Pulldown-Assay gekoppelt mit Co-Expression in Bakterienzellen als zeiteffizientes Werkzeug zum Testen anspruchsvoller Protein-Protein-Interaktionen

Konventioneller Pulldown wird häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen¹. Gereinigte Proteine interagieren jedoch oft nicht effektiv in vitro^2,3, und einige von ihnen sind ohne ihren Bindungspartner ^4,5 unlöslich. Solche Proteine könnten eine co-translationale Assemblierung oder das Vorhandensein von molekularen Chaperonen 5,6,7,8,9 erfordern. Eine weitere Einschränkung des konventionellen Pulldowns ist die Prüfung möglicher Heteromultimerisierungsaktivität zwischen Domänen, die als stabile Homo-Oligomere existieren können, die kotranslational zusammengesetzt sind ^8,10, da viele von ihnen während der Inkubationszeit in vitro nicht dissoziieren und reassoziieren können. Die Koexpression erwies sich als nützlich bei der Überwindung solcher Probleme ^3,11. Die Koexpression unter Verwendung kompatibler Vektoren in Bakterien wurde erfolgreich zur Aufreinigung großer makromolekularer Komplexe mit mehreren Untereinheiten eingesetzt, einschließlich des Polycomb-Repressionskomplexes PRC2 12, des RNA-Polymerase-II-Mediatorkopfmoduls¹³, der Bakteriophagen-T4-Grundplatte¹⁴, des SAGA-Komplex-Deubiquitinylase-Moduls 15,16 und des Ferritins ¹⁷. Replikationsursprünge, die üblicherweise für die Koexpression verwendet werden, sind ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ und RSF²⁰. Im kommerziell erhältlichen Duet-Expressionssystem werden diese Ursprünge mit verschiedenen Antibiotikaresistenzgenen und geeigneten multiplen Klonierungsstellen kombiniert, um polycistronische Vektoren zu erzeugen, die die Expression von bis zu acht Proteinen ermöglichen. Diese Ursprünge haben unterschiedliche Kopienzahlen und können in unterschiedlichen Kombinationen verwendet werden, um ausgewogene Expressionsniveaus von Zielproteinen^{zu erreichen 21}. Um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu testen, werden verschiedene Affinitäts-Tags verwendet; die gebräuchlichsten sind 6xHistidin, Glutathion-S-Transferase (GST) und Maltose-bindendes Protein (MBP), von denen jedes eine spezifische Affinität zum entsprechenden Harz aufweist. GST und MBP verbessern auch die Löslichkeit und Stabilität von markierten Proteinen²².

Es wurde auch eine Reihe von Methoden entwickelt, die die Koexpression von Proteinen in eukaryotischen Zellen beinhalten, von denen die bekannteste der Hefe-Zwei-Hybrid-Assay (Y2H) ^ist23. Der Y2H-Assay ist kostengünstig, einfach und ermöglicht das Testen mehrerer Interaktionen. Der Workflow dauert jedoch mehr als 1 Woche. Es gibt auch einige weniger häufig verwendete Säugetierzell-basierte Assays, z. B. den Fluoreszenz-Zwei-Hybrid-Assay (F2H)²⁴ und den Zellarray-Protein-Protein-Interaktions-Assay (CAPPIA)²⁵. Der F2H-Assay ist relativ schnell und ermöglicht die Beobachtung von Proteininteraktionen in ihrer nativen zellulären Umgebung, erfordert jedoch die Verwendung teurer Bildgebungsgeräte. Alle diese Methoden haben einen Vorteil gegenüber der prokaryotischen Expression, die die native eukaryotische Translations- und Faltungsumgebung bereitstellt. Sie erkennen jedoch indirekt eine Interaktion, entweder durch transkriptionelle Aktivierung oder durch Fluoreszenzenergietransfer, wodurch häufig Artefakte entstehen. Eukaryotische Zellen können auch andere Interaktionspartner von Proteinen von Interesse enthalten, die das Testen binärer Wechselwirkungen zwischen Proteinen höherer Eukaryoten stören können.

Die vorliegende Arbeit beschreibt eine Methode zur bakteriellen Koexpression von differentiell markierten Proteinen, gefolgt von konventionellen Pulldown-Techniken. Die Methode ermöglicht es, Wechselwirkungen zwischen Zielproteinen zu untersuchen, die eine Koexpression erfordern. Es ist im Vergleich zu herkömmlichem Pulldown zeiteffizienter und ermöglicht das Testen mehrerer Ziele, was es in den meisten Fällen vorteilhaft macht. Die Koexpression mit kompatiblen Vektoren ist bequemer als die polycistronische Co-Expression, da sie keinen mühsamen Klonschritt erfordert.

Die schematische Darstellung des Methodenworkflows ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Co-Transformation von E. coli

1. Bereiten Sie Expressionsvektoren für Zielproteine mit Standard-Klonierungsmethoden vor.
   HINWEIS: In der Regel ist es ein guter Ausgangspunkt, konventionelle pGEX/pMAL-Vektoren zu verwenden, die ein Ampicillin-Resistenzgen und ColE1-Ursprung für die Expression von GST/MBP-markierten Proteinen und einen kompatiblen Vektor mit p15A- oder RSF-Ursprung und Kanamycin-Resistenz tragen, um 6xHis-markierte Proteine zu exprimieren, in einigen Fällen kombiniert mit Thioredoxin oder SUMO-Tag, um die Löslichkeit zu erhöhen. In der Regel müssen vor dem Experiment mehrere Kombinationen von Tags getestet werden. Das beschriebene Verfahren selbst eignet sich für die Batch-Prüfung der Expressionsbedingungen von Zielproteinen. Es ist wichtig zu beachten, dass die meisten Rosetta-Stämme bereits das Plasmid mit p15A-Ursprung für die Expression der tRNAs für seltenes Codon enthalten, daher sollten die p15A-Plasmide vermieden werden, wenn die Verwendung solcher Stämme eine mögliche Option ist. Weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle .
   1. Züchtung von Bakterien eines geeigneten Stammes in Luria-Bertani (LB)-Medien bei 37 °C bis zu einer optischen Dichte (OD) von 0,1-0,2. Der Stamm BL21(DE3) wurde in dieser Studie beispielhaft verwendet.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, frisch präparierte kompetente Zellen zu verwenden, um eine effiziente Co-Transformation mit zwei Vektoren zu erreichen. Wenn mehr als zwei Vektoren gemeinsam transformiert werden müssen, ist es besser, sie nacheinander zu transformieren, um eine gute Transformationseffizienz zu erreichen. Die Elektroporation ist eine gute Alternative.
   2. 1,0 ml der Bakteriensuspension werden 1 min lang bei 9.000 x g bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen.
   3. Fügen Sie 0,5 ml eiskalten Puffertransformationspuffer (TB) hinzu (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 und 15 mM CaCl₂) und inkubieren Sie 10 Minuten lang auf Eis.
   4. 30 s bei 8.000 x g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
   5. Fügen Sie 100 μl TB-Puffer hinzu, fügen Sie 100 ng von jedem Vektor hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis. Separate Transformation einzelner Vektoren, um das Proteinverhalten ohne Co-Expression zu untersuchen. Darüber hinaus können Co-Expressionsvektoren paarweise mit leeren Co-Expressionsvektoren für unspezifische Bindungssteuerelemente co-transformiert werden.
      HINWEIS: In den in dieser Studie vorgestellten Beispielen wurden pGEX/pMAL-Vektoren mit entsprechenden cDNAs, die mit GST/MBP-cDNAs fusioniert waren, in Kombination mit kompatiblen pACYC-abgeleiteten Vektoren verwendet, die cDNA-kodierende Partnerproteindomänen trugen, die mit Thioredoxin-cDNA fusioniert waren.
   6. 150 s auf 42 °C erhitzen, dann 1 min auf Eis kalt stellen.
   7. 1 ml flüssiges LB-Medium ohne Antibiotika zugeben und bei 37 °C 90 min inkubieren. Platte auf LB-Agar-Platten, die 0,5% Glucose und entsprechende Antibiotika enthalten (übliche Konzentrationen sind: 50 mg/L Ampicillin; 20 mg/L Kanamycin; 50 mg/L Streptomycin; 35 mg/L Chloramphenicol). Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C.

2. Ausdruck

1. Spülen Sie die Zellen von der Platte mit 2 ml flüssigem LB-Medium in 50 ml LB-Medien mit entsprechenden Antibiotika (übliche Konzentrationen sind: 50 mg/l Ampicillin; 20 mg/l Kanamycin; 50 mg/l Streptomycin; 35 mg/l Chloramphenicol). Fügen Sie Metallionen oder andere bekannte Co-Faktoren hinzu (in den Beispielen in dieser Studie wurden 0,2 mM ZnCl₂ zu den Medien gegeben). Lagern Sie ein Aliquot mit 20% Glycerin bei -70 °C für eine anschließende Wiederholung des Experiments.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, mehrere Kolonien direkt von der Platte zu spülen, um die Möglichkeit einer schlechten Expression in einem einzelnen isolierten Klon aufgrund gelegentlicher Rekombinationsereignisse zwischen zwei Plasmiden auszuschließen.
2. Züchten Sie die Zellen mit einer konstanten Rotation von 220 U/min bei 37 °C bis zu einem Außendurchmesser von 0,5-0,7, kühlen Sie sie auf Raumtemperatur (RT) ab und fügen Sie Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu 1 mM hinzu. Bewahren Sie ein 20-μl-Aliquot der Zellsuspension als Kontrolle der nicht induzierten Probe auf.
3. Inkubieren Sie die Zellen mit einer konstanten Rotation von 220 U/min bei 18 °C über Nacht.
   HINWEIS: Die optimale Inkubationszeit und -temperatur kann variieren. 18 °C über Nacht funktionieren am besten für die meisten Proteine und es wird empfohlen, es standardmäßig zu versuchen. Reduzieren Sie die Inkubationszeit auf 2-3 Stunden, wenn eine starke unspezifische Bindung beobachtet wird.
4. Teilen Sie die Bakteriensuspension in zwei Teile (oder mehr, wenn mehr als zwei verschiedene Tags verwendet wurden) und lagern Sie ein 20-μl-Aliquot der Zellsuspension, um die Proteinexpression zu bestätigen. Bei 4.000 x g 15 min zentrifugieren.
   HINWEIS: Pausenpunkt: Bakterienpellets können mindestens 6 Monate bei -70 °C gelagert werden.

3. Pulldown-Assay

HINWEIS: Die detaillierten Verfahren werden für Proteine beschrieben, die entweder mit 6xHis oder MBP/GST markiert sind. Alle Eingriffe werden bei 4°C durchgeführt.

1. Resuspendieren Sie die bakteriellen Pellets in 1 ml eiskaltem Lysepuffer mit Proteasehemmern und Reduktionsmitteln (siehe unten), die unmittelbar vor dem Experiment hinzugefügt wurden. Vermeiden Sie Dithiotreitol (DTT), wenn Sie metallchelatbildende Harze verwenden, da es Metallionen entfernt. Passen Sie die Pufferzusammensetzung für die getesteten Proteine an. Die gebräuchlichen Rezepturen von Lysepuffern, die für die meisten Proteine geeignet sind, sind:
   1. 6xHis-Pulldown: Mischen Sie 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 0,1% NP40, 10% [w/w] Glycerin, 5 mM Beta-Mercaptoethanol, 1 mM Phenylmethylsfulfonylfluorid (PMSF) und eine 1:1.000-Verdünnung des Proteasehemmer-Cocktails (siehe Materialtabelle).
   2. GST- oder MBP-Pulldown: Mischen Sie 20 mM Tris (pH 7,5 bei 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl₂, 0,1 % NP40, 10 % [w/w] Glycerin, 5 mM DTT, 1 mM PMSF und eine 1:1.000-Verdünnung des Proteasehemmer-Cocktails (siehe Materialtabelle).
2. Stören Sie die Zellen durch Beschallung auf Eis. Lagern Sie ein 20 μl Aliquot für die Elektrophorese.
   HINWEIS: In der Regel sind pro Probe 20-25 Impulse von 5 s mit 15-s-Intervallen mit 20 W Ausgangsleistung erforderlich. Die entsprechende Beschallungsleistung sollte für jedes Instrument eingestellt werden, um eine Überhitzung zu vermeiden und eine vollständige Zellstörung zu gewährleisten. Um eine bessere Leistung zu erzielen, wird dringend empfohlen, Multi-Tip-Ultraschallsonden mit hohem Durchsatz zu verwenden.
3. Zentrifugieren bei 20.000 x g für 30 min. Sammeln Sie 20 μl des geklärten Lysats für die anschließende SDS-PAGE-Analyse.
4. Das Harz (50 μl für jede Probe) wird 10 min lang mit 1 ml eiskaltem Lysepuffer äquilibriert, 30 s lang bei 2.000 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen.
5. Zelllysate (Gesamtproteinkonzentration: 20-50 mg/ml) in das Harz geben, 10 min bei konstanter Rotation von 15 U/min inkubieren, bei 2.000 x g 30 s zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Sammeln Sie 20 μl der ungebundenen Fraktion für die anschließende SDS-PAGE-Analyse.
6. Fügen Sie 1 ml eiskalten Waschpuffer hinzu und inkubieren Sie 1 Minute lang. Bei 2.000 x g 30 s zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Die gebräuchlichen Rezepte für Waschpuffer sind:
   1. 6xHis-Pulldown: Mischen Sie 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazol, 0,1% NP40, 10% [w/w] Glycerin und 5 mM Beta-Mercaptoethanol.
   2. GST- oder MBP-Pulldown: Mischen Sie 20 mM Tris (pH 7,5 bei 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl₂, 0,1% NP40, 10% [w/w] Glycerin und 5 mM DTT.
7. Führen Sie zwei lange Wäschen durch: Fügen Sie 1 ml eiskalten Waschpuffer hinzu, inkubieren Sie 10-30 Minuten lang mit einer konstanten Drehung von 15 U / min, zentrifugieren Sie es bei 2.000 x g für 30 s und entsorgen Sie den Überstand.
8. 1 ml eiskalten Waschpuffer zugeben, 1 Minute inkubieren, 30 s bei 2.000 x g zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
9. Die gebundenen Proteine werden mit 50 μl des Elutionspuffers in einem Shaker bei 1.200 U/min für 10 min eluiert. Die gebräuchlichen Rezepte von Elutionspuffern sind:
   1. 6xHis-Pulldown: Mischen Sie 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazol und 5 mM Beta-Mercaptoethanol.
   2. GST-Pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 bei 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutathion (eingestellt auf pH 7,5 mit basischem Tris) und 5 mM DTT.
   3. MBP-Pulldown: Mischen Sie 20 mM Tris (pH 7,5 bei 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM Maltose und 5 mM DTT.
10. Analysieren Sie die eluierten Proteine mit SDS-PAGE.
    HINWEIS: Der prozentuale Anteil an Acrylamid sollte an die Größe der Proteine angepasst werden. In den in dieser Studie bereitgestellten Beispielen wurden 12% Acrylamidgele verwendet, die in Tris-Glycin-SDS-Puffer (2 mM Tris, 250 mM Glycin, 0,1% SDS) bei konstanter Spannung von 180 V liefen. Gele wurden durch Kochen in 0,2% Coomassieblau R250, 10% Essigsäure und 30% Isopropanol gefärbt und durch Kochen in 10% Essigsäure entfärbt. Die Menge an beladenem Protein sollte nicht gleich sein, da verschiedene Mengen an interagierenden Proteinen in verschiedenen Experimenten heruntergezogen werden können.

Die beschriebene Methode wurde routinemäßig mit vielen verschiedenen Zielen angewendet. Hier werden einige repräsentative Ergebnisse vorgestellt, die mit herkömmlichen Pulldown-Techniken wahrscheinlich nicht erzielt werden können. Die erste ist die Untersuchung der spezifischen ZAD-Dimerisierung (Zinc-finger-associated domain)11. ZADs bilden stabile und spezifische Dimere, wobei Heterodimere nur zwischen eng verwandten Domänen innerhalb paraloger Gruppen möglich sind. Die von diesen Domänen gebildeten Dimere sind stabil und dissoziieren mindestens einige Tage lang nicht. Somit erzeugt das Mischen von gereinigten ZADs keine nachweisbare Bindung. Gleichzeitig zeigt die Koexpression von MBP- und Thioredoxin-6xHis-fusionierten ZADs eine gute und reproduzierbare Homodimerisierungsaktivität (Abbildung 2A), die als zusätzliche Bande in den SDS-PAGE-Ergebnissen des MBP-Pulldown-Assays erscheint. Ein kleiner Teil der Heterodimere kann mit M1BP koexprimiert mit einer anderen Domäne beobachtet werden; Diese Wechselwirkung wurde mit Y2A nicht bestätigt und ist höchstwahrscheinlich das Ergebnis einer unspezifischen Assoziation aufgrund der hohen Proteinkonzentration, da diese Domänen Cysteinreich und extrem aggregationsanfällig sind. Bemerkenswert ist, dass in diesem Fall ein 6xHis-Pulldown ungeeignet ist, da ZADs metallkoordinierende Domänen sind, die unspezifisch an das metallchelatbildende Harz binden. Eine solche Aktivität sollte in einem parallelen Experiment sorgfältig untersucht werden.

Ein weiteres Beispiel ist der Konkurrenztest zwischen dem ENY2-Protein und seinen Bindungspartnern Sgf11 (1-83aa) und der Zinkfingerdomäne (460-631 aa) des CTCF-Proteins26. Wenn es allein exprimiert wird, bildet das ENY2-Protein Dimere, die es daran hindern, mit seinen nativen Bindungspartnern zu interagieren. Vermutlich binden sowohl das Sgf11- als auch das CTCF-Protein an dieselbe molekulare Oberfläche von ENY2, wodurch sich ihre Wechselwirkung gegenseitig ausschließt. Im Co-Expressions-Assay interagierte 6xHis-markiertes ENY2 sowohl mit GST-markiertem Sgf11 als auch mit MBP-CTCF, aber bei MBP-Pulldowns war kein GST-Sgf11 vorhanden und umgekehrt (Abbildung 2B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass kein dreifacher Komplex gebildet werden kann und sich Wechselwirkungen gegenseitig ausschließen. Diese Daten wurden unabhängig voneinander mit anderen Assays bestätigt und unterstützen die unterschiedlichen funktionellen Rollen von ENY2 in diesen Komplexen. Es sollte darauf hingewiesen werden, dass große Affinitäts-Tags selbst sterische Hindernisse darstellen können, wodurch die Bildung komplexer Faktoren verhindert wird. Daher sollte die Schlussfolgerung nicht ausschließlich auf Daten zur Koexpression beruhen.

Ein Schritt-für-Schritt-Vergleich der Arbeitsabläufe von konventionellen und gekoppelten Co-Expression-Pulldowns ist in Abbildung 3A dargestellt. Der Co-Expression-gekoppelte Pulldown ist selbst bei einer kleinen Anzahl von Stichproben mindestens doppelt so zeiteffizient und ermöglicht eine gute Skalierbarkeit. Die Ergebnisse der Verwendung beider Techniken zur Untersuchung der gleichen Wechselwirkung zwischen der BTB-Domäne des CP190-Proteins (1-126aa) und der GST-markierten C-terminalen Domäne (610-818aa) des Drosophila-CTCF-Proteins (dCTCF) sind in Abbildung 3B dargestellt. Beide Methoden zeigen eine gute Effizienz und Reproduzierbarkeit (Assays wurden in drei Wiederholungen durchgeführt); Für diesen Fall zeigte der Co-Expressions-gekoppelte Pulldown eine geringere unspezifische Bindung, wie in den Kontrollproben mit GST-Protein allein zu sehen ist.

Abbildung 1: Die schematische Darstellung des Protokolls. Das Schema zeigt den in dieser Studie verwendeten Methodenablauf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse . (A) Untersuchung der Zinkfinger-assoziierten Domäne (ZAD) Homodimerisierung in MBP- und 6xHis-Pulldown-Assays. ZADs, die entweder mit MBP (40 kDa) oder mit 6xHis-Thioredoxin (20 kDa) fusioniert wurden, wurden in Bakterienzellen koexprimiert und die Affinität mit Amyloseharz (bindet MBP-markierte Proteine) oder mit Ni-NTA-Harz (bindet 6xHis-markierte Proteine) gereinigt. Co-gereinigte Proteine wurden mit SDS-PAGE visualisiert, gefolgt von einer Coomassie-Färbung. Die MBP-Pulldown-Ergebnisse sind in den oberen Panels dargestellt, die 6xHis-Pulldown-Ergebnisse in den unteren Panels (nur als Proteinexpressionskontrolle verwendet, da viele ZADs unspezifisch an Ni-NTA binden). (B) Untersuchung der sich gegenseitig ausschließenden Wechselwirkungen zwischen ENY2- und Sgf11/CTCF-Proteinen. GST-markierte Sgf11 (1-81aa), MBP-markierte CTCF-Zinkfingerdomäne (460-631aa) und 6xHis-markierte ENY2-Proteine wurden in verschiedenen Kombinationen koexprimiert und mit Amyloseharz, Glutathionharz (bindet GST-markierte Proteine) oder mit Ni-NTA-Harz gereinigt. Co-gereinigte Proteine wurden mit SDS-PAGE visualisiert, gefolgt von einer Coomassie-Färbung. Die Abbildung in den Tafeln A und B wurde mit Genehmigung von Bonchuk et al.11 und Bonchuk et al.26 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Vergleich der Arbeitsabläufe von konventionellen und gekoppelten Co-Expressions-Pulldown-Assays. (A) Schritt-für-Schritt-Vergleich der erforderlichen Zeitintervalle im Arbeitsablauf des konventionellen Pulldown-Assays im Vergleich zum Pulldown gekoppelt mit Co-Expression. (B) Vergleich zweier verschiedener Pulldown-Techniken bei der Untersuchung der Interaktion zwischen der dCTCF-C-terminalen Domäne (610-818aa) und der BTB-Domäne des CP190-Proteins (1-126aa) in GST-Pulldown-Assays. dCTCF (610-818aa), fusioniert mit GST (25 kDa) oder GST allein, wurden entweder in Bakterienzellen koexprimiert oder in vitro mit Thioredoxin-6xHis-markiertem CP190 BTB inkubiert und mit Glutathionharz affinitätsgereinigt. Es werden drei unabhängige Replikate jedes Assays gezeigt. Co-gereinigte Proteine wurden mit SDS-PAGE visualisiert, gefolgt von einer Coomassie-Färbung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.