Pulldown-Assay gekoppelt mit Co-Expression in Bakterienzellen als zeiteffizientes Werkzeug zum Testen anspruchsvoller Protein-Protein-Interaktionen

Summary

Hier beschreiben wir eine Methode zur bakteriellen Koexpression von differentiell markierten Proteinen unter Verwendung einer Reihe kompatibler Vektoren, gefolgt von den konventionellen Pulldown-Techniken zur Untersuchung von Proteinkomplexen, die sich in vitro nicht zusammensetzen können.

Abstract

Pulldown ist ein einfacher und weit verbreiteter Protein-Protein-Interaktions-Assay. Es hat jedoch Einschränkungen bei der Untersuchung von Proteinkomplexen, die sich in vitro nicht effektiv zusammensetzen. Solche Komplexe können eine kotranslationale Assemblierung und das Vorhandensein von molekularen Chaperonen erfordern; Entweder bilden sie stabile Oligomere, die in vitro nicht dissoziieren und reassoziieren können, oder sie sind ohne Bindungspartner instabil. Um diese Probleme zu überwinden, ist es möglich, eine Methode zu verwenden, die auf der bakteriellen Koexpression von differentiell markierten Proteinen unter Verwendung einer Reihe kompatibler Vektoren basiert, gefolgt von den herkömmlichen Pulldown-Techniken. Der Workflow ist im Vergleich zum herkömmlichen Pulldown zeiteffizienter, da ihm die zeitaufwändigen Schritte der getrennten Aufreinigung interagierender Proteine und ihrer anschließenden Inkubation fehlen. Ein weiterer Vorteil ist eine höhere Reproduzierbarkeit aufgrund einer deutlich geringeren Anzahl von Schritten und einer kürzeren Zeitspanne, in der Proteine, die in der In-vitro-Umgebung existieren, einer Proteolyse und Oxidation ausgesetzt sind. Die Methode wurde erfolgreich zur Untersuchung einer Reihe von Protein-Protein-Wechselwirkungen angewendet, wenn sich andere In-vitro-Techniken als ungeeignet erwiesen haben. Die Methode kann für die Chargenprüfung von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden. Repräsentative Ergebnisse werden für Studien zu Wechselwirkungen zwischen BTB-Domäne und intrinsisch ungeordneten Proteinen sowie zu Heterodimeren von Zinkfinger-assoziierten Domänen gezeigt.

Introduction

Konventioneller Pulldown wird häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen¹. Gereinigte Proteine interagieren jedoch oft nicht effektiv in vitro^2,3, und einige von ihnen sind ohne ihren Bindungspartner ^4,5 unlöslich. Solche Proteine könnten eine co-translationale Assemblierung oder das Vorhandensein von molekularen Chaperonen 5,6,7,8,9 erfordern.

Protocol

Die schematische Darstellung des Methodenworkflows ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Co-Transformation von E. coli

1. Bereiten Sie Expressionsvektoren für Zielproteine mit Standard-Klonierungsmethoden vor.
   HINWEIS: In der Regel ist es ein guter Ausgangspunkt, konventionelle pGEX/pMAL-Vektoren zu verwenden, die ein Ampicillin-Resistenzgen und ColE1-Ursprung für die Expression von GST/MBP-markierten Proteinen und einen kompatiblen Vektor mit p15A- oder RSF-Ursprung und Kanamycin-Resistenz tragen, um 6xHis-markierte Proteine zu exprimieren, in einigen Fällen kombiniert mit Thio....

Results

Die beschriebene Methode wurde routinemäßig mit vielen verschiedenen Zielen angewendet. Hier werden einige repräsentative Ergebnisse vorgestellt, die mit herkömmlichen Pulldown-Techniken wahrscheinlich nicht erzielt werden können. Die erste ist die Untersuchung der spezifischen ZAD-Dimerisierung (Zinc-finger-associated domain)¹¹. ZADs bilden stabile und spezifische Dimere, wobei Heterodimere nur zwischen eng verwandten Domänen innerhalb paraloger Gruppen möglich sind. Die von diesen Domänen gebild.......

Discussion

Die beschriebene Methode ermöglicht die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die in vitro nicht effizient zusammengesetzt werden können und eine Koexpression erfordern. Die Methode ist einer der wenigen geeigneten Ansätze zur Untersuchung heterodimerisierender Proteine, die ebenfalls zur Homodimerisierung fähig sind, da solche Proteine, wenn sie getrennt gereinigt werden, stabile Homodimere bilden, die während des Experiments meistens nicht dissoziieren und reassoziieren^können

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-ELEMENT-Sonde	Sonics	630-0586	Die 8-Element-Sonden mit hohem Durchsatz
Agar	AppliChem	A0949
Amylose-Harz	England Biolabs	E8021	Harz für die Aufreinigung von MBP-markierten
Proteinen Antibiotika	AppliChem	A4789 (Kanamycin); A0839 (Ampicillin)
Beta-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108
BL21(DE3)	Novagen	69450-M
CaCl2	AppliChem	A4689
Zentrifuge	Eppendorf	5415R (Z605212)
Glutathion	AppliChem	A9782
Glutathion Agarose	Pierce	16100	Harz zur Aufreinigung von GST-markierten Proteinen
Glycerol	AppliChem	A2926
HEPES	AppliChem	A3724
HisPur Ni-NTA Superflow Agarose	Thermo Scientific	25214	Harz für die Aufreinigung von 6xHis-markierten Proteinen
Imidazol	AppliChem	A1378
IPTG	AppliChem	A4773
KCl	AppliChem	A2939
LB	AppliChem	414753
Maltose	AppliChem	A3891
MOPS	AppliChem	A2947
NaCl	AppliChem	A2942
NP40	Roche	11754599001
pACYCDuet-1	Sigma-Aldrich	71147	Vektor für die Co-Expression von Proteinen mit p15A-Replikationsursprung
pCDFDuet-1	Sigma-Aldrich	71340	Vektor für die Co-Expression von Proteinen mit CloDF13-Replikationsursprung
PMSF	AppliChem	A0999
Proteaseinhibitor Cocktail VII	Calbiochem	539138	Proteaseinhibitor Cocktail
pRSFDuet-1	Sigma-Aldrich	71341	Vektor für die Co-Expression von Proteinen mit RSF-Replikationsursprung
SDS	AppliChem	A2263
Tris	AppliChem	A2264
VC505 Ultraschallgerät	Sonics	CV334	Ultraschall-Flüssigkeitsprozessor
ZnCl2	AppliChem	A6285