Automatisierung des Mikronukleus-Assays mittels bildgebender Durchflusszytometrie und künstlicher Intelligenz

Summary

Der Mikronukleus-Assay (MN) ist ein etablierter Test zur Quantifizierung von DNA-Schäden. Die Bewertung des Assays mit herkömmlichen Techniken wie manueller Mikroskopie oder merkmalsbasierter Bildanalyse ist jedoch mühsam und herausfordernd. In diesem Artikel wird die Methodik zur Entwicklung eines Modells der künstlichen Intelligenz beschrieben, um den MN-Assay anhand von bildgebenden Durchflusszytometriedaten zu bewerten.

Abstract

Der Mikronukleus-Assay (MN) wird weltweit von Aufsichtsbehörden verwendet, um Chemikalien auf genetische Toxizität zu bewerten. Der Assay kann auf zwei Arten durchgeführt werden: durch Bewertung von MN in einmal geteilten, durch Zytokinese blockierten zweikernigen Zellen oder vollständig geteilten einkernigen Zellen. In der Vergangenheit war die Lichtmikroskopie die Goldstandardmethode, um den Assay zu bewerten, aber sie ist mühsam und subjektiv. Die Durchflusszytometrie wurde in den letzten Jahren zur Bewertung des Assays eingesetzt, ist jedoch durch die Unfähigkeit, wichtige Aspekte der zellulären Bildgebung visuell zu bestätigen, eingeschränkt. Die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) kombiniert Hochdurchsatz-Bilderfassung und automatisierte Bildanalyse und wurde erfolgreich eingesetzt, um schnell Bilder von allen Schlüsselereignissen im MN-Assay zu erfassen und zu bewerten. Kürzlich wurde gezeigt, dass Methoden der künstlichen Intelligenz (KI), die auf Convolutional Neural Networks basieren, zur Bewertung von MN-Assay-Daten verwendet werden können, die von IFC erfasst wurden. In diesem Whitepaper werden alle Schritte beschrieben, um mithilfe von KI-Software ein Deep-Learning-Modell zu erstellen, um alle wichtigen Ereignisse zu bewerten, und um dieses Modell anzuwenden, um zusätzliche Daten automatisch zu bewerten. Die Ergebnisse des KI-Deep-Learning-Modells lassen sich gut mit der manuellen Mikroskopie vergleichen und ermöglichen so eine vollautomatische Bewertung des MN-Assays durch die Kombination von IFC und KI.

Introduction

Der Mikronukleus-Assay (MN) ist in der genetischen Toxikologie von grundlegender Bedeutung, um DNA-Schäden bei der Entwicklung von Kosmetika, Pharmazeutika und Chemikalien für den menschlichen Gebrauch zu bewerten 1,2,3,4. Mikrokerne werden aus ganzen Chromosomen oder Chromosomenfragmenten gebildet, die sich nach der Teilung nicht in den Zellkern eingliedern und zu kleinen, kreisförmigen Körpern verdichten, die vom Zellkern getrennt sind. Somit kann MN als Endpunkt zur Quantifizierung von DNA-Schäden in Genotoxizitätstests^{verwendet werden 1}.

Die bevorzugte Methode zur Quantifizierung von MN ist in einmal geteilten zweikernigen Zellen (BNCs) durch Blockierung der Teilung mit Cytochalasin-B (Cyt-B). In dieser Version des Assays wird die Zytotoxizität auch durch das Scoring von einkernigen (MONO) und mehrkernigen (POLY) Zellen beurteilt. Der Assay kann auch durch Scoring von MN in nicht blockierten MONO-Zellen durchgeführt werden, was schneller und einfacher zu bewerten ist, wobei die Zytotoxizität anhand der Zellzählung vor und nach der Exposition bewertet wird, um die Proliferation zu beurteilen ^5,6.

Die physikalische Bewertung des Assays wurde in der Vergangenheit durch manuelle Mikroskopie durchgeführt, da dies eine visuelle Bestätigung aller Schlüsselereignisse ermöglicht. Die manuelle Mikroskopie ist jedoch anspruchsvoll und subjektiv¹. Daher wurden automatisierte Techniken entwickelt, darunter das Scannen von Objektträgern und die Durchflusszytometrie, die jeweils ihre eigenen Vor- und Nachteile haben. Während Objektträger-Scanning-Methoden die Visualisierung von Schlüsselereignissen ermöglichen, müssen Objektträger mit optimaler Zelldichte erstellt werden, was schwierig zu erreichen sein kann. Darüber hinaus fehlt dieser Technik oft die zytoplasmatische Visualisierung, was das Scoring von MONO- und POLY-Zellen beeinträchtigen kann ^7,8. Während die Durchflusszytometrie eine Hochdurchsatz-Datenerfassung ermöglicht, müssen die Zellen lysiert werden, so dass die Verwendung der Cyt-B-Form des Assays nicht möglich ist. Darüber hinaus bietet die konventionelle Durchflusszytometrie als nicht-bildgebendes Verfahren keine visuelle Validierung von Schlüsselereignissen ^9,10.

Daher wurde die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) untersucht, um den MN-Assay durchzuführen. Der ImageStream^X Mk II kombiniert die Geschwindigkeit und statistische Robustheit der konventionellen Durchflusszytometrie mit den hochauflösenden Bildgebungsmöglichkeiten der Mikroskopie in einem einzigen System¹¹. Es hat sich gezeigt, dass durch den Einsatz von IFC hochauflösende Bilder aller Schlüsselereignisse erfasst und automatisch mit Hilfe von merkmalsbasierten^12,13 oder Techniken der künstlichen Intelligenz (KI)^14,15 bewertet werden können. Durch die Verwendung von IFC zur Durchführung des MN-Assays ist die automatische Bewertung von viel mehr Zellen im Vergleich zur Mikroskopie in kürzerer Zeit möglich.

Diese Arbeit weicht von einem zuvor beschriebenen Bildanalyse-Workflow¹⁶ ab und diskutiert alle Schritte, die erforderlich sind, um ein Random Forest (RF)- und/oder Convolutional Neural Network (CNN)-Modell unter Verwendung der Amnis AI-Software (im Folgenden als "KI-Software" bezeichnet) zu entwickeln und zu trainieren. Es werden alle notwendigen Schritte beschrieben, einschließlich der Befüllung von Ground-Truth-Daten mit KI-gestützten Tagging-Tools, der Interpretation der Ergebnisse des Modelltrainings und der Anwendung des Modells zur Klassifizierung zusätzlicher Daten, die die Berechnung der Genotoxizität und Zytotoxizität ermöglichen¹⁵.

Protocol

1. Datenerfassung mittels bildgebender Durchflusszytometrie

HINWEIS: Beziehen Sie sich auf Rodrigues et ^al.16 mit den folgenden Modifikationen, wobei darauf hingewiesen wird, dass die Erfassungsbereiche mit IFC möglicherweise für eine optimale Bildaufnahme geändert werden müssen:

1. Führen Sie bei der Nicht-Cyt-B-Methode eine Zellzählung mit einem handelsüblichen Zellzähler gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) für jede Kultur unmittelbar vor der Kultur und unmittelbar nach der Erholungsphase durch.
2. Wenn Sie die Proben mit einem Durchflusszytometer mit einer einzigen Kamera ausführen möchten, platzieren Sie das Hellfeld (BF) in Kanal 4. Ersetzen Sie M01 durch M04 und M07 durch M01.
   HINWEIS: "M" bezieht sich auf den Kamerakanal auf dem IFC.
3. Verwenden Sie die 40-fache Vergrößerung während der Aufnahme.
4. Verwenden Sie im Diagramm "BF-Fläche im Vergleich zum BF-Seitenverhältnis" während der Erfassung die folgenden Bereichskoordinaten:
   X-Koordinaten: 100 und 900; Y-Koordinaten: 0,7 und 1 (Cyt-B-Methode)
   X-Koordinaten: 100 und 600; Y-Koordinaten: 0,7 und 1
5. Verwenden Sie im Hoechst-Intensitätsdiagramm die folgenden Regionskoordinaten:
   X-Koordinaten: 55 und 75; Y-Koordinaten: 9,5 und 15 (Cyt-B-Methode)
   X-Koordinaten: 55 und 75; Y-Koordinaten: 13 und 21 (Nicht-Cyt-B-Methode)
6. Um Bilder von apoptotischen und nekrotischen Objekten aus den Daten zu entfernen, starten Sie das Softwarepaket IDEAS 6.3 (im Folgenden als "Bildanalysesoftware" bezeichnet; siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Die KI-Software wurde für die Arbeit mit .daf-Dateien entwickelt, die mit der neuesten Version der Bildanalysesoftware verarbeitet wurden. Stellen Sie sicher, dass die Bildanalysesoftware auf dem neuesten Stand ist.
7. Speichern Sie diese Arbeit als Vorlagendatei (.ast).

2. Erstellen von .daf-Dateien für alle .rif-Dateien

1. Die KI-Software erlaubt nur den Import von .daf-Dateien. Erstellen Sie DAF-Dateien für alle RIF-Dateien im Experiment durch Stapelverarbeitung.
2. Klicken Sie im Menü Extras auf Batch-Datendateien und dann auf Batch hinzufügen.
3. Wählen Sie im neuen Fenster Dateien hinzufügen aus, und wählen Sie die RIF-Dateien aus, die dem Stapel hinzugefügt werden sollen. Wählen Sie unter der Option Vorlage oder Datenanalysedatei (.ast, .daf) auswählen die zuvor erstellte AST-Datei aus.
4. Vergeben Sie bei Bedarf einen Batch-Namen und klicken Sie auf OK , um .daf-Dateien für alle geladenen .rif-Dateien zu erstellen.

3. Erstellen eines Experiments in der KI-Software

1. Sehen Sie sich das Flussdiagramm in Abbildung 1 an, das den Prozess der Erstellung eines Deep-Learning-Modells mit der KI-Software beschreibt.
2. Starten Sie die KI-Software und stellen Sie sicher, dass die neueste Version installiert ist, indem Sie in der unteren linken Ecke des Fensters auf Info klicken. Wenn die neueste Version nicht installiert ist, wenden Sie sich an support@luminexcorp.com, um sie zu erhalten.
3. Der Standardbildschirm in der Software ist der Bildschirm Neues Experiment . Verwenden Sie das Ordnersymbol, um auszuwählen, wo das Experiment gespeichert werden soll, und geben Sie einen Namen für das Experiment ein (z. B. "MN-Modell").
4. Klicken Sie unter Experimenttyp auf das Optionsfeld neben Trainieren , um ein Trainingsexperiment zu starten, um mit der Erstellung des CNN-Modells zu beginnen. Klicken Sie auf Weiter.
   1. Optional: Wenn ein Modell zuvor trainiert wurde, kann es als Vorlage für ein neues KI-Modell verwendet und als Vorlage für die Erstellung eines neuen Modells auf dem Bildschirm Vorlagenmodell auswählen ausgewählt werden. Wenn kein Vorlagenmodell vorhanden ist, überspringen Sie diesen Schritt einfach, indem Sie auf Weiter klicken.
5. Das nächste Bild ist das Bild Neues Modell definieren . Unter Modell wird der Name, der dem Modell in Schritt 3.3 zugewiesen wurde, automatisch ausgefüllt.
   1. Geben Sie unter Beschreibung eine Beschreibung für das Modell ein (optional), und belassen Sie die maximale Bildgröße bei 150 Pixeln.
   2. Klicken Sie unter Kanäle auf BF hinzufügen , um der Liste einen Hellfeldkanal hinzuzufügen. Doppelklicken Sie unter Name auf Brightfield und benennen Sie diesen Kanal in BF um. Klicken Sie auf FL hinzufügen , um der Liste einen fluoreszierenden Kanal hinzuzufügen. Doppelklicken Sie unter Name auf Fluoreszierend und benennen Sie diesen Kanal in DNA um.
   3. Klicken Sie unter Klassennamen auf Hinzufügen. Geben Sie im Popup-Fenster Mononucleated ein und klicken Sie auf OK. Dadurch wird die einkernige Klasse zur Liste der Klassennamen hinzugefügt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um sicherzustellen, dass die folgenden sechs Klassen in der Liste definiert sind:
      Einkernig
      Einkernig mit MN
      Zweikernig
      Zweikernig mit MN
      Polykernig
      Unregelmäßige Morphologie
      Klicken Sie auf Weiter.
      HINWEIS: Diese sechs Ground-Truth-Modellklassen stellen die wichtigsten Ereignisse dar, die bewertet werden sollen, sowie Bilder mit einer Morphologie, die von den akzeptierten Bewertungskriterien⁵ abweicht.
      1. Optional: Auf Wunsch kann die Analysevorlage aus 1.7 eingebunden werden, um Funktionen aus der Bildanalyse-Software zu nutzen. Wenn Sie diese Funktionen in das KI-Modell aufnehmen möchten, suchen Sie nach der AST-Datei, und wählen Sie dann aus den kanalspezifischen Dropdown-Menüs die Funktionsteilmengen aus, die Sie einschließen möchten.
   4. Klicken Sie unter "Dateien auswählen" auf "Dateien hinzufügen" und suchen Sie nach den gewünschten Dateien, die der KI-Software hinzugefügt werden sollen, um die Ground-Truth-Daten zu erstellen. Klicken Sie auf Weiter.
      HINWEIS: Es ist wichtig, mehrere Datendateien (z. B. Positiv- und Negativkontrolldaten) hinzuzufügen, die eine ausreichende Anzahl aller Schlüsselereignisse enthalten.
6. Suchen Sie als Nächstes auf dem Bildschirm Basispopulationen auswählen die nicht-apoptotische Population aus der Populationshierarchie. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die nicht-apoptotische Population und wählen Sie Select All Matching Populations. Klicken Sie auf Weiter.
   HINWEIS: Es ist wichtig, alle Populationen auszuschließen, die nicht klassifiziert werden sollten (z. B. Perlen, Trümmer, Dubletten usw.).
7. Dieser Bildschirm ist der Bildschirm " Wahrheitspopulationen auswählen ".
   1. Wenn in der Bildanalysesoftware keine getaggten Wahrheitspopulationen der Schlüsselereignisse erstellt wurden, klicken Sie auf Weiter.
   2. Wenn in der Bildanalysesoftware getaggte Wahrheitspopulationen erstellt wurden, weisen Sie sie der entsprechenden Modellklasse zu.
   3. Um eine getaggte Wahrheitspopulation von MONO-Zellen mit MN zuzuweisen, klicken Sie links unter Modellklassen auf die Klasse Mononukleiert mit MN. Klicken Sie dann auf die entsprechende markierte Wahrheitspopulation auf der rechten Seite, die diese Ereignisse enthält.
   4. Wenn die markierten Wahrheitspopulationen in mehr als einer Datendatei erstellt wurden, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine der Wahrheitspopulationen, und wählen Sie Alle übereinstimmenden Populationen auswählen aus, um markierte Populationen aus mehreren Dateien zur entsprechenden Klasse hinzuzufügen.
   5. Sobald alle entsprechenden Wahrheitspopulationen zugewiesen wurden, klicken Sie auf Weiter.
8. Wählen Sie auf dem Bildschirm "Kanäle auswählen" die entsprechenden Kanäle für das Experiment aus. Stellen Sie hier BF auf Kanal 1 und Hoechst auf Kanal 7. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf einen Kanal und wählen Sie Auf alle anwenden aus. Klicken Sie auf Weiter.
9. Klicken Sie abschließend auf dem Bestätigungsbildschirm auf Experiment erstellen.
10. Die KI-Software lädt Bilder aus den Datendateien und erstellt die in Schritt 3.5.3 definierten Modellklassen mit den Ground-Truth-Bildern, die in Schritt 3.7 zugewiesen wurden. Klicken Sie auf Fertig stellen.
11. Nachdem das Experiment erstellt wurde, werden fünf Optionen angezeigt:
    Experiment: Stellt Details zum Experiment bereit, einschließlich geladener Datendateien, ausgewählter Kanäle und definierter Ground-Truth-Modellklassen.
    Tagging: Startet das Tagging-Tool, mit dem Benutzer Ground-Truth-Daten ausfüllen können.
    Training: Trainiert ein Modell auf der Grundlage der Ground-Truth-Daten.
    Klassifizieren: Verwendet trainierte Modelle zum Klassifizieren von Daten.
    Ergebnisse: Stellt Ergebnisse sowohl aus einem Trainingsexperiment als auch aus einem Klassifizierungsexperiment bereit.

4. Befüllen der Ground-Truth-Daten mit KI-gestützten Tagging-Tools

1. Klicken Sie auf Tagging, um die Benutzeroberfläche des Tagging-Tools zu starten.
   1. Klicken Sie auf die Zoom-Werkzeuge (Lupensymbole), um die Bilder zur einfacheren Anzeige zuzuschneiden.
   2. Klicken Sie auf den Schieberegler, um die Bildgröße anzupassen und zu ändern, wie viele Bilder in der Galerie angezeigt werden.
   3. Klicken Sie auf die Option Anzeigeeinstellung und wählen Sie Min-Max, was das beste Kontrastbild zur Identifizierung aller Schlüsselereignisse bietet.
   4. Klicken Sie auf Galerieanzeige einrichten , um die Farbe des DNA-Bildes in Gelb oder Weiß zu ändern, wodurch die Visualisierung kleiner Objekte (z. B. MN) verbessert wird.
2. Klicken Sie auf Cluster , um den Algorithmus auszuführen und Objekte mit ähnlicher Morphologie zu gruppieren. Sobald das Clustering abgeschlossen ist, werden die einzelnen Cluster mit der Anzahl der Objekte pro Cluster in einer Liste unter Unbekannte Populationen angezeigt. Wählen Sie die einzelnen Cluster aus, um die Objekte innerhalb des Clusters anzuzeigen, und weisen Sie diese Objekte den entsprechenden Modellklassen zu.
3. Nachdem jeder Modellklasse mindestens 25 Objekte zugewiesen wurden, wird der Predict-Algorithmus verfügbar. Klicken Sie auf Vorhersage.
   HINWEIS: Objekte, die nicht gut in eine Population passen, bleiben als unbekannt klassifiziert. Je mehr Objekte zu den Wahrheitspopulationen hinzugefügt werden, desto besser ist die Vorhersagegenauigkeit.
4. Füllen Sie die Ground Truth-Modellklassen so lange mit den entsprechenden Bilddaten, bis eine ausreichende Anzahl von Objekten in jeder Klasse erreicht ist.
5. Sobald jeder Modellklasse mindestens 100 Objekte zugewiesen wurden, klicken Sie oben auf dem Bildschirm auf die Registerkarte Training . Klicken Sie auf die Schaltfläche Trainieren , um ein Modell mit den Algorithmen Random Forest und CNN zu erstellen.
   HINWEIS: Die KI-Software erstellt Modelle sowohl mit dem Random Forest- als auch mit dem CNN-Algorithmus, die Kontrollkästchen erlauben die Erstellung von Modellen nur mit Random Forest von CNN-Algorithmen.

5. Bewertung der Modellgenauigkeit

1. Sobald das Modelltraining abgeschlossen ist, klicken Sie auf Ergebnisse anzeigen.
2. Verwenden Sie den Ergebnisbildschirm, um die Modellgenauigkeit zu bewerten. Verwenden Sie das Pulldown-Menü, um zwischen Random Forest und CNN zu wechseln.
   HINWEIS: Die Wahrheitspopulationen können aktualisiert werden, und das Modell kann neu trainiert oder unverändert verwendet werden, um zusätzliche Daten zu klassifizieren.
   1. Um die Wahrheitspopulationen zu aktualisieren, klicken Sie oben auf Tagging und folgen Sie Abschnitt 4.

6. Klassifizieren von Daten mithilfe des Modells

1. Starten Sie die KI-Software. Der Standardbildschirm ist der Bildschirm Neues Experiment . Verwenden Sie das Ordnersymbol, um auszuwählen, wo das Experiment gespeichert werden soll, und geben Sie einen Namen für das Experiment ein.
2. Klicken Sie unter Experimenttyp auf das Optionsfeld neben Klassifizieren , um ein Klassifizierungsexperiment zu starten. Klicken Sie auf Weiter.
3. Klicken Sie auf das Modell, das für die Klassifizierung verwendet werden soll, und klicken Sie dann auf Weiter.
4. Klicken Sie auf dem Bildschirm "Dateien auswählen" auf "Dateien hinzufügen" und suchen Sie nach den Dateien, die vom CNN-Modell klassifiziert werden sollen. Klicken Sie auf Weiter.
5. Klicken Sie als Nächstes auf dem Bildschirm Basispopulationen auswählen auf das Kontrollkästchen neben der nicht-apoptotischen Population in einer der geladenen Dateien. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die nicht-apoptotische Population und klicken Sie auf Select All Matching Populations , um diese Population aus allen geladenen Dateien auszuwählen. Klicken Sie auf Weiter.
6. Optional: Wenn die zu klassifizierenden Daten Wahrheitspopulationen enthalten, können diese auf dem Bild Wahrheitspopulationen auswählen den entsprechenden Modellklassen zugeordnet werden. Klicken Sie andernfalls auf Weiter, um diesen Schritt zu überspringen.
7. Wählen Sie auf dem Bildschirm " Kanäle auswählen" Kanal 1 für Hellfeld und Kanal 7 für die DNA-Färbung aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf einen Kanal und klicken Sie auf Auf alle anwenden. Klicken Sie dann auf Weiter.
8. Klicken Sie abschließend auf dem Bestätigungsbildschirm auf Experiment erstellen. Die KI-Software lädt das ausgewählte Modell und alle Bilder aus den ausgewählten Datendateien. Klicken Sie auf Fertig stellen.
9. Klicken Sie auf Klassifizieren , um den Klassifizierungsbildschirm zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Klassifizieren . Dadurch wird der Prozess der Verwendung des RF- und CNN-Modells gestartet, um zusätzliche Daten zu klassifizieren und alle Objekte zu identifizieren, die zu den angegebenen Modellklassen gehören.
   HINWEIS: Die Kontrollkästchen können verwendet werden, um das HF-Modell und/oder das CNN-Modell auszuwählen.
10. Sobald die Klassifizierung abgeschlossen ist, klicken Sie auf Ergebnisse anzeigen.
11. Klicken Sie auf die Schaltfläche DAFs aktualisieren, um das Fenster DAFs mit Klassifizierungsergebnissen aktualisieren aufzurufen. Klicken Sie auf OK, um die .daf-Dateien zu aktualisieren.

7. Generieren eines Berichts über die Klassifizierungsergebnisse

1. Klicken Sie auf dem Ergebnisbildschirm auf Bericht erstellen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Bericht für jeden Eingangs-DAF erstellen, wenn ein individueller Bericht für jeden Eingangs-DAF erforderlich ist. Klicken Sie auf OK.
2. Wenn Sie fertig sind, öffnen Sie den Ordner, in dem die Berichtsdateien gespeichert wurden. Innerhalb des Ordners befinden sich ein Experiment .pdf Bericht und ein Ressourcenordner.
3. Öffnen Sie die .pdf, um den Bericht anzuzeigen. Der Bericht enthält Modell- und Experimentinformationen, die Liste der DAF-Eingabedateien, die Klassenanzahl und die Klassenprozentsätze im Tabellen- und Histogrammformat sowie eine Konfusionsmatrix, die die mittlere Vorhersagewahrscheinlichkeit für alle DAF-Eingabedateien zusammenfasst.
4. Öffnen Sie den Ordner Resources und dann den Ordner CNN . In diesem Ordner befinden sich .png Dateien der Klassenanzahl und der prozentualen Balkendiagramme sowie der Konfusionsmatrix. Darüber hinaus gibt es .csv Dateien, die die Klassenanzahl und die Prozentsätze für jede Eingabedatei enthalten.

8. Bestimmung der MN-Häufigkeit und Zytotoxizität

1. Berechnung der MN-Frequenz
   1. Nicht-Cyt-B-Methode: Um die MN-Frequenz zu bestimmen, öffnen Sie die class_count.csv Datei aus Schritt 7.4. Teilen Sie für jede Eingabedatei die Anzahl in der Population "Mononucleated with MN" durch die Anzahl in der Population "Mononucleated" und multiplizieren Sie sie mit 100:
      
   2. Cyt-B-Methode: Um die MN-Frequenz zu bestimmen, öffnen Sie die class_count.csv Datei aus Schritt 7.4. Teilen Sie für jede Eingabedatei die Anzahl in der Population "Zweikernig mit MN" durch die Anzahl in der Population "Zweikernig" und multiplizieren Sie sie mit 100:
      
2. Berechnung der Zytotoxizität
   1. Nicht-Cyt-B-Methode:
      1. Berechnen Sie anhand der anfänglichen Zellzahlen und der Zellzahlen nach der Behandlung zunächst die Verdopplung der Grundgesamtheit (PD) für jede Stichprobe²:
         
      2. Berechnen Sie als Nächstes die relative Bevölkerungsverdopplung²:
         
      3. Berechnen Sie abschließend die Zytotoxizität² für jede Probe:
         
   2. Cyt-B-Methode:
      1. Um den Zytokinese-Block-Proliferationsindex (CBPI)² zu berechnen, verwenden Sie die Zählungen in den einkernigen, zweikernigen und mehrkernigen Klassen für jede Probe aus der class_count.csv Datei:
         
      2. Um die Zytotoxizität² zu berechnen, verwenden Sie den CBPI aus den Kontrollkulturen (C) und den exponierten Kulturen (T):
         

Results

Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf für die Verwendung der KI-Software zur Erstellung eines Modells für den MN-Assay. Der Benutzer lädt die gewünschten .daf-Dateien in die KI-Software und weist dann den Ground-Truth-Modellklassen mithilfe der KI-gestützten Cluster- (Abbildung 2) und Predict-Tagging-Algorithmen (Abbildung 3) Objekte zu. Sobald alle Ground-Truth-Modellklassen mit ausreichend Objekten gefüllt wurden, kann das Modell mi...

Discussion

Die hier vorgestellte Arbeit beschreibt den Einsatz von Deep-Learning-Algorithmen zur Automatisierung des Scorings des MN-Assays. Mehrere neuere Veröffentlichungen haben gezeigt, dass intuitive, interaktive Werkzeuge die Erstellung von Deep-Learning-Modellen zur Analyse von Bilddaten ermöglichen, ohne dass tiefgreifende Rechenkenntnisse erforderlich sind^18,19. Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll, das ein benutzeroberflächengesteuertes Softwarepaket verwen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Zentrifugenröhrchen	Falcon	352096
Cleanser - Coulter Clenz	Beckman Coulter	8546931	Füllen Sie den Behälter mit 200 mL Reiniger.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine	MilliporeSigma	64-86-8
Corning Vakuumfilter mit Flaschenaufsatz	MilliporeSigma	CLS430769	0,22 &Mikro; m Filter, 500 mL Flasche
Cytochalasin B	MilliporeSigma	14930-96-2	5 mg Flasche
Debubbler - 70% Isopropanol	MilliporeSigma	1.3704	Behälter mit 200 mL Debubbler füllen.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethylsulfoxid (DMSO)	MilliporeSigma	67-68-5
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1X	EMD Millipore	BSS-1006-B	PBS Ca++MG++ Kostenlos
Fötales Rinderserum	HyClone	SH30071.03
Formaldehyd, 10%, methanolfrei, Ultra Pure	Polysciences, Inc.	04018	Dies wird für das 4%ige und 1%ige Formalin verwendet. ACHTUNG: Formalin/Formaldehyd giftig beim Einatmen und Verschlucken. Reizt die Augen, die Atemwege und die Haut. Kann durch Einatmen oder Hautkontakt eine Sensibilisierung verursachen. Gefahr schwerer Augenschäden  Potentielle Krebsgefahr. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Guava Muse Cell Analyzer	Luminex	0500-3115	Es wurde ein Guava Muse Cell Analyzer in der Standardkonfiguration verwendet.
Hoechst 33342	Thermo Fisher	H3570	10 mg/ml Lösung
Mannitol	MilliporeSigma	69-65-8
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren 100X	HyClone	SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II	Luminex, ein DiaSorin-Unternehmen	100220	A 2 Kamera ImageStreamX Mark II ausgestattet mit den Lasern 405 nm, 488 nm und 642 nm Es wurde verwendet.
MIFC-Analysesoftware - IDEAS	Luminex, ein DiaSorin-Unternehmen	100220	"Bildanalyse-Software" Die Begleitsoftware zur MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC-Software - INSPIRE	Luminex, ein DiaSorin-Unternehmen	100220	"Bilderfassungssoftware" Dies ist die Software, die die MIFC (ImageStreamX MKII)
Amnis AI-Software	ausführt Luminex, ein DiaSorin-Unternehmen	100221	"AI Software" Dies ist die Software, die die Erstellung von Modellen mit künstlicher Intelligenz zur Analyse von Daten ermöglicht
Mitomycin C	MilliporeSigma	50-07-7
NEAA Mixture 100x	Lonza BioWhittaker	13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X	Gibco	15070063
Kaliumchlorid (KCl)	MilliporeSigma	P9541
Spülen - Reinstwasser oder entionisiertes Wasser	NA	NA	Verwenden Sie Reinstwasser oder entionisiertes Wasser.  Füllen Sie den Behälter mit 900 mL Spülung.
RNase	MilliporeSigma	9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1x	HyClone	SH30027.01
Hülle - PBS	MilliporeSigma	BSS-1006-B	Dies ist das gleiche wie Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung 1x  Ca++MG++ kostenlos.  Füllen Sie den Behälter mit 900 mL Mantel.
Steriles Wasser	HyClone	SH30529.01
Sterilisator - 0,4%– 0,7 % Hypochlorit	VWR	JT9416-1	Dies ist durchschnittlich 10 % Clorox-Bleiche, die durch Entlühen von Clorox-Bleiche mit Wasser hergestellt werden kann. Füllen Sie den Behälter mit 200 mL Sterilisator.
T25-Kolben	Falcon	353109
T75-Kolben	Falcon	353136
TK6-Zellen	MilliporeSigma	95111735