए ट्रिपल कल्चर में बनाए रखा जाना चाहिए। प्रयोगों से 24 घंटे पहले सेल कल्चर माध्यम को दोनों अच्छी तरह से सम्मिलित डिब्बों में बदल दिया जाना चाहिए।

2. ऑक्सीजन-ग्लूकोज की कमी का प्रेरण

  1. डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को 3x धोएं। ओजीडी के अधीन ट्रिपल सेल संस्कृतियों के लिए, एपिकल और बेसोलेटरल दोनों डिब्बों में ग्लूकोज मुक्त माध्यम (एल-ग्लूटामाइन और फिनोल लाल के बिना) जोड़ें। नॉर्मोक्सिक नियंत्रण सेल संस्कृतियों में संस्कृति माध्यम को ताजा माध्यम से बदलें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में नियंत्रण ट्रिपल संस्कृतियों को रखें।
    नोट: ओजीडी के प्रेरण से पहले या ओजीडी के तुरंत बाद मध्यम परिवर्तन यांत्रिक तनाव पैदा कर सकते हैं जो एंडोथेलियल सेल मोनोलेयर को और प्रभावित करेगा। इस प्रकार, मध्यम प्रतिस्थापन वाले चरणों को नॉर्मोक्सिक नियंत्रण सेल संस्कृतियों के लिए शामिल किया गया है।
  2. संस्कृतियों के पर्याप्त आर्द्रीकरण प्रदान करने के लिए हाइपोक्सिया इनक्यूबेटर कक्ष में 20 एमएल बाँझ पानी युक्त पेट्री डिश रखें। रिंग क्लैंप को छोड़कर चैंबर खोलें। अलमारियों पर सेल संस्कृतियों को व्यवस्थित करें। रिंग क्लैंप को सुरक्षित करके कक्ष को सील करें।
  3. कक्ष के इनलेट और आउटलेट पोर्ट दोनों खोलें। प्रवाह मीटर के शीर्ष से आने वाली टयूबिंग को कक्ष में संलग्न करें। प्रवाह मीटर के नीचे से आने वाली ट्यूबिंग को गैस टैंक में संलग्न करें जिसमें एयर फिल्टर के माध्यम से 95% एन2/5% सीओ2 का गैस मिश्रण होता है। 
  4. न्यूनतम गैस प्रवाह की अनुमति देने के लिए इसे काउंटरक्लॉकवाइज मोड़कर टैंक प्रवाह नियंत्रण वाल्व खोलें। धीरे-धीरे घड़ी की ओर मुड़कर दबाव नियामक वाल्व खोलें।
  5. 5 मिनट के लिए 20 लीटर / मिनट की प्रवाह दर पर गैस मिश्रण के साथ कक्ष को फ्लश करें। गैस स्रोत से कक्ष को डिस्कनेक्ट करें और दोनों सफेद प्लास्टिक क्लैंप को मजबूती से बंद करें।
  6. घड़ी की तरह मोड़कर टैंक प्रवाह नियंत्रण वाल्व को बंद करें। काउंटरक्लॉकवाइज मोड़कर दबाव नियामक वाल्व को बंद करें।
  7. हाइपोक्सिया कक्ष को 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पारंपरिक इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: बाद में पुन: ऑक्सीकरण अवधि जोड़ने के लिए, कोशिकाओं को डीपीबीएस के साथ 3x धोएं, सभी ट्रिपल संस्कृतियों में ताजा माध्यम जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में अतिरिक्त24 घंटे के लिए रखें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, कक्ष में शेष ऑक्सीजन एकाग्रता 20 एल / मिनट पर एनारोबिक गैस मिश्रण के साथ 4 मिनट से कम शुद्ध होने के बाद 0% है।

3. टीईआर माप

  1. निष्फल टीईईआर उपकरण को जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखें और इलेक्ट्रोड को उपकला वोल्टोहममीटर में प्लग करें। इलेक्ट्रोड को 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल समाधान के 30 एमएल में कम से कम 30 मिनट के लिए निष्फल करें।
  2. टीईईआर उपकरण चालू करें और फ़ंक्शन को ओम पर सेट करें।
  3. 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल समाधान से इलेक्ट्रोड को हटा दें और उन्हें डीपीबीएस के 20 एमएल में कम से कम 30 मिनट के लिए रखें जब तक कि टीईईआर डिवाइस पर डिजिटल रीडआउट 0 ओम नहीं पढ़ता है।
  4. खाली वेल-इंसर्ट कंट्रोल के वेल-इंसर्ट हैंगर में तीन उद्घाटनों में से एक के माध्यम से इलेक्ट्रोड के लंबे प्रोंग को डालें, इसे तब तक कम करें जब तक कि यह कुएं के निचले हिस्से को न छू ले। सुनिश्चित करें कि शॉर्ट प्रोंग वेल-इंसर्ट के नीचे एपिकल संस्कृति के ऊपर आराम कर रहा है।
    नोट: रिक्त वेल-इंसर्ट कंट्रोल में एपिकल डिब्बे में पूर्ण क्लासिक माध्यम के 2 एमएल और बेसोलेटरल डिब्बे में 1 एमएल पेरिसाइट माध्यम और 1 एमएल एस्ट्रोसाइट्स माध्यम का संयोजन शामिल है। सुनिश्चित करें कि टीईईआर माप लेते समय इलेक्ट्रोड को अच्छी तरह से सम्मिलित करने के लिए 90 डिग्री पर रखा गया है। एक ही कुएं (प्रति उद्घाटन) में प्राप्त दो या तीन रीडिंग के औसत का उपयोग करने से परिवर्तनशीलता को कम करने में मदद मिल सकती है।
  5. मान रिकॉर्ड करने से पहले टीईईआर उपकरण स्तर पर डिजिटल रीडआउट मान बंद होने तक प्रतीक्षा करें। इलेक्ट्रोड को माप के बीच धोने के लिए डीपीबीएस में वापस रखें। दो और रिक्त वेल-इंसर्ट नियंत्रणों के लिए सभी टीईआर माप एकत्र करना जारी रखें।
  6. नियंत्रण माप के लिए लिए गए चरण 3.4-3.5 का उपयोग करके नमूना प्लेटों के टीईआर माप एकत्र करें। एक बार सभी माप लेने के बाद, इलेक्ट्रोड को 30 मिनट के लिए 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल समाधान में वापस रखें। टीईईआर उपकरण से इलेक्ट्रोड को डिस्कनेक्ट करें और उन्हें हवा में सूखने दें।
  7. TEER मानों की गणना करें। नमूने के ओम मान से रिक्त वेल-इंसर्ट नियंत्रण के माध्य ओम मान को घटाने के लिए समीकरण (1) का उपयोग करें, और फिर इस प्रतिरोध मान को झिल्ली सम्मिलित (सेमी2) के क्षेत्र से गुणा करें ताकि रिपोर्ट किए गए टीईईआर मान को Ω सेमी 2 में दियाजा सके।
    Equation 1 (1)

4. बीबीबी पैरासेलुलर पारगम्यता का आकलन

नोट: लाइट बंद होने के साथ सेल कल्चर बायोसेफ्टी कैबिनेट में एफआईटीसी-डेक्सट्रान से जुड़े सभी चरणों का प्रदर्शन करें। फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ एफआईटीसी-डेक्सट्रान समाधान को कवर करें।

  1. फिनोल रेड-फ्री एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम का उपयोग करके 20 और 70 केडीए (0.1 मिलीग्राम / एमएल) के एफआईटीसी-डेक्सट्रांस युक्त समाधान तैयार करें और 1 घंटे के लिए रॉकिंग प्लेटफॉर्म शेकर पर हिलाने की अनुमति दें। 0.22 μm सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान फ़िल्टर करें।
  2. बेसोलेटरल डिब्बे से माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे ट्रिपल सेल कल्चर बीबीबी मॉडल में फिनोल लाल मुक्त एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम के 2 एमएल के साथ बदलें। हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के साथ एपिकल डिब्बे में कोशिकाओं को दो बार धोएं।
  3. एपिकल डिब्बे में एफआईटीसी-डेक्सट्रान समाधान का 1 एमएल जोड़ें और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट को कवर करें। प्लेट को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  4. बेसोलेटरल डिब्बों से 100 μL माध्यम लें और इसे एक काले 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। क्रमशः 480 एनएम और 530 एनएम पर सेट उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति को मापें।

5. जीवित कोशिकाओं में हाइपोक्सिया का पता लगाना

  1. 150,000 कोशिकाओं / डिश के घनत्व पर पॉली-डी-लाइसिन-लेपित, 35 मिमी ग्लास बॉटम व्यंजनों के केंद्र में एचबीएमईसी, एचए और एचपीवीपी के बीज 200 μL। एचबीएमईसी को सीड करने से पहले, अनुलग्नक कारक के साथ व्यंजन के निचले हिस्से को कोट करें। कोशिकाओं को सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़कर कांच की सतह से जुड़ने की अनुमति दें।
    नोट: ओजीडी के लिए हाइपोक्सिया कक्ष में ट्रिपल वेल-इंसर्ट बीबीबी मॉडल के साथ एक ही समय में मानव प्राथमिक कोशिकाओं के साथ व्यंजन रखना महत्वपूर्ण है।
  2. एक बार संगम तक पहुंचने के बाद, संस्कृति माध्यम को छोड़ दें और 2 एमएल प्रीवार्ड ग्लूकोज-मुक्त माध्यम (ओजीडी के लिए) या सामान्य माध्यम (नियंत्रण के लिए) जोड़ें, जिसमें 1 एमएम होचस्ट 33342 का 2 μL (अंतिम एकाग्रता 0.2 μM) और संदर्भित छवि-iT ग्रीन हाइपोक्सिया अभिकर्मक (अंतिम एकाग्रता 1 μM) का 5 mM स्टॉक समाधान का 0.5 μL हो। ओजीडी उपचार के बाद, सभी व्यंजनों में इमेजिंग अनुकूलित माध्यम के साथ माध्यम को बदलें।
  3. जीएफपी फिल्टर और टॉप-स्टेज कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर के साथ फ्लोरेसेंस लाइव-सेल इमेजिंग करें जैसा कि पहले14,15 वर्णित है।

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Representative Results

एचबीएमईसी के बाधा समारोह पर एस्ट्रोसाइट्स और पेरिसाइट के प्रभावों की जांच करने के लिए, हमने सेल कल्चर इंसर्ट (चित्रा 1 ए) पर ट्रिपल सेल कल्चर बीबीबी मॉडल का निर्माण किया, जिसमें एचबीएमईसी मोनोकल्चर और नियंत्रण के रूप में दो डबल सह-संस्कृति मॉडल (चित्रा 1 बी) शामिल थे। डबल सह-संस्कृति नियंत्रण में एचए के साथ एचबीएमईसी की एक गैर-संपर्क सह-संस्कृति और एबीवीपी के साथ एचबीएमईसी की संपर्क सह-संस्कृति शामिल थी। सह-संस्कृति में 6 दिनों के बाद, सभी प्रयोगात्मक सेटअप 4 घंटे के लिए ओजीडी के अधीन थे। संकेतित बीबीबी कॉन्फ़िगरेशन में एंडोथेलियल मोनोलेयर की बाधा अखंडता का मूल्यांकन ओजीडी से पहले और बाद में टीईईआर का निर्धारण करके किया गया था, साथ ही साथ 24 घंटे के पुन: ऑक्सीकरण (चित्रा 1 सी) के बाद भी किया गया था। 4 घंटे के लिए, ओजीडी ने केवल एचबीएमईसी मोनोकल्चर और एचबीएमईसी और एबीवीपी के साथ सह-संस्कृति मॉडल में टीईआर मूल्यों में महत्वपूर्ण कमी का कारण बना। ये घटा हुआ स्तर 24 घंटे के पुन: ऑक्सीकरण के बाद बेसलाइन स्तरों तक पहुंच गया। एचबीएमईसी और एचए के साथ सह-संस्कृति मॉडल पर ओजीडी का कोई प्रभाव विट्रो में इस्केमिक स्थितियों के खिलाफ एस्ट्रोसाइट्स की सुरक्षात्मक भूमिका की ओर इशारा नहीं करता है।

हालांकि ट्रिपल और एचबीएमईसी / एचबीवीपी डबल सह-संस्कृति मॉडल के बीच बेसलाइन टीईआर में कोई अंतर नहीं था, ट्रिपल सह-संस्कृति मॉडल में टीईआर मान ओजीडी के तुरंत बाद डबल सह-संस्कृति नियंत्रण या मोनोकल्चर नियंत्रण की तुलना में काफी अधिक थे, यह सुझाव देते हुए कि ट्रिपल बीबीबी मॉडल में एचए और एचपीवीपी का एकीकरण पैथोलॉजिकल परिस्थितियों में बीबीबी कार्यात्मक अखंडता को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है (चित्रा 1 सी)। ). हमने विकसित ट्रिपल कल्चर मॉडल में एंडोथेलियल मोनोलेयर में छोटे (20 केडीए) और बड़े (70 केडीए) आणविक द्रव्यमान एफआईटीसी-डेक्सट्रांस की पारगम्यता की भी जांच की। एंडोथेलियल मोनोलेयर की पैरासेलुलर पारगम्यता 20 केडीए आणविक द्रव्यमान एफआईटीसी-डेक्सट्रान में एचबीएमईसी मोनोकल्चर में काफी बढ़ गई थी और नॉर्मोक्सिक नियंत्रण (चित्रा 1 डी) की तुलना में एचबीएमईसी और एचबीवीपी के साथ सह-संस्कृति मॉडल में कुछ हद तक वृद्धि हुई थी। इसके अलावा, नॉर्मोक्सिक और ओजीडी स्थितियों के तहत सभी मॉडलों में ट्रिपल बीबीबी मॉडल में 20 केडीए एफआईटीसी-डेक्सट्रान पारगम्यता स्तर सबसे कम थे। किसी भी मॉडल (चित्रा 1 ई) में एंडोथेलियल मोनोलेयर में 70 केडीए एफआईटीसी-डेक्सट्रान फ्लक्स में कोई बदलाव नहीं देखा गया। इन आंकड़ों से पता चलता है कि इस्केमिक-हाइपोक्सिक क्षति प्लाज्मा प्रोटीन जैसे बड़े अणुओं के लिए पैरासेलुलर पारगम्यता में परिवर्तन का कारण बनने के लिए इतनी गंभीर नहीं थी।

Figure 1
चित्रा 1: मानव प्राथमिक मोनो-, सह-और ट्रिपल कल्चर बीबीबी मॉडल में ट्रांसेंडोथेलियल विद्युत प्रतिरोध और एंडोथेलियल पारगम्यता पर ऑक्सीजन-ग्लूकोज की कमी के प्रभाव। (ए) ट्रिपल प्राइमरी सेल कल्चर बीबीबी मॉडल की स्थापना के लिए योजनाबद्ध समयरेखा। (बी) इन विट्रो स्थिर मानव प्राथमिक सेल-आधारित बीबीबी मॉडल के लिए विन्यास का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एक मोनोकल्चर मॉडल में अच्छी तरह से सम्मिलित छिद्रपूर्ण झिल्ली के एपिकल पक्ष पर एचबीएमईसी बीज होता है। एक गैर-संपर्क सह-संस्कृति में अच्छी तरह से सम्मिलित समर्थन की ऊपरी सतह पर एचबीएमईसी बीज होता है और एचए को संस्कृति के निचले हिस्से में अच्छी तरह से बीज दिया जाता है। एक संपर्क सह-संस्कृति मॉडल में ऊपरी सतह पर एचबीएमईसी के साथ अच्छी तरह से सम्मिलित समर्थन की निचली सतह पर एबीवीपी शामिल है। ट्रिपल कल्चर मॉडल के लिए, एचबीएमईसी को समर्थन की ऊपरी सतह पर बीज दिया जाता है, जिसमें निचली सतह पर एबीवीपी को बीज दिया जाता है और एचए को कल्चर कुओं के निचले हिस्से पर बीज दिया जाता है। (ग) टीईईआर में परिवर्तनों की निगरानी ओजीडी से ठीक पहले, ओजीडी के 4 घंटे के बाद और पुन: ऑक्सीकरण के 24 घंटे के बाद की जाती है। डेटा को एसईएम (एन = 5-6) ± माध्य के रूप में दर्शाया गया है। मोनो- और सह-संस्कृति मॉडल (दो-तरफ़ा एनोवा) की तुलना में पी < 0.0001। (डी) एंडोथेलियल मोनोलेयर में 20 केडीए एफआईटीसी-डेक्सट्रान के लिए पैरासेल्युलर पारगम्यता को ओजीडी के 4 घंटे के बाद मापा गया था। (ई) एंडोथेलियल मोनोलेयर में 70 केडीए एफआईटीसी-डेक्सट्रान के लिए पैरासेल्युलर पारगम्यता ओजीडी के 4 घंटे के बाद मापा गया था। डेटा को एसडी (एन = 5-6) ± माध्य के रूप में दर्शाया गया है। * पी < 0.05. पी < 0.0001 (दो-तरफा एनोवा)। संक्षेप: ओजीडी = ऑक्सीजन-ग्लूकोज की कमी; टीईईआर = ट्रांसेंडोथेलियल विद्युत प्रतिरोध; एचबीएमईसी = मानव मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं; एचए = मानव एस्ट्रोसाइट्स; HBVP = मानव मस्तिष्क संवहनी पेरिसाइट्स; एफआईटीसी-डेक्सट्रान = डेक्सट्रान फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट से संयुग्मित; arb. इकाइयाँ = मनमानी इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ओजीडी-प्रेरित हाइपोक्सिक चोट को सत्यापित करने के लिए, एचबीएमईसी, एचए और एचबीवीपी को 35 मिमी ग्लास बॉटम व्यंजनों के कुओं में सुसंस्कृत किया गया था और हाइपोक्सिया अभिकर्मक से भरा गया था, जिसका फ्लोरोसेंट सिग्नल कम ऑक्सीजन के स्तर के साथ बढ़ गया था। ओजीडी के संपर्क में आने वाले सभी प्राथमिक मानव प्रकारों ने मजबूत हरे रंग की प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन किया, यह साबित करते हुए कि छवि वाली जीवित कोशिकाएं हाइपोक्सिक थीं (चित्रा 2)। ओजीडी प्रोटोकॉल के बाद बाधा गुणों पर बीबीबी मॉडल में विभिन्न पेरिवास्कुलर सेल प्रकारों (एस्ट्रोसाइट्स और पेरिसाइट्स) के प्रभावों का अनुमान लगाने के बाद, हमने निष्कर्ष निकाला कि ट्रिपल मॉडल परीक्षण किए गए अन्य बीबीबी मॉडल से बेहतर था।

Figure 2
चित्रा 2: ऑक्सीजन-ग्लूकोज की कमी के 4 घंटे के बाद हाइपोक्सिक प्राथमिक मानव मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं, मानव एस्ट्रोसाइट्स और मानव मस्तिष्क संवहनी पेरिसाइट का लाइव धुंधलापन। ओजीडी एक्सपोजर 4 घंटे के लिए हाइपोक्सिया अभिकर्मक और ग्लूकोज मुक्त माध्यम का उपयोग करके सभी प्राथमिक कोशिकाओं (एचबीएमईसी, एचए और एचबीवीपी) पर किया गया था। चार स्वतंत्र प्रयोगों के परिणाम दिखाए गए हैं। संस्कृतियों को 20x आवर्धन पर चित्रित किया गया था। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षेप: ओजीडी = ऑक्सीजन-ग्लूकोज की कमी; एचबीएमईसी = मानव मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं; एचए = मानव एस्ट्रोसाइट्स; HBVP = मानव मस्तिष्क संवहनी पेरिसाइट्स; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम विट्रो में इस्केमिक स्ट्रोक की स्थापना में बीबीबी डिसफंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय ट्रिपल एंडोथेलियल सेल-पेरिसाइट-एस्ट्रोसाइट कल्चर बीबीबी मॉडल स्थापित करने की एक विधि का वर्णन करते हैं। यह देखते हुए कि पेरिसाइट्स विवो में एंडोथेलियल कोशिकाओं के निकटतम पड़ोसी हैं, इस मॉडल16 में अच्छी तरह से डालने के नीचे एचपीवीपी को चढ़ाया जाता है। यद्यपि इस विन्यास में एस्ट्रोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच प्रत्यक्ष सेल-टू-सेल संचार का अभाव है, यह व्यवस्था स्रावित घुलनशील कारकों के माध्यम से सेल प्रकारों के बीच अप्रत्यक्ष सेल-टू-सेल संचार की अनुमति देती है। इस प्रणाली में एस्ट्रोसाइट्स और पेरिसाइट की उपस्थिति एचबीएमईसी अखंडता में काफी सुधार करती है, जिससे मोनोलेयर की पैरासेलुलर पारगम्यता छोटे आकार के ट्रेसर तक सीमित हो जाती है। इसके अतिरिक्त, एस्ट्रोसाइट्स और पेरिसाइट का ओजीडी स्थितियों में एचबीएमईसी पर सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है।

विकसित प्रोटोकॉल में, हमने बेसोलेटरल डिब्बे के लिए सेल अनुपात (1: 1: 1) और संस्कृति माध्यम मिश्रण को अनुकूलित किया। ट्रिपल बीबीबी मॉडल ने सह-संवर्धन के 6 दिनों के बाद नियंत्रण एचबीएमईसी मोनोकल्चर (112 ± 11 Ω सेमी 2) की तुलना में लगभग2.5 गुना अधिक टीईआर मान (239 ± 9 Ω सेमी 2) प्रदर्शित किया, जो उचित एचबीएमईसी मोनोलेयर गठन के लिए आवश्यक समय17,18 था। इस ट्रिपल मॉडल में प्राप्त टीईआर मान अन्य पहले वर्णित ट्रिपल मॉडल के साथ तुलनीय हैं, जिसमें एचए एचबीएमईसी के संपर्क में थे और एचपीवीपी को प्लेट कुओं19 के निचले हिस्से पर बीज दिया गया था। एक ही सेल कॉन्फ़िगरेशन और ओजीडी एक्सपोजर समय के साथ अन्य मानव प्राथमिक सेल ट्रिपल कल्चर मॉडल में, बेसलाइन टीईईआर मान इस काम में उन लोगों की तुलना में काफी कम थे और मानक स्तर (100 Ω सेमी2)20 तक नहीं पहुंचे थे। बड़े डिब्बों के साथ 6-अच्छी तरह से सम्मिलित प्लेटों के उपयोग ने हमें सेल आबादी के बीच पदार्थ विनिमय के व्यवधान से बचने के लिए मध्यम परिवर्तन आवृत्ति को कम करने की अनुमति दी।

ओजीडी प्रयोगों को एक सील हाइपोक्सिया इनक्यूबेटर कक्ष का उपयोग करके किया गया था जिसमें एनारोबिक गैस मिश्रण (95% नाइट्रोजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड) था। इस प्रोटोकॉल के मुख्य लाभों में से एक यह है कि इस्केमिक चोट की गंभीरता को ओजीडी अवधि की लंबाई को बदलकर विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए आसानी से समायोजित किया जा सकता है। टीईईआर और डेक्सट्रान पारगम्यता का मूल्यांकन करने के बाद, ओजीडी के 4 घंटे ने निर्मित ट्रिपल मॉडल में बीबीबी अखंडता से समझौता नहीं किया। इसलिए, विट्रो में इस्केमिक स्ट्रोक का अध्ययन करने के लिए, बीबीबी टूटने को प्रेरित करने के लिए ओजीडी के लंबे समय तक संपर्क को लागू करने की आवश्यकता होती है। प्रोटोकॉल में प्रदान की गई लाइव-सेल इमेजिंग, विभिन्न सेल प्रकारों की वास्तविक समय की निगरानी और ओजीडी चोट के सत्यापन की अनुमति देती है, जो कई अध्ययनों में एक लाभ का प्रतिनिधित्व करती है।

इस प्रोटोकॉल में, इस ट्रिपल बीबीबी मॉडल के लिए आधार के रूप में 0.4 μm पॉलिएस्टर वेल-इंसर्ट को चुना गया था। एक पॉलिएस्टर झिल्ली को प्रतिदीप्ति-इमेजिंग अनुप्रयोगों में सेल विज़ुअलाइज़ेशन के लिए सबसे अच्छा सम्मिलित प्रकार माना जाता है, जो यदि आवश्यक हो तो तंग जंक्शन प्रोटीन और ट्रांसपोर्टरों के संशोधनों की कल्पना करने का एक उत्कृष्ट अवसर प्रदान करता है। जबकि चयनित छोटे छिद्र व्यास एंडोथेलियल मोनोलेयर में छोटे हाइड्रोफिलिक अणुओं के लिए कम पारगम्यता बनाता है, यह ट्रांसेंडोथेलियल माइग्रेशन परख के लिए वर्तमान ट्रिपल बीबीबी मॉडल के संभावित अनुप्रयोग को भी सीमित करता है, जिसमें 3 μm या 8 μm छिद्र आकार की आवश्यकता होती है।

अंत में, इस मॉडल की एक और सीमा कतरनी तनाव की कमी से संबंधित हो सकती है, जिसे इन विट्रो सिस्टम21 में गतिशील ट्रिपल बीबीबी में तंग जंक्शनों के गठन को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। निष्कर्ष में, प्राथमिक मानव कोशिकाओं से बना स्थापित मजबूत और शारीरिक रूप से प्रासंगिक ट्रिपल कल्चर बीबीबी मॉडल, दवा स्क्रीनिंग और इस्केमिक स्ट्रोक से जुड़े बीबीबी डिसफंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।

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Disclosures

सभी लेखकों ने खुलासा किया कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान एमएच 128022, एमएच 122235, एमएच 072567, एमएच 122235, एचएल 126559, डीए044579, डीए039576, डीए040537, डीए050528 और डीए047157 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3450
35 mm Glass Bottom Dishes MatTek Life Sciences (FISHERSCI) P35GC-1.5-14-C
Astrocyte Medium Science Cell 1801
Attachment Factor Cell Systems (Fisher Scientific) 4Z0-201
BD 60 mL Syringe BD 309653
BrainPhys Imaging Optimized Medium STEMCELL Technologies 5791
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost 4Z0-500 Cell Systems
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap VWR 430829
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask  Corning 431464U
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates Corning 3340
Countes Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
Countess II FL Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific ZGEXSCCOUNTESS2FL
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution  Fisher Scientific  04-355-71
Disposable Petri Dishes VWR 25384-088
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) ThermoFisher A14430-01 Glucose-free medium
DPBS (No Calcium, No Magnesium) ThermoFisher 14190250
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL Lonza CC-3129
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes World Precison Instruments NC9792051 Epithelial voltohmmeter 
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) Millipore Sigma FD20-250MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) Millipore Sigma FD70S-250MG
Fluorview FV3000 Confocal Microscope Olympus FV3000
Gas Tank (95% N2, 5% CO2) Airgas X02NI95C2003071
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) Thermofisher 14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water ThermoFisher H3570
Human Astrocytes Science Cell 1800
Human Brain Vascular Pericytes Science Cell 1200
Hypoxia Incubator Chamber STEMCELL Technologies 27310
Image-iT Green Hypoxia Reagent ThermoFisher I14834
Pericyte Medium Science Cell 1201
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells ACBRI 376 Cell Systems
Rocking Platform Shaker, Double VWR 10860-658
Single Flow Meter STEMCELL Technologies 27311
SpectraMax iD3 Microplate Reader Molecular Devices 75886-128
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile NEST Scientific 380121
TPP Mutli-well Plates (6 wells) MidSci TP92406
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks MidSci TP90075 Flasks with activated surface for cell adhesion
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher 25200056
UltraPure Distilled Water Invitrogen (Life Technologies) 10977-015
Uno Stage Top Incubator- Oko Lab UNO-T-H-CO2-TTL

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References

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जैव रसायन अंक 188
<em>विट्रो</em> में इस्केमिक स्ट्रोक का अध्ययन करने के लिए मानव रक्त-मस्तिष्क बाधा का एक ट्रिपल प्राथमिक सेल संस्कृति मॉडल
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Fattakhov, N., Torices, S., Becker,… More

Fattakhov, N., Torices, S., Becker, S., Teglas, T., Naranjo, O., Toborek, M. A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro. J. Vis. Exp. (188), e64469, doi:10.3791/64469 (2022).

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