Summary
Aquí, describimos el método para establecer un modelo de cultivo celular triple de la barrera hematoencefálica basado en células endoteliales microvasculares primarias del cerebro humano, astrocitos y pericitos. Este modelo multicelular es adecuado para estudios de disfunción de unidades neurovasculares durante el ictus isquémico in vitro o para el cribado de candidatos a fármacos.
Abstract
El accidente cerebrovascular isquémico es una causa importante de muerte y discapacidad en todo el mundo con opciones terapéuticas limitadas. La neuropatología del accidente cerebrovascular isquémico se caracteriza por una interrupción en el suministro de sangre al cerebro que conduce a la muerte celular y la disfunción cognitiva. Durante y después del accidente cerebrovascular isquémico, la disfunción de la barrera hematoencefálica (BHE) facilita la progresión de la lesión y contribuye a una recuperación deficiente del paciente. Los modelos actuales de BBB incluyen principalmente monocultivos endoteliales y cocultivos dobles con astrocitos o pericitos.
Tales modelos carecen de la capacidad de imitar completamente un microambiente cerebral dinámico, que es esencial para la comunicación de célula a célula. Además, los modelos de BBB comúnmente utilizados a menudo contienen células endoteliales humanas inmortalizadas o cultivos celulares derivados de animales (roedores, porcinos o bovinos) que plantean limitaciones de traducción. Este artículo describe un nuevo modelo de BBB basado en bien insertados que contiene solo células humanas primarias (células endoteliales microvasculares cerebrales, astrocitos y pericitos vasculares cerebrales) que permite la investigación de la lesión cerebral isquémica in vitro.
Los efectos de la privación de oxígeno-glucosa (OGD) sobre la integridad de la barrera se evaluaron mediante mediciones de permeabilidad pasiva, resistencia eléctrica transendotelial (TEER) y visualización directa de células hipóxicas. El protocolo presentado ofrece una clara ventaja al imitar el entorno intercelular de la BHE in vivo, sirviendo como un modelo de BHE in vitro más realista para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas en el contexto de la lesión cerebral isquémica.
Introduction
El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte y discapacidad a largo plazo en todo el mundo1. La incidencia de accidente cerebrovascular aumenta rápidamente con la edad, duplicándose cada 10 años después de los 55 años2. El accidente cerebrovascular isquémico ocurre como resultado de la interrupción del flujo sanguíneo cerebral debido a eventos trombóticos y embólicos, que abarca más del 80% de todos los casos de accidente cerebrovascular3. Incluso ahora, hay relativamente pocas opciones de tratamiento disponibles para minimizar la muerte del tejido después de un accidente cerebrovascular isquémico. Los tratamientos que existen son sensibles al tiempo y, en consecuencia, no siempre conducen a buenos resultados clínicos. Por lo tanto, se necesita urgentemente investigación sobre los mecanismos celulares complejos del accidente cerebrovascular isquémico que afectan la recuperación posterior al accidente cerebrovascular.
La barrera hematoencefálica es una interfaz dinámica para el intercambio de moléculas entre la sangre y el parénquima cerebral. Estructuralmente, la BHE está compuesta por células endoteliales microvasculares cerebrales interconectadas por complejos de unión rodeados por una membrana basal, pericitos y patas terminales astrocíticas4. Los pericitos y astrocitos juegan un papel esencial en el mantenimiento de la integridad de la barrera hematoencefálica a través de la secreción de diversos factores necesarios para la formación de uniones fuertes y estrechas 5,6. La ruptura de la barrera hematoencefálica es una de las características distintivas del accidente cerebrovascular isquémico. La respuesta inflamatoria aguda y el estrés oxidativo asociado con la isquemia cerebral dan como resultado la interrupción de los complejos de proteínas de unión estrecha y la diafonía desregulada entre astrocitos, pericitos y células endoteliales, lo que conduce a una mayor permeabilidad al soluto paracelular a través de la barrera hematoencefálica7. La disfunción BBB promueve aún más la formación de edema cerebral y aumenta el riesgo de transformación hemorrágica8. Teniendo en cuenta todo lo anterior, existe un gran interés en comprender los cambios moleculares y celulares que ocurren a nivel de BBB durante y después del accidente cerebrovascular isquémico.
Aunque muchos modelos de BBB in vitro han sido desarrollados en las últimas décadas y utilizados en una variedad de estudios, ninguno de ellos puede replicar completamente las condiciones in vivo 9. Si bien algunos modelos se basan en monocapas de células endoteliales cultivadas en soportes permeables bien insertados solos o en combinación con pericitos o astrocitos, solo estudios más recientes han introducido diseños de modelos de cultivo celular triple. Casi todos los modelos existentes de triple cultivo de BBB incorporan células endoteliales cerebrales primarias junto con astrocitos y pericitos aislados de especies animales o células derivadas de células madre pluripotentes humanas10,11,12,13.
Reconociendo la necesidad de recapitular mejor la BHE humana in vitro, establecimos un modelo de triple cultivo celular in vitro BBB compuesto por células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC), astrocitos humanos primarios (HA) y pericitos vasculares cerebrales humanos primarios (HBVP). Este modelo BBB de triple cultivo se configura en placas de 6 pocillos, insertos de membrana de poliéster con un tamaño de poro de 0,4 μm. Estos insertos de pozo proporcionan un entorno óptimo para la unión celular y permiten un fácil acceso a los compartimentos apical (sangre) y basolateral (cerebro) para el muestreo del medio o la aplicación de compuestos. Las características de este modelo propuesto de BBB de cultivo triple celular se evalúan midiendo TEER y flujo paracelular después de OGD imitando el accidente cerebrovascular isquémico in vitro, con una escasez de oxígeno (<1%O2) y nutrientes (mediante el uso de medio libre de glucosa) lograda mediante el uso de una cámara humidificada y sellada. Además, las condiciones isquémicas inducidas en este modelo se verifican con precisión mediante la visualización directa de células hipóxicas.
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Protocol
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todas las células, materiales, equipos y soluciones utilizados en este protocolo.
1. Ajuste del modelo BBB de cultivo celular triple
- Siembra de pericitos
- Cultivar HBVP en matraces de cultivo T75 con una superficie activada para la adhesión celular dentro de una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C hasta que sea confluente. Una vez alcanzada la confluencia, aspire el medio pericito viejo y lave las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Aspirar el DPBS y separar las células del matraz utilizando una combinación de 4 ml de solución tibia de tripsina-EDTA y 1 ml de DPBS.
NOTA: Evite usar pasajes posteriores a P7. - Incubar el matraz durante 5 min a 37 °C en una incubadora deCO2 . Ver bajo un microscopio para confirmar si las células están separadas del matraz. Añadir 5 ml de medio de pericito caliente (que contenga 2% de suero fetal bovino [FBS]) al matraz y transferir las células desprendidas a un tubo de centrífuga de 50 ml.
- Centrifugar la suspensión celular durante 3 min a 200 × g, permitiendo que las células formen un pellet en el fondo del tubo. Aspire el medio del tubo, asegurándose de que el pellet de la célula permanezca intacto.
- Resuspender el pellet celular en medio pericito; Calcule la cantidad de medio dependiendo de la confluencia de las células y el número de insertos de pozo necesarios. Tome 10 μL de las células resuspendidas, colóquelas en un portaobjetos de conteo de células y cuente el número de células.
- Determinar la densidad celular y sembrar 300.000 células/inserto en 1 mL de medio pericito en el lado abluminal de los insertos de pozo (formato de 6 pocillos).
NOTA: Al sembrar HBVP en la parte inferior de los insertos, es muy importante voltear primero las placas de inserción de pozo al revés. Mientras la placa se coloca plana sobre una superficie, retire la sección inferior para exponer el lado abluminal de los insertos del pozo. Después de agregar la suspensión de células pericitarias en el lado abluminal, cubra los insertos de pozo con la placa volteada para evitar la evaporación. Mantener todas las placas boca abajo en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante la noche.
- Cultivar HBVP en matraces de cultivo T75 con una superficie activada para la adhesión celular dentro de una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C hasta que sea confluente. Una vez alcanzada la confluencia, aspire el medio pericito viejo y lave las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Aspirar el DPBS y separar las células del matraz utilizando una combinación de 4 ml de solución tibia de tripsina-EDTA y 1 ml de DPBS.
- Siembra de astrocitos
- Cultivar HA en matraces T75 dentro de una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C hasta alcanzar la confluencia. Siga los pasos anteriores 1.1.1-1.1.4 utilizando medio de astrocito (que también contiene 2% de FBS) en lugar de medio de pericito.
NOTA: Evite usar pasajes posteriores a P9. - Determinar la densidad celular y sembrar 300.000 células/pocillo en el fondo de las placas de cultivo de tejido de 6 pocillos. Cubra la placa para evitar la evaporación y mantenga todas las placas en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante la noche.
- Cultivar HA en matraces T75 dentro de una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C hasta alcanzar la confluencia. Siga los pasos anteriores 1.1.1-1.1.4 utilizando medio de astrocito (que también contiene 2% de FBS) en lugar de medio de pericito.
- Siembra de células endoteliales
- Cultivar HBMEC en placas de cultivo de tejidos dentro de una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C hasta que sea confluente. Siga los pasos anteriores 1.1.1-1.1.4 utilizando un medio clásico completo (que contenga un 10% de FBS) en lugar de un medio pericito.
NOTA: Evite usar pasajes posteriores a P12. - Extraer las placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos que contienen astrocitos y los insertos de pocillos (formato de 6 pocillos) que contienen pericitos de la incubadora deCO2 al 5% a 37 °C. Aspirar el medio astrocito a partir de las placas de cultivo de tejido de 6 pocillos. Agregue 1 ml de medio de pericito y 1 ml de medio de astrocito a cada pocillo.
- Aspirar el medio pericito de los insertos de pocillos y colocarlos en las placas de cultivo de tejido de 6 pocillos que contienen los astrocitos sembrados. Semilla de HBMEC a una densidad de 300.000 células/pocillo en 2 ml de medio clásico completo en el lado apical de los mismos insertos de pozo.
NOTA: Las células endoteliales deben sembrarse en el lado apical de los insertos de pocillos al día siguiente después de sembrar pericitos en el lado abluminal de los insertos de pocillos y astrocitos en placas de cultivo de tejido de 6 pocillos. Las células deben mantenerse en cultivo triple durante 6 días para inducir propiedades similares a las de la barrera hematoencefálica. El medio de cultivo celular debe cambiarse en ambos compartimentos bien insertados 24 h antes de los experimentos.
- Cultivar HBMEC en placas de cultivo de tejidos dentro de una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C hasta que sea confluente. Siga los pasos anteriores 1.1.1-1.1.4 utilizando un medio clásico completo (que contenga un 10% de FBS) en lugar de un medio pericito.
2. Inducción de la privación de oxígeno-glucosa
- Lave las celdas 3 veces con DPBS. Para cultivos celulares triples sometidos a OGD, añadir medio libre de glucosa (sin L-glutamina y rojo fenol) a los compartimentos apical y basolateral. Sustituir el medio de cultivo por medio fresco en cultivos celulares de control normóxico. Colocar cultivos triples de control en la incubadora deCO2 al 5% a 37 °C.
NOTA: Los cambios en el medio antes de la inducción de la OGD o inmediatamente después de la OGD pueden crear estrés mecánico que afectaría aún más a las monocapas de células endoteliales. Por lo tanto, se incluyen los pasos con reemplazo medio para cultivos celulares de control normóxico. - Coloque una placa de Petri que contenga 20 ml de agua estéril en la cámara de la incubadora de hipoxia para proporcionar una humidificación adecuada de los cultivos. Abra la cámara soltando la abrazadera del anillo. Coloque los cultivos celulares en los estantes. Selle la cámara asegurando la abrazadera del anillo.
- Abra los puertos de entrada y salida de la cámara. Conecte el tubo que viene de la parte superior del medidor de flujo a la cámara. Conecte el tubo proveniente de la parte inferior del medidor de flujo al tanque de gas que contiene la mezcla de gases de 95% N 2/5% CO2a través de un filtro de aire.
- Abra la válvula de control de flujo del tanque girándola en sentido contrario a las agujas del reloj para permitir un flujo de gas mínimo. Abra lentamente la válvula reguladora de presión girando en el sentido de las agujas del reloj.
- Enjuague la cámara con la mezcla de gases a un caudal de 20 L/min durante 5 min. Desconecte la cámara de la fuente de gas y cierre firmemente ambas abrazaderas de plástico blanco.
- Apague la válvula de control de flujo del tanque girando en el sentido de las agujas del reloj. Cierre la válvula reguladora de presión girando en sentido contrario a las agujas del reloj.
- Colocar la cámara de hipoxia en una incubadora convencional a 37 °C durante 4 h.
NOTA: Para agregar el período de reoxigenación posterior, lave las células 3 veces con DPBS, agregue medio fresco en todos los cultivos triples y mantenga durante 24 h adicionales en la incubadora deCO2 al 5% a 37 ° C. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, la concentración de oxígeno que queda en la cámara es del 0% después de no menos de 4 minutos de purga con mezcla de gases anaeróbicos a 20 L / min.
3. Mediciones TEER
- Coloque el instrumento TEER esterilizado en el gabinete de bioseguridad y enchufe los electrodos en el voltohmímetro epitelial. Esterilice los electrodos en 30 ml de solución de alcohol isopropílico al 70% durante un mínimo de 30 min.
- Encienda el instrumento TEER y ajuste la función a ohmios.
- Retire los electrodos de la solución de alcohol isopropílico al 70% y colóquelos en 20 ml de DPBS durante un mínimo de 30 minutos hasta que la lectura digital en el dispositivo TEER lea 0 ohmios.
- Inserte la clavija larga del electrodo a través de una de las tres aberturas en la percha de inserción de pozo del control de inserción de pozo en blanco, bajándola hasta que toque el fondo del pozo. Asegúrese de que la púa corta descanse sobre el cultivo apical en la parte inferior del inserto del pozo.
NOTA: El control de inserción de pocillos en blanco está compuesto por 2 ml de medio clásico completo en el compartimiento apical y una combinación de 1 ml de medio pericito y 1 ml de medio de astrocito en el compartimiento basolateral. Asegúrese de que los electrodos se mantengan a 90° del inserto del pozo mientras realiza la medición TEER. Usar el promedio de dos o tres lecturas obtenidas en el mismo pozo (por apertura) puede ayudar a disminuir la variabilidad. - Espere hasta que los valores de lectura digital en el instrumento TEER se nivelen antes de registrar el valor. Vuelva a colocar los electrodos en DPBS para lavarlos entre mediciones. Continúe recopilando todas las mediciones TEER para dos controles más de inserción de pozos en blanco.
- Recopile las mediciones TEER de las placas de muestra utilizando los pasos 3.4-3.5 tomados para las mediciones de control. Una vez que se hayan tomado todas las mediciones, vuelva a colocar el electrodo en la solución de alcohol isopropílico al 70% durante 30 minutos. Desconecte los electrodos del instrumento TEER y deje que se sequen al aire.
- Calcule los valores TEER. Use la ecuación (1) para restar el valor medio de ohmios del control de inserción de pozo en blanco del valor de ohmios de la muestra, y luego multiplique este valor de resistencia por el área del inserto de membrana (cm 2) para obtener el valor TEER informado en Ω∙cm2.
(1)
(1)4. Evaluación de la permeabilidad paracelular BBB
NOTA: Realice todos los pasos que involucren FITC-dextrano en un gabinete de bioseguridad de cultivo celular con las luces apagadas. Cubra las soluciones FITC-dextrano con papel de aluminio para minimizar el fotoblanqueo.
- Preparar soluciones que contengan FITC-dextranos de 20 y 70 kDa (0,1 mg/ml) utilizando medio de crecimiento de células endoteliales libres de rojo fenol y dejar agitar en un agitador de plataforma oscilante durante 1 h. Filtrar las soluciones con un filtro de jeringa de 0,22 μm.
- Aspirar el medio del compartimiento basolateral y reemplazarlo con 2 ml de medio de crecimiento de células endoteliales libres de rojo de fenol en el modelo de BBB de cultivo de células triples. Lave las células en el compartimiento apical dos veces con la solución salina balanceada de Hanks (HBSS).
- Agregue 1 ml de la solución de FITC-dextrano en el compartimiento apical y cubra la placa con papel de aluminio. Colocar la placa en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante 1 h.
- Tome 100 μL de medio de los compartimentos basolaterales y transfiéralo a una placa negra de 96 pocillos. Mida la fluorescencia utilizando un lector de microplacas con las longitudes de onda de excitación y emisión establecidas en 480 nm y 530 nm, respectivamente.
5. Detección de hipoxia en células vivas
- Semilla de 200 μL de HBMEC, HA y HBVP en el centro de platos con fondo de vidrio de 35 mm recubiertos de poli-d-lisina a una densidad de 150.000 células/plato. Antes de sembrar HBMEC, cubra la parte inferior de los platos con el factor de fijación. Permita que las células se adhieran a la superficie del vidrio dejándolas durante la noche a 37 °C en una incubadora deCO2 .
NOTA: Es importante colocar platos con células primarias humanas al mismo tiempo con un modelo de BBB de triple inserción en una cámara de hipoxia para OGD. - Una vez alcanzada la confluencia, desechar el medio de cultivo y añadir 2 ml de medio libre de glucosa precalentado (para OGD) o medio normal (para controles) que contenga 2 μL de 1 mM Hoechst 33342 (concentración final 0,2 μM) y 0,5 μL de solución madre de 5 mM del reactivo de hipoxia verde Image-iT referenciado (concentración final 1 μM). Después del tratamiento con OGD, reemplace el medio con un medio optimizado para imágenes en todos los platos.
- Realice imágenes fluorescentes de células vivas con el filtro GFP y la incubadora de microscopio confocal de etapa superior como se describió anteriormente14,15.
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Representative Results
Para examinar los efectos de los astrocitos y pericitos en la función de barrera de HBMEC, construimos el modelo BBB de cultivo celular triple en insertos de cultivo celular (Figura 1A) junto con monocultivo HBMEC y dos modelos de doble cocultivo como controles (Figura 1B). Los controles de cocultivo doble incluyeron un cocultivo sin contacto de HBMEC con AH y un cocultivo de contacto de HBMEC con HBVP. Después de 6 días en cocultivo, todas las configuraciones experimentales se sometieron a OGD durante 4 h. La integridad de barrera de la monocapa endotelial en las configuraciones BBB indicadas se evaluó determinando TEER antes y después de OGD, así como después de 24 h de reoxigenación (Figura 1C). Durante 4 h, la OGD causó una disminución significativa en los valores de TEER solo en el monocultivo HBMEC y el modelo de cocultivo con HBMEC y HBVP. Estos niveles disminuidos alcanzaron los niveles basales después de 24 h de reoxigenación. Ningún efecto de la OGD en el modelo de cocultivo con HBMEC y HA señaló el papel protector de los astrocitos contra las condiciones isquémicas in vitro.
Aunque no hubo diferencias en el TEER basal entre los modelos de cocultivo triple y doble HBMEC/HBVP, los valores de TEER en el modelo de cocultivo triple fueron significativamente más altos que los de los controles de doble cocultivo o control de monocultivo inmediatamente después de la OGD, lo que sugiere que la integración de AH y HBVP en el modelo triple BBB juega un papel crítico en el mantenimiento de la integridad funcional de la BHE en condiciones patológicas (Figura 1C ). También investigamos la permeabilidad de FITC-dextranos de masa molecular pequeña (20 kDa) y grande (70 kDa) a través de la monocapa endotelial en el modelo de triple cultivo desarrollado. La permeabilidad paracelular de las monocapas endoteliales a 20 kDa de masa molecular FITC-dextrano se incrementó drásticamente en el monocultivo HBMEC y, en menor medida, en el modelo de cocultivo con HBMEC y HBVP en comparación con los controles normóxicos (Figura 1D). Además, los niveles de permeabilidad FITC-dextrano de 20 kDa fueron los más bajos en el modelo triple BBB entre todos los modelos en condiciones normóxicas y OGD. No se observaron cambios en el flujo de 70 kDa FITC-dextrano a través de monocapas endoteliales en ninguno de los modelos (Figura 1E). Estos datos sugieren que el daño isquémico-hipóxico no fue tan grave como para causar cambios en la permeabilidad paracelular a moléculas grandes como las proteínas plasmáticas.
Figura 1: Efectos de la privación de oxígeno-glucosa sobre la resistencia eléctrica transendotelial y la permeabilidad endotelial en modelos humanos primarios de mono, cocultivo y triple BBB. (A) Cronología esquemática para el establecimiento del modelo de BBB de triple cultivo celular primario. (B) Representaciones esquemáticas de las configuraciones para modelos estáticos in vitro basados en células primarias humanas basadas en BBB. Un modelo de monocultivo contiene HBMEC sembrado en el lado apical de la membrana porosa de inserción de pozo. Un cocultivo sin contacto contiene HBMEC sembrado en la superficie superior del soporte de inserción de pozo y HA sembrado en la parte inferior del pozo de cultivo. Un modelo de cocultivo de contacto incluye HBVP sembrado en la superficie inferior del soporte de inserción de pozo con HBMEC en la superficie superior. Para el modelo de cultivo triple, los HBMEC se siembran en la superficie superior del soporte, con HBVP en la superficie inferior y HA en la parte inferior de los pozos de cultivo. (C) Cambios en el TEER monitoreados inmediatamente antes de la OGD, después de 4 h de OGD y después de 24 h de reoxigenación. Datos representados como media ± SEM (n = 5-6). P < 0,0001 en comparación con los modelos de monocultivo y cocultivo (ANOVA bidireccional). (D) La permeabilidad paracelular a 20 kDa FITC-dextrano a través de monocapas endoteliales se midió después de 4 h de OGD. (E) La permeabilidad paracelular a 70 kDa FITC-dextrano a través de monocapas endoteliales se midió después de 4 h de OGD. Datos representados como media ± DE (n = 5-6). *P < 0,05. P < 0,0001 (ANOVA bidireccional). Abreviaturas: OGD = privación de oxígeno-glucosa; TEER = resistencia eléctrica transendotelial; HBMEC = células endoteliales microvasculares del cerebro humano; HA = astrocitos humanos; HBVP = pericitos vasculares del cerebro humano; FITC-dextrano = dextrano conjugado con isotiocianato de fluoresceína; Arb. unidades = unidades arbitrarias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para verificar la lesión hipóxica inducida por OGD, HBMEC, HA y HBVP se cultivaron en los pocillos de platos con fondo de vidrio de 35 mm y se cargaron con el reactivo de hipoxia, cuya señal fluorescente aumentó con niveles reducidos de oxígeno. Todos los tipos humanos primarios expuestos a OGD exhibieron una fuerte fluorescencia verde, lo que demuestra que las células vivas fotografiadas eran hipóxicas (Figura 2). Después de estimar los efectos de tener diferentes tipos de células perivasculares (astrocitos y pericitos), o su combinación en el modelo BBB sobre las propiedades de barrera siguiendo un protocolo OGD, concluimos que el modelo triple fue superior a los otros modelos BBB probados.
Figura 2: Tinción viva de células endoteliales microvasculares primarias hipóxicas del cerebro humano, astrocitos humanos y pericitos vasculares del cerebro humano después de 4 h de privación de oxígeno-glucosa. Las exposiciones a OGD se llevaron a cabo en todas las células primarias (HBMEC, HA y HBVP) utilizando un reactivo de hipoxia y un medio libre de glucosa durante 4 h. Se muestran los resultados de cuatro experimentos independientes. Las culturas fueron fotografiadas con un aumento de 20x. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: OGD = privación de oxígeno-glucosa; HBMEC = células endoteliales microvasculares del cerebro humano; HA = astrocitos humanos; HBVP = pericitos vasculares del cerebro humano; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este protocolo, describimos un método para establecer un modelo fiable de cultivo de BBB triple de células endoteliales-pericito-astrocitos para estudiar la disfunción de la BHE en el contexto de un accidente cerebrovascular isquémico in vitro. Teniendo en cuenta que los pericitos son los vecinos más cercanos de las células endoteliales in vivo, el HBVP está plateado en la parte inferior de los insertos de pocillos en este modelo16. Aunque esta configuración carece de la comunicación directa de célula a célula entre los astrocitos y las células endoteliales, esta disposición permite la comunicación indirecta de célula a célula entre los tipos de células a través de factores solubles secretados. La presencia de astrocitos y pericitos en este sistema mejora en gran medida la integridad del HBMEC, limitando la permeabilidad paracelular de la monocapa a trazadores de pequeño tamaño. Además, los astrocitos y pericitos tienen un efecto protector sobre HBMEC en condiciones de OGD.
En el protocolo desarrollado, optimizamos la relación celular (1:1:1) y la mezcla de medios de cultivo para el compartimiento basolateral. El modelo triple BBB mostró valores TEER casi 2,5 veces más altos (239 ± 9 Ω·cm 2) que el monocultivo HBMEC de control (112 ± 11 Ω·cm2) después de 6 días de cocultivo, el tiempo necesario para la formación adecuada de monocapa HBMEC17,18. Los valores TEER alcanzados en este modelo triple son comparables a los del otro modelo triple descrito anteriormente, en el que HA estuvo en contacto con HBMEC y HBVP se sembró en el fondo de los pozos de placa19. En el otro modelo de triple cultivo de células primarias humanas con la misma configuración celular y tiempo de exposición a OGD, los valores basales de TEER fueron sustancialmente más bajos que los de este trabajo y no alcanzaron los niveles estándar (100 Ω·cm2)20. El uso de placas de inserción de pocillos de 6 pocillos con compartimentos más grandes nos permitió disminuir la frecuencia de cambio del medio para evitar la interrupción del intercambio de sustancias entre las poblaciones celulares.
Los experimentos de OGD se realizaron utilizando una cámara de incubadora de hipoxia sellada que contenía una mezcla de gases anaeróbicos (95% de nitrógeno y 5% de dióxido de carbono). Una de las principales ventajas de este protocolo es que la gravedad de la lesión isquémica se puede ajustar fácilmente a las necesidades específicas variando la duración del período de OGD. Después de evaluar el TEER y la permeabilidad del dextrano, 4 h de OGD no comprometieron la integridad de BBB en el modelo triple construido. Por lo tanto, para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico in vitro, se debe aplicar una exposición más prolongada a la OGD para inducir la ruptura de la BBB. Las imágenes de células vivas, proporcionadas en el protocolo, permiten el monitoreo en tiempo real de diferentes tipos de células y la verificación de la lesión por OGD, lo que representa una ventaja en muchos estudios.
En este protocolo, se eligieron insertos de pozo de poliéster de 0,4 μm como base para este modelo triple BBB. Una membrana de poliéster se considera el mejor tipo de inserto para la visualización celular en aplicaciones de imágenes de fluorescencia, lo que brinda una excelente oportunidad para visualizar modificaciones de proteínas y transportadores de unión estrecha si es necesario. Si bien el diámetro de poro pequeño seleccionado crea una baja permeabilidad a pequeñas moléculas hidrófilas a través de monocapas endoteliales, también limita la aplicación potencial del actual modelo triple BBB para ensayos de migración transendotelial, en los que se requieren tamaños de poro de 3 μm u 8 μm.
Finalmente, otra limitación de este modelo puede estar relacionada con la falta de esfuerzo cortante, que se ha demostrado que promueve la formación de uniones estrechas en sistemas dinámicos triple BBB in vitro 21. En conclusión, el modelo de BBB de triple cultivo robusto y fisiológicamente relevante establecido, compuesto por células humanas primarias, representa una herramienta valiosa para el cribado de fármacos y el estudio de la disfunción de la BHE asociada con el accidente cerebrovascular isquémico.
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Disclosures
Todos los autores revelaron que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 y DA047157.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
- Yousufuddin, M., Young, N.
- Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
- Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
- Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
- Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
- Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
- Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
- He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y.
- Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
- Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
- Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
- Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
- Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
- Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
- Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
- Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).
