Method Article

Entwicklung onkogener heterozygoter Gain-of-Function-Mutationen in humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen

DOI:

10.3791/64558

⸱

March 10th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology, Department of Internal Medicine, Medical University of Graz, 2Division of Hematology, Stanford Cancer Institute, Stanford Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Blood Group Serology and Transfusion Medicine, Medical University of Graz

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neue Strategien zur getreuen Modellierung somatischer Mutationen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) sind notwendig, um die hämatopoetische Stammzellbiologie und hämatologische Malignome besser zu untersuchen. Hier wird ein Protokoll zur Modellierung heterozygoter Gain-of-Function-Mutationen in HSPCs durch Kombination der Verwendung von CRISPR/Cas9 und dualer rAAV-Donortransduktion beschrieben.

Abstract

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Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) erwerben im Laufe ihres Lebens somatische Mutationen. Einige dieser Mutationen verändern die funktionellen Eigenschaften von HSPC wie Proliferation und Differenzierung und fördern so die Entwicklung hämatologischer Malignome. Eine effiziente und präzise genetische Manipulation von HSPCs ist erforderlich, um die funktionellen Konsequenzen rezidivierender somatischer Mutationen zu modellieren, zu charakterisieren und besser zu verstehen. Mutationen können eine schädliche Wirkung auf ein Gen haben und zu einem Funktionsverlust (LOF) führen oder im Gegensatz dazu die Funktion verbessern oder sogar zu neuen Eigenschaften eines bestimmten Gens führen, die als Gain-of-Function (GOF) bezeichnet werden. Im Gegensatz zu LOF-Mutationen treten GOF-Mutationen fast ausschließlich heterozygot auf. Aktuelle Genom-Editing-Protokolle erlauben kein selektives Targeting einzelner Allele und behindern die Fähigkeit, heterozygote GOF-Mutationen zu modellieren. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, wie heterozygote GOF-Hotspot-Mutationen in menschlichen HSPCs durch die Kombination von CRISPR/Cas9-vermittelter homologiegesteuerter Reparatur und rekombinanter AAV6-Technologie für einen effizienten DNA-Spendervorlagentransfer konstruiert werden können. Wichtig ist, dass diese Strategie ein duales Fluoreszenz-Reporter-System verwendet, um die Verfolgung und Aufreinigung von erfolgreich heterozyg editierten HSPCs zu ermöglichen. Mit dieser Strategie kann genau untersucht werden, wie sich GOF-Mutationen auf die HSPC-Funktion und ihre Progression hin zu hämatologischen Malignomen auswirken.

Introduction

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Mit der Entwicklung der CRISPR/Cas9-Technologie (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) wurde das Instrumentarium der Wissenschaftler um ein neues und extrem leistungsfähiges Instrument erweitert. Diese Technologie ermöglicht die präzise Manipulation des Genoms und hat sich nicht nur für Forschungszwecke als äußerst nützlich erwiesen (in Hsu et al.1), sondern wurde in jüngster Zeit auch erfolgreich in das klinische Umfeld übertragen 2,3,4. CRISPR/Cas9-Editierungsstrategien beruhen auf der Aktivität eines Cas9-Proteins und einer Single-Guide-RNA (sgRNA)5,6,7. In der Wirtszelle wird das Cas9-Protein zu einer bestimmten Stelle in der DNA geführt, die komplementär zur sgRNA-Sequenz ist und einen DNA-Doppelstrangbruch (DSB) einleitet. Sobald ein DSB generiert ist, gibt es zwei Haupt- und konkurrierende Reparaturmechanismen, die auftreten können: nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und homologiegesteuerte Reparatur (HDR). NHEJ ist ein fehleranfälliger, vorwiegend verwendeter Reparaturmechanismus, der zu Insertionen und Deletionen (Indels) führt, während HDR durch die Verwendung der Schwesterchromatide als Reparaturschablone sehr präzise, aber auf die S- oder G2-Phase des Zellzyklus beschränkt ist8. Im Genome Engineering kann HDR für die gezielte Modifikation von DNA verwendet werden, indem eine Spenderschablone bereitgestellt wird, die von Homologiearmen flankiert wird, die mit beiden DNA-Enden des Cas9-induzierten DSB identisch sind (Abbildung 1). Die Art der Spendervorlage, die für HDR verwendet wird, kann sich stark auf die Bearbeitungseffizienz auswirken. Für die Gentechnik in humanen HSPCs wurde kürzlich das Adeno-assoziierte Virus Serotyp 6 (AAV6) als hervorragendes Vehikel für die Verabreichung von einzelsträngigen DNA-Templatesbeschrieben 9,10.

CRISPR/Cas9 Genome Engineering kann therapeutisch eingesetzt werden, um schädliche Mutationenzu korrigieren 11, kann aber auch verwendet werden, um pathogene Mutationen in die DNA einzuführen, um die Krebsentwicklung zu modellieren12. Blutkrebs, wie Leukämie, entwickelt sich durch den sequentiellen Erwerb somatischer Mutationen in gesunden HSPCs13,14. Frühe genetische Ereignisse führen zu einem klonalen proliferativen Vorteil, was zu einer klonalen Hämatopoese mit unbestimmtem Potential (CHIP) führt15,16. Der weitere Erwerb von Mutationen wird schließlich zu einer leukämischen Transformation und der Entwicklung der Krankheit führen. Somatische Mutationen können in Genen gefunden werden, die die Selbsterneuerung, das Überleben, die Proliferation und die Differenzierung steuern17.

Die Einführung einzelner Mutationen durch Genome Engineering in gesunde HSPCs ermöglicht die präzise Modellierung dieses schrittweisen leukemogenen Prozesses. Die begrenzte Anzahl wiederkehrender Mutationen, die in myeloischen Neoplasien wie der akuten myeloischen Leukämie (AML)18,19 gefunden werden, macht diese Krankheit besonders anfällig für die Rekapitulation mit Genom-Engineering-Werkzeugen.

Somatische Mutationen können nur auf einem Allel (monoallelische/heterozygote Mutationen) oder auf beiden Allelen (biallelische/homozygote Mutationen) auftreten und tiefgreifende Auswirkungen auf die Funktion des Gens haben, was zu einem Funktionsverlust (LOF) oder einem Funktionsgewinn (GOF) führen kann. LOF-Mutationen führen zu einer reduzierten (wenn ein Allel betroffen ist) oder vollständigen (wenn beide Allele betroffen sind) LOF des Gens, während GOF-Mutationen zu einer erhöhten Aktivierung oder neuen Funktion des Gens führen. GOF-Mutationen sind typischerweise heterozygot20.

Wichtig ist, dass die Zygotie (hetero- vs. homozygot) große Auswirkungen auf den Versuch hat, eine Mutation originalgetreu zu modellieren. Daher ist die gezielte Manipulation von nur einem Allel eines Gens notwendig, um heterozygote Hotspot-GOF-Mutationen zu erzeugen. Fehleranfällige NHEJ führt zu unterschiedlich langen Indels21, die zu unterschiedlichen, unvorhersehbaren biologischen Konsequenzen führen können. Da NHEJ jedoch das vorherrschende Reparaturprogramm ist, das von Zellen nach der Einführung eines DSB eingesetzt wird, erlauben die meisten CRISPR/Cas9-Plattformen, die derzeit zur Manipulation von HSPCs verwendet werden, keine genaue Vorhersage des genetischen Ergebnisses22,23. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Einführung eines CRISPR/Cas9-vermittelten Doppelstrangbruchs (DSBs) in Kombination mit der Verwendung von rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV) vektorbasierten DNA-Donor-Templates für das Genom-Engineering mittels HDR die allelspezifische Insertion von Mutationen in humane HSPCs11,24. Die gleichzeitige Integration einer mutierten und einer Wildtyp-Sequenz (WT) gekoppelt mit unterschiedlichen fluoreszierenden Reportern auf den einzelnen Allelen kann durchgeführt werden, um einen heterozygoten Genotyp auszuwählen (Abbildung 2). Diese Strategie kann als leistungsfähiges Werkzeug genutzt werden, um die Auswirkungen von wiederkehrenden, leukämischen, heterozygoten GOF-Hotspot-Mutationen auf die HSPC-Funktion, Krankheitsinitiierung und -progression genau zu charakterisieren.

In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll für das effiziente Engineering rezidivierend mutierter heterozygoter GOF-Mutationen in primären humanen HSPCs bereitgestellt. Diese Strategie kombiniert die Verwendung von CRISPR/Cas9 und einer dualen AAV6-Transduktion, um WT- und mutierte DNA-Spenderschablonen für die prospektive Erzeugung der heterozygoten GOF-Mutation bereitzustellen. Als Beispiel wird gezeigt, wie die rezidivierenden Typ-1-Mutationen (52-bp-Deletion) im Calretikulin-Gen (CALR) hergestellt werden25. Die heterozygote GOF-Mutation im Exon 9 von CALR wird wiederholt bei myeloproliferativen Erkrankungen wie der essentiellen Thrombozythämie (ET) und der primären Myelofibrose (PMF) gefunden26. CALR ist ein endoplasmatisches Retikulum-residentes Protein, das in erster Linie eine Qualitätskontrollfunktion im Faltungsprozess neu synthetisierter Proteine hat. Seine Struktur kann in drei Hauptdomänen unterteilt werden: eine Amino(N)-terminale Domäne und eine prolinreiche P-Domäne, die an der Chaperonfunktion des Proteins beteiligt sind, und eine C-Domäne, die an der Kalziumspeicherung und -regulation beteiligt ist27,28. CALR-Mutationen verursachen eine +1-Frameshift, die zur Transkription eines neuartigen verlängerten C-terminalen Endes und zum Verlust des endoplasmatischen Retikulums (ER)-Retentionssignals (KDEL) führt. Es wurde gezeigt, dass mutierte CALR den Thrombopoietin-Rezeptor (TPO) bindet, wodurch eine TPO-unabhängige Signalübertragung mit erhöhter Proliferation erreichtwird 29.

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Abbildung 1: NHEJ- und HDR-Reparatur. Vereinfachte schematische Darstellung von NHEJ- und HDR-Reparaturmechanismen nach der Einführung eines doppelsträngigen Bruchs in der DNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 2: Schematische Übersicht über die biallelische HDR-Bearbeitungsstrategie. Schematische Darstellung, die die Integration der Donor-Templates in die Ziel-Allele zeigt, gefolgt von ihrer Translation in funktionierende mRNAs. Die orange gepunkteten Kästchen zeigen die Regionen an, die dem linken Homologiearm (LHA) und dem rechten Homologiearm (RHA) entsprechen. Die ideale Größe der HAs beträgt jeweils 400 bp. Das grün gepunktete Feld stellt den Bereich dar, der der SA-Sequenz entspricht. Die Größe der SA beträgt 150 bp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

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Dieses Protokoll erfordert die Verwendung gesunder CD34+ HSPCs aus Spendern und erfordert eine ethische Genehmigung der lokalen institutionellen Prüfungsausschüsse (IRB) sowie eine unterzeichnete Einverständniserklärung. Die in diesem Protokoll verwendeten CD34+ HSPCs wurden aus dem Nabelschnurblut (UCB) von Termgeburten (>34 Schwangerschaftswochen) isoliert. Die Einverständniserklärung der Mütter wurde vor der Entbindung eingeholt und die ethische Genehmigung für die Entnahme von UCB (IRB-Zulassung: 31-322 ex 18/19) von der Medizinischen Universität Graz eingeholt. Eine vollständige Liste der in diesem Protokoll verwendeten Materialien finden Sie in der Materialtabelle.

1. sgRNA-Design und Bewertung der Schneideeffizienz

  1. Suchen Sie nach dem Ort der gewünschten Mutation und dem korrekten Transkript in einem Online-Datenbanktool (z. B. COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic).
  2. Wählen Sie eine sgRNA aus, die an die Mutation angrenzt (exonisches Targeting) oder im vorherigen Intron (intronisches Targeting) ist, indem Sie ein sgRNA-Design-Tool verwenden. In diesem Protokoll kommt das Online-Tool von Benchling zum Einsatz. Eine Liste möglicher Online-Tools für das sgRNA-Design finden Sie im Materialverzeichnis .
  3. Wählen Sie die Option + (Erstellen) > DNA-Sequenz > DNA-Sequenzen importieren > Aus Datenbanken importieren. Geben Sie das gewünschte Gen ein, z. B. CALR, und wählen Sie Mensch als Spezies > Suchen Sie > Wählen Sie das richtige Transkript aus (z. B. CALR-201 -ENST00000316448) > Importieren. Wählen Sie den gewünschten Bereich aus, in dem die DS-Unterbrechung eingeführt werden soll (z. B. Intron 7).
  4. Wählen Sie die Option CRISPR auf der rechten Seite des Bildschirms und wählen Sie Hilfslinien entwerfen und analysieren. Wählen Sie eine einzelne Führung, halten Sie die Führungslänge auf 20 bp und PAM-Sequenz für die Bearbeitung mit SpCas9 (NGG).
  5. Wählen Sie einen Leitfaden mit einem hohen On-Target-Score (hohe Chance für die Bearbeitung am gewünschten Ort) und einem hohen Off-Target-Score (geringe Wahrscheinlichkeit, an unerwünschten Loci zu bearbeiten). Wählen Sie mindestens drei Guides zum Testen aus, um die leistungsstärkste sgRNA zu finden. Bestellen Sie die sgRNA als chemisch modifizierte synthetische sgRNA bei einem kommerziellen Anbieter.
    HINWEIS: Es ist in diesem Stadium ratsam, eine kleine Menge der synthetischen sgRNAs für das erste Screening zu bestellen. Sobald eine gut funktionierende sgRNA identifiziert wurde, fahren Sie mit einer größeren Reihenfolge der ausgewählten sgRNA fort.
  6. Tauen Sie 2 x 10 5-5 x 105 CD34+ HSPCs auf. Übertragen Sie die Zellen in 10 ml vorgewärmtes RPMI1640, das mit 1% Antibiotika (z. B. Penicillin / Streptomycin) ergänzt wird.
    HINWEIS: CD34+ HSPCs mit einer Reinheit >90% sollten verwendet werden, um die besten und reproduzierbarsten Ergebnisse zu erzielen.
  7. Zentrifuge bei 350 x g bei Raumtemperatur (RT) für 10 min. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und suspendieren Sie die Zellen in SFEM II-Medium, ergänzt mit 0,2% Penicillin / Streptomycin (P / S), 100 ng / ml Thrombopoietin (TPO), 100 ng / ml Stammzellfaktor (SCF), 100 ng / ml FMS-ähnlicher Tyrosinkinase-3-Ligand (FLT3L), 100 ng / ml Interleukin-6 (IL-6), 35 nM UM171 und 0,75 μM StemRegenin1 (SR1) auf eine Konzentration von 2,5 x 105 Zellen / ml . Bei 37 °C/5% CO2 48 h -72 h inkubieren.
    HINWEIS: Das komplette Medium wird von nun an als HSPC-Retentionsmedium bezeichnet.
  8. Sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen und zählen Sie die Zellen. Überprüfen Sie die Zelllebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss.
    1. Bevor Sie beginnen, schalten Sie das Transfektionssystem ein und wählen Sie die Option für die Küvetten. Wählen Sie das geeignete Programm und die Nukleofektionslösung für HSPCs aus (siehe Materialtabelle). Zwischen 2 x 10 5 und5 x 106 Zellen können in einer 100 μL Küvette nukleofektiert werden. Legen Sie eine kleine Anzahl von Zellen (z. B. 1 x 10 5-2 x 105) beiseite, um sie 48 h lang in Kultur zu halten, um sie als WT-Kontrolle zu verwenden.
  9. Bereiten Sie den RNP-Komplex vor. In einem 1,5-ml-Röhrchen werden 15 μg Cas9 und 8 μg sgRNA (molares Verhältnis 1:2,5) hinzugefügt und bei 25 °C für 10 min in einem Heizblock inkubiert.
  10. Während der RNP-Komplex inkubiert, zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 x g bei RT für 5 min und verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette. Suspendieren Sie die Zellen in 100 μL Nukleofektionslösung.
  11. Mischen Sie die Zellen mit dem RNP-Komplex und geben Sie sie in die Küvette. Klopfen Sie vorsichtig auf die Küvette, um eventuelle Luftblasen zu entfernen, die sich während des Transfers gebildet haben könnten.
  12. Führen Sie die Küvette in die Halterung des Transfektionssystems ein und elektroporieren Sie die Zellen mit dem DZ-100-Programm.
  13. Unmittelbar nach der Elektroporation werden 400 μL vorgewärmtes HSPC-Retentionsmedium ohne P/S zugegeben.
  14. Die Zellen werden mit einer feinen Transferpipette in eine Kulturplatte überführt, die vorgewärmtes HSPC-Retentionsmedium ohne P/S enthält. Verwenden Sie je nach Zellzahl eine geeignete Kulturplatte (24-, 12- oder 6-Well-Platte), um eine Dichte zwischen 0,25 x 10 6 und 1 x 106 Zellen/ml zu erreichen.
  15. Die Platte wird bei 37 °C/5 % CO2 in den Inkubator gegeben. Inkubieren Sie die nukleofekten Zellen für 6-8 h.
  16. Entfernen Sie nach 6-8 h das alte Medium und ersetzen Sie es durch frisches, vorgewärmtes HSPC-Retentionsmedium, das mit P/S ergänzt wird. Suspendieren Sie die Zellen bei einer Konzentration zwischen 2,5 x 10 5 und 5 x 105 und übertragen Sie sie auf eine Zellkulturplatte (24-, 12- oder 6-Well-Platte). Inkubieren Sie die Zellen für 48 h bei 37°C/5%CO2.
  17. 2 x 105 Zellen ernten und bei 350 x g bei RT 5 min zentrifugieren. Stellen Sie die Heizblöcke vor dem Start auf 65 °C und 98 °C ein.
  18. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x DPBS in einem 1,5 mL Röhrchen. Zentrifuge bei 350 x g bei RT für 5 min.
  19. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 50 μl DNA-Extraktionslösung. Wirbel für 15 s.
  20. 6 min bei 65 °C inkubieren. Wirbeln für 15 s und 2 min bei 98 °C inkubieren.
  21. Amplifizieren Sie die Region des DSB durch PCR mit Primern, die ein Amplikon von etwa 400-600 bp mit dem DSB in der Mitte erzeugen. Verwenden Sie 0,5-1 μL extrahierte DNA für die PCR-Reaktion.
    HINWEIS: Aufgrund der Zusammensetzung der DNA-Extraktionslösung können die DNA-Konzentrationen durch Spektrophotometrie nicht genau quantifiziert werden.
  22. Lassen Sie das PCR-Produkt mit einer DNA-Leiter auf einem 1,5%igen Agarose-Gel bei 100 V für 45-60 min laufen. Legen Sie das Gel auf ein blaues Licht oder einen UV-Transilluminator.
  23. Extrahieren Sie die DNA-Bande der richtigen Größe aus dem Gel, indem Sie ein handelsübliches Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwenden (siehe Materialtabelle).
  24. Sequenzieren Sie die Proben durch Sanger-Sequenzierung mit dem Forward-Primer oder Reverse-Primer aus der PCR. Für PCR-Produkte mit einer Länge von 400-600 bp werden 75 ng DNA für die Sequenzierung mit einer Konzentration von 5 ng/ml in einem Gesamtvolumen von 15 μL benötigt.
  25. Analysieren Sie die Bearbeitungseffizienz der sgRNAs, indem Sie die Sequenzierungsdateien in ein Programm hochladen, das die Bearbeitungseffizienz berechnet, indem Sie die von der sgRNA erzeugten Insertionen und Deletionen identifizieren. Wählen Sie die leistungsstärkste sgRNA aus, mit der Sie fortfahren möchten.
    HINWEIS: Dedizierte Online-Tools sind im Materialverzeichnis aufgeführt. Diese Analyse erfordert die .ab1-Dateien der transfizierten und WT-HSPCs, die sgRNA-Sequenz und die PAM-Sequenz.

2. Homologie-gerichtete Reparatur (HDR) Vektorkonstruktion

  1. HDR-Vorlagen-Design
    HINWEIS: Es sollten zwei HDR-Vorlagen entworfen werden: eine Vorlage für die WT-Sequenz und eine Vorlage für die mutierte Sequenz.
    1. Importieren Sie die genomische Sequenz und die kodierende Sequenz (CDS) des gewünschten Gens in eine geeignete Software für die molekulare Klonierung (spezielle Werkzeuge finden Sie in der Materialtabelle). Entwerfen Sie aus der genomischen Sequenzdatei den linken Homologiearm (HA), indem Sie idealerweise 400 bp am 5'-Ende des DSB auswählen. Fügen Sie diese Sequenz in eine neue Datei ein.
    2. Wenn ein Intron mit der sgRNA angegriffen wird, muss eine Spleißakzeptorsequenz (SA) enthalten sein. Wählen Sie die letzten 150 bp des Zielintrons aus und fügen Sie es nach dem linken HA ein. Wenn das Exon direkt anvisiert wird, ist diese Sequenz nicht notwendig (Abbildung 3).
    3. Wählen Sie aus der CDS-Datei die gewünschte cDNA aus. Falls eine exonische Sequenz anvisiert wird, stellen Sie sicher, dass die cDNA unmittelbar stromabwärts der DSB-Stelle beginnt und alle folgenden Exons des interessierenden Gens sowie das Stop-Codon enthält. Falls ein Intron anvisiert wird, stellen Sie sicher, dass die cDNA mit dem ersten Codon des folgenden Exons beginnt. Codon-Optimierung der cDNA und Einfügen nach der SA-Sequenz. Verwenden Sie zu diesem Zweck spezielle Online-Tools (Materialverzeichnis).
    4. Fügen Sie ein 3'-Polyadenylierungssignal (PolyA) nach der interessierenden cDNA (z. B. SV40 oder bGH) ein (Tabelle 1). Fügen Sie im Anschluss an das PolyA eine Promotorsequenz (z. B. Milzfokusbildendes Virus [SFFV] oder Polyubiquitin C [UBC], Tabelle 1) für das fluoreszierende Protein ein.
    5. Fügen Sie die Sequenz für das fluoreszierende Protein ein (d. h. entweder GFP, BFP oder mCherry). Fügen Sie ein zweites, aber anderes PolyA-Signal ein.
      HINWEIS: Das Einfügen einer anderen PolyA-Sequenz vermeidet Probleme wie bakterielle Rekombination des Plasmids oder Probleme mit der Sequenzausrichtung aufgrund von zwei identischen Sequenzen in der Vorlage.
    6. Entwerfen Sie aus der genomischen Sequenzdatei die richtige HA, indem Sie idealerweise 400 bp am 3'-Ende des DSB auswählen. Fügen Sie diese Sequenz nach dem zweiten PolyA ein.
    7. Erstellen Sie eine Kopie der gesamten Vorlage und modifizieren Sie die gewünschte cDNA so, dass sie die Sequenz der gewünschten Mutation enthält.
    8. Tauschen Sie das fluoreszierende Protein gegen ein anderes fluoreszierendes Protein aus. Wenn z.B. GFP für das WT-Template verwendet wurde, dann tauschen Sie es gegen BFP oder mCherry gegen das mutierte Template aus. Konstruieren und klonen Sie die HDR-Vorlagen in das pAAV-MCS-Plasmid (oder andere geeignete Backbones).
      HINWEIS: Die für die Assemblierung benötigten Fragmente können entweder durch PCR hergestellt oder kommerziell bestellt werden und müssen überlappende Sequenzen mit ihren benachbarten Fragmenten enthalten. Wenn es sich bei der interessierenden Mutation um eine Punktmutation, eine kleine Insertion oder eine kleine Deletion handelt, kann die mutierte cDNA durch PCR erzeugt werden, indem eine ortsgerichtete Mutagenese an der HDR-Schablone durchgeführt wird, die die WT-cDNA enthält.
    9. Verwandeln Sie kompetente Escherichia coli mit dem zusammengebauten Produkt unter Verwendung der Hitzeschockmethode. Bevor Sie beginnen, legen Sie die Bakterien zum Auftauen für 10 min auf Eis.
    10. Geben Sie 2 μL der zusammengebauten Produkte zu 50 μL Bakterien. Mischen Sie den Inhalt durch leichtes Schnippen.
    11. Legen Sie die Proben für 30 Minuten auf Eis. Die Proben werden für 30 s auf einen auf 42 °C eingestellten Thermoblock überführt.
    12. Übertragen Sie die Proben für 5 Minuten auf Eis. Geben Sie 450 μL SOC-Medium bei Raumtemperatur hinzu und inkubieren Sie die Proben bei 37 °C für 1 h.
    13. Verteilen Sie die Proben auf LB-Agarplatten, die Ampicillin enthalten. Verteilen Sie für jede Probe 100 μL von drei verschiedenen Verdünnungen der Bakterienlösung (unverdünnt, 1:5 und 1:10), um LB-Agarplatten mit einzelnen Kolonien zu erhalten, die entnommen werden können. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
    14. Am nächsten Tag wählen Sie drei Kolonien pro Probe. Die Kolonien werden in 15-ml-Röhrchen mit Kappen mit 4 ml LB-Medium, ergänzt mit Ampicillin, überführt und über Nacht in einem Shaker bei 37 °C inkubiert.
    15. Aliquot 500 μL der Bakterienlösung aus jeder Kolonie und im Kühlschrank für die spätere Verwendung aufbewahren. Führen Sie eine Mini-Vorbereitung durch, um Plasmid-DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren.
    16. Senden Sie die Proben zur Sanger-Sequenzierung, um die korrekte Montage der Plasmide zu bestätigen. Verwenden Sie genügend Primer, die im gesamten Plasmid verteilt sind, um eine ununterbrochene Sequenzbestätigung zu gewährleisten, wobei idealerweise jeder Bereich zweimal mit Vorwärts- und Rückwärtslesen abgedeckt wird.
    17. 200 μL der Bakterienlösung, die das korrekt zusammengesetzte Plasmid enthält, zu 200 ml LB-Medium, ergänzt mit Ampicillin, geben und über Nacht in einem Shaker bei 37 °C inkubieren.
    18. Führen Sie eine Midi- oder Maxi-Vorbereitung durch, um die Plasmid-DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren. Lagern Sie die Plasmid-DNA bei −20 °C.
  2. Rekombinante AAV6-Zubereitung
    HINWEIS: Es müssen zwei separate AAV6-Vorbereitungen durchgeführt werden: eine für den rAAV6 mit der WT HDR-Vorlage und eine für den rAAV6 mit der mutierten HDR-Vorlage. In diesem Abschnitt werden die Schritte beschrieben, die für die Vorbereitung nur eines Virus erforderlich sind.
    1. Tauen Sie die HEK293T-Zellen auf, übertragen Sie die Zellen in 10 ml vorgewärmtes DMEM, das mit 10% FBS, 1% P/S und 25 mM HEPES angereichert ist, und zentrifugieren Sie bei 350 x g bei RT für 5 min.
    2. Die Zellen werden in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/ml suspendiert und in einen geeigneten Kolben (z. B. einen 175 cm2 Kolben) überführt. Der Kolben wird bei 37 °C/5 %CO2 in einen Inkubator überführt.
      HINWEIS: HEK293T-Zellen sollten im Voraus aufgetaut werden, damit sich die Zellen vollständig erholen und eine ausreichende Anzahl von Zellen erhalten können (11 x 107 Zellen sind für die Produktion eines Virus erforderlich). Es wird empfohlen, die Zellen nach mindestens drei Passagen zu verwenden und die Zellen unter 20 Passagen zu halten. HEK293T-Zellen sollten dreimal pro Woche gespalten werden. Während die Zellen erhalten bleiben, sollten diese 70%-80% Konfluenz nicht überschreiten. Das in der AAV-Zubereitung verwendete DMEM sollte ebenfalls bereits mit L-Glutamin und Natriumpyruvat ergänzt werden.
    3. Die Zellen in einem 50 ml Röhrchen sammeln und bei 350 x g bei RT 5 min zentrifugieren.
    4. Suspendieren Sie die Zellen in 20 ml DMEM, ergänzt mit 10% FBS, 1% P / S und 25 mM HEPES, und zählen Sie mit einem Hämozytometer. Verwenden Sie Trypanblau für den Ausschluss toter Zellen.
    5. Aussaat 3 x 106 Zellen in 20 ml DMEM, ergänzt mit 10% FBS, 1% P/S und 25 mM HEPES in einem 175 cm2 Kolben. Für die Produktion eines Virus sind mindestens vier 175 cm2-Flaschen vorzubereiten. Die Zellen 3 Tage lang bei 37 °C/5%CO2 inkubieren.
      HINWEIS: Dieser Schritt wird am besten an einem Freitag durchgeführt, da sich die Zellen am Wochenende ausdehnen können.
    6. Ernten und zählen Sie die HEK293T-Zellen.
    7. Für die Herstellung eines der Viren bereiten Sie zehn 150-mm-Schalen mit jeweils 11 x 106 HEK293T in 20 ml DMEM vor, ergänzt mit 10% FBS, 1% P/S und 25 mM HEPES.
    8. Stellen Sie das Geschirr 24 h bei 37 °C/5%CO2 in den Inkubator. Entsorgen Sie das alte Medium vorsichtig und ersetzen Sie es durch 20 ml antibiotikafreies DMEM, ergänzt mit 10% FBS, 25 mM HEPES und 1 mM Natriumbutyrat. Bevor Sie fortfahren, überprüfen Sie, ob der Zusammenfluss der Zellen nicht über 80% liegt.
    9. Bereiten Sie zwei 15-ml-Röhrchen vor, die die Transfektionsmischungen enthalten. Zu Röhrchen 1 werden 5 ml reduziertes Serummedium, 60 μg rAAV6-mutiertes HDR-Plasmid und 220 μg pDGM6 (Helferplasmid) hinzugefügt. In Röhrchen 2 werden 5 ml reduziertes Serummedium und 1120 μl 1 mg/ml Polyethyleniminlösung (PEI, Transfektionsreagenz) gegeben.
    10. Fügen Sie den Inhalt von Röhre 2 zu Röhre 1 hinzu und wirbeln Sie für 30 s. Inkubieren Sie für 15 Minuten bei RT, um eine ordnungsgemäße Verkapselung der DNA in die PEI-Mizellen zu gewährleisten.
      HINWEIS: Bewahren Sie die Lösung nicht länger als 20 Minuten auf.
    11. Geben Sie vorsichtig tropfenweise 1,1 ml der Lösung in jede Schale und verteilen Sie sie durch leichtes Schwenken. Das Geschirr 48 h bei 37 °C/5%CO2 in den Inkubator stellen.
    12. Nach 48 h 250 μL 0,5 M EDTA in jede Schale geben und die Schalen für 10 Minuten in den Inkubator stellen. Ernten Sie die Zellen, indem Sie sie von der Schale abwaschen und in ein 500-ml-Zentrifugenröhrchen oder mehrere 50-ml-Röhrchen überführen.
    13. Zentrifuge bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand. Um die vollständige Entfernung des Überstands zu gewährleisten, wird bei 2.000 x g für 1 min bei 4 °C erneut zentrifugiert.
    14. Verwerfen Sie den verbleibenden Überstand. Ein Restüberstand könnte die Virusreinigung beeinträchtigen.
    15. Lösen Sie das Pellet durch Wirbeln und extrahieren Sie das Virus mit einem AAV-Reinigungskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Alternativ kann die Extraktion durch Iodixanol-Gradienten-Ultrazentrifugation30,31 durchgeführt werden.
    16. Das gereinigte Virus wird aliquot verabreicht und bei −80 °C gelagert. Titrieren Sie den AAV funktionell oder quantifizieren Sie den AAV-Titer mittels digitaler Tröpfchen-PCR (ddPCR)32, um die optimalen Transduktionsbedingungen zu bestimmen.
    17. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Herstellung des rAAV6 WT HDR-Plasmids.
  3. AAV-Titration mittels ddPCR
    1. Stellen Sie die Heizblöcke vor dem Start auf 65 °C und 98 °C ein.
    2. Extrahieren Sie virale DNA, indem Sie 15 μl DNA-Extraktionslösung zu 5 μl des Virus hinzufügen. Wirbel für 15 s.
    3. 6 min bei 65 °C inkubieren. Wirbel für 15 s. 2 min bei 98 °C inkubieren.
    4. Verwenden Sie die extrahierte DNA (die eine 1:4-Verdünnung der viralen DNA ist), um serielle Verdünnungen (1:400, 1:40.000, 1:160.000, 1:640.000) mit nukleasefreiem (nf)H2Ofür die ddPCR herzustellen.
      HINWEIS: Die Verdünnungen können bei −20 °C gelagert werden, wenn die ddPCR nicht sofort durchgeführt wird.
    5. Wählen Sie drei der Verdünnungen für die ddPCR aus. Die Wahl der zu verwendenden Verdünnung hängt von der Konzentration des Virus ab. Verwenden Sie vorzugsweise drei verschiedene Verdünnungen (z. B. 1:40.000, 1:160.000 und 1:640.000), um die beste Verdünnung zu finden, die innerhalb der Nachweisgrenze der Maschine liegt.
    6. Halten Sie die Reagenzien während der Arbeit auf Eis. Bereiten Sie einen Master-Mix vor (alle Proben werden in Duplikaten gemessen). Für jede Reaktion bereiten Sie Folgendes vor: 12,5 μL ddPCR Supermix für Sonden, keine dUTP, 1,25 μL PrimeTime Std qPCR Assay, AAV-ITR (siehe Materialtabelle) und 6,25 μL nf-H2O.
    7. Mischen Sie 5 μL DNA mit 20 μL der Mastermischung. Führen Sie dies für die Verdünnungen 1:40.000, 1:160.000 und 1:640.000 durch.
    8. Setzen Sie eine Patrone in den Patronenhalter ein. Geben Sie 70 μL Tröpfchenerzeugungsöl zu den Sonden in der Reihe, die als Öl bezeichnet wird. Achten Sie darauf, keine Blasen zu erzeugen.
    9. Fügen Sie 20 μL des Probenvolumens in die Zeile ein, die als Probe bezeichnet wird. Achten Sie darauf, keine Blasen zu erzeugen.
    10. Verschließen Sie die Patrone mit der Dichtung und legen Sie sie in den Tröpfchengenerator. Erzeugen Sie die Tröpfchen durch Drücken des Startknopfes an der Maschine, entfernen Sie die Dichtung und übertragen Sie vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette 40 μL der erzeugten Tröpfchen in eine 96-Well-Platte. Arbeiten Sie langsam, um die Zerstörung der Tröpfchen und Luftblasen zu vermeiden.
    11. Versiegeln Sie die 96-Well-Platte mit Pierce-Folie (der rote Streifen zeigt nach oben) mit dem PCR-Plattenversiegelungsgerät. Legen Sie die Platte in einen Thermocycler.
    12. Stellen Sie das Volumen auf 40 μL, die Deckeltemperatur auf 105 °C und die Rampenraten auf 2 °C/s ein. Führen Sie das PCR-Programm wie in Tabelle 2 beschrieben aus.
    13. Schalten Sie den Tröpfchenleser 30 Minuten vor Gebrauch ein. Öffnen Sie die Software auf dem Desktop.
    14. Geben Sie das Plattenlayout ein und wählen Sie ABS in der Registerkarte Experiment und ddPCR Supermix in der Registerkarte Supermix. Drücken Sie dann zuerst PRIME, gefolgt von FLUSH SYSTEM in der Software, um das System zu starten.
    15. Geben Sie die Platte in das Lesegerät ein. Starten Sie den Lauf und exportieren Sie die Daten als CSV-Datei für die anschließende Analyse als Tabelle.
      HINWEIS: Bei den von der Software generierten Zahlen handelt es sich um Genomkopien (GC) pro μL. Diese müssen mit den Verdünnungsfaktoren multipliziert werden: GC/μL x 5 (Verdünnung der DNA im Mastermix) x Anfangsverdünnung (d.h. 40.000 oder 160.000).

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Abbildung 3: Schematische Übersicht über das intronische und exonische Targeting während des CRISPR/Cas9 HDR-Knock-ins. Schematischer Vergleich zwischen intronischen und exonischen Targeting-Strategien für CRISPR/Cas9 HDR Knock-in. (A) Während des intronischen Targetings wird ein doppelsträngiger Bruch in ein Intron der DNA eingeführt. Die HDR-Vorlage besteht aus einer LHA, einer cDNA-Sequenz und einer RHA. Das intronische Targeting erfordert zusätzlich das Vorhandensein eines Schichtakzeptors, der die 3'-Spleißstelle, den Zweigpunkt und den Polypyrimidintrakt enthält. Dies ermöglicht ein korrektes Spleißen. Das grün gepunktete Feld stellt den Bereich dar, der der SA-Sequenz entspricht. Die Größe der SA beträgt 150 bp. (B) Das Exonic-Targeting beruht auf der Erzeugung eines doppelsträngigen Bruchs direkt im Exon. Die HDR-Vorlage besteht aus einer LHA, einer cDNA-Sequenz und einer RHA. Die orange gepunkteten Kästchen zeigen die Regionen an, die dem LHA und dem RHA entsprechen. Die ideale Größe der HAs beträgt jeweils 400 bp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Promotoren
NameLängeBeschreibung
SFFV492 bpMilzfokusbildender Viruspromotor. Starker Säugetier-Promotor. Konstitutiv ausgedrückt
UBC400 BasispunktePromotor abgeleitet vom menschlichen Ubiquitin-C-Gen. Konstitutiv ausgedrückt.
CMV508 BasispunktePromotor aus dem Cytomegalovirus. Es kann eine Enhancer-Region enthalten. Konstitutiv ausgedrückt. Starker Säugetier-Promotor. Kann zum Schweigen gebracht werden.
EF-1a1182 bpHumaner eukaryotischer Translationsverlängerungsfaktor 1 alpha-Promotor. Konstitutiv ausgedrückt. Starker Säugetier-Promotor.
EFS200-300 BasispunkteEF-1 alpha intron-lose Kurzform
CAG584 bpHybrid-Säugetierpromotor, der den CMV-Frühverstärker (C), den Hühner-Beta-Aktin-Promotor (A) und den Spleißakzeptor für das Kaninchen-Beta-Globin-Gen (G) enthält. Konstitutiv ausgedrückt.
Polyadenylierung (PolyA) Signale
AbkürzungLängeBeschreibung
SV40 PolyA82-122 bpAffenvirus 40 Polyadenylierungssignal
bGH PolyA224 bpPolyadenylierungssignal des Rinderwachstumshormons
rbGlob PolyA56 BasispunkteKaninchen-Beta-Globin-Polyadenylierungssignal

Tabelle 1: Promotoren und Polyadenylierungssignale.

SchrittTemperaturZeitZyklen
Enzymaktivierung95°C10 Minuten1x
Denaturierung94°C30 Sekunden42x
Glühen60°C1 Minute
Erweiterung72°C30 Sekunden
Enzym-Deaktivierung98°C10 Minuten1x
Halten4°C∞

Tabelle 2: Digitales Tröpfchen-PCR-Programm.

3. Bearbeitung von HSPCs

  1. Transfektion und Transduktion von HSPCs
    1. CD34+ HSPCs auftauen und die Zellen in 10 mL vorgewärmtes RPMI mit 1% P/S überführen. Zentrifuge bei 350 x g bei RT für 10 min.
    2. Die Zellen werden in HSPC-Retentionsmedium auf eine Konzentration von 2,5 x 10 5 Zellen/ml suspendiert und bei 37 °C/5 % CO2 für 48 h -72 h inkubiert.
    3. Ernten Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen. Zählen Sie die Zellen und überprüfen Sie die Zelllebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss. Zwischen 2 x 10 5 und5 x 106 Zellen können in einer einzigen Küvette nukleofektiert werden. Bereiten Sie die entsprechende Anzahl von Küvetten in Abhängigkeit von Ihrer berechneten Zellzahl vor.
    4. Bereiten Sie den RNP-Komplex vor. In einem 1,5-ml-Röhrchen 15 μg Cas9 und 8 μg sgRNA (molares Verhältnis 1:2,5) zugeben und bei 25 °C für 10 min in einem Heizblock inkubieren.
    5. Während der RNP-Komplex inkubiert, zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 x g für 5 min und verwerfen Sie den Überstand.
    6. Suspendieren Sie die Zellen in 100 μL Nukleofektionslösung. Mischen Sie die Zellen mit dem RNP-Komplex und übertragen Sie sie in die Küvette.
    7. Klopfen Sie vorsichtig auf die Küvette, um Restluftblasen zu entfernen, die sich während des Transfers gebildet haben könnten.
    8. Führen Sie die Küvette in die Halterung des Transfektionssystems ein und elektroporieren Sie die Zellen, wie zuvor im Abschnitt sgRNA-Design beschrieben.
    9. Unmittelbar nach der Elektroporation werden 400 μL vorgewärmtes HSPC-Retentionsmedium ohne P/S zugegeben und die Zellen mit einer feinen Transferpipette in eine Gewebekulturplatte mit 500 μL vorgewärmtem HSPC-Retentionsmedium ohne P/S überführt. Je nach Zellzahl wird eine geeignete Kulturplatte (24-, 12- oder 6-Well-Platte) verwendet, um eine Dichte zwischen 0,25 x 10 6 und 1 x 106 Zellen/ml zu erreichen. Überführen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 °C/5 %CO2.
    10. Tauen Sie die Fläschchen mit den gefrorenen rAAVs auf Eis auf. Transduzieren Sie die Zellen, indem Sie die optimale Menge jedes rAAV6 in die Zellsuspension pipettieren. Führen Sie die Transduktion innerhalb von 20-30 Minuten nach der Elektroporation durch, um eine hohe Transduktionseffizienz zu erzielen.
      HINWEIS: Die optimale Konzentration jedes Virus (ein Virus für die WT HDR-Vorlage und ein weiterer separater Virus für die mutierte HDR-Vorlage) sollte experimentell bestimmt werden. In der Regel führen 5.000-10.000 GC / Zelle (z. B. 5 x 109 GC für 1 x 106 Zellen) zu einer hohen Transduktion.
    11. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit der Pipette. Die transduzierten Zellen werden für 6-8 h bei 37 °C/5%CO2 inkubiert. Nach 6-8 h werden die Zellen in einem Röhrchen gesammelt und bei 350 x g RT für 5 min zentrifugiert.
    12. Entsorgen Sie das alte Medium und ersetzen Sie es durch ein frisches, vorgewärmtes HSPC-Retentionsmedium, das mit P / S ergänzt wird.
    13. Die Zellen werden in einer Konzentration zwischen 2,5 x 10 5-5 x 105 Zellen/ml suspendiert und auf eine gewebebehandelte Zellkulturplatte (24-, 12- oder 6-Well-Platte) übertragen. Inkubieren Sie die Zellen für 48 h bei 37 °C/5% CO2, bevor Sie mit der Sortierung fortfahren.
  2. Fließsortierung der technisch hergestellten HSPCs mit heterozygoter GOF-Mutation
    1. Die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen ernten und bei 350 x g bei RT für 5 min zentrifugieren. Der Überstand wird entfernt, die Zellen in 1 ml DPBS mit 0,1 % BSA suspendiert und erneut bei 350 x g RT für 5 min zentrifugiert.
    2. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen von DPBS + 0,1% BSA, abhängig von der Zellzahl.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Zellen bei einem Mindestvolumen von 200 μL und nicht mehr als 1 x 107 Zellen/ml zu suspendieren, um das Risiko einer Verstopfung des Sortierers zu verringern.
    3. Übertragen Sie die Zellen in ein steriles FACS-Röhrchen, das mit einer Kappe ausgestattet ist. Fügen Sie der Zellsuspension 7-AAD oder einen anderen Lebensfähigkeitsfarbstoff (abhängig von ihrer Kompatibilität mit den fluoreszierenden Proteinen) hinzu, um lebende/tote Zellen auszuschließen.
    4. Sortieren Sie die lebenden Zellen, die doppelt positiv für die fluoreszierenden Reporterproteine sind, in ein Sammelröhrchen mit 200 μL HSPC-Retentionsmedium.
      HINWEIS: Geeignete Kontrollen, die aus Zellen bestehen, die nur mit AAVs übertragen wurden, sollten hinzugefügt werden, um eine ordnungsgemäße Ansteuerung während des Sortiervorgangs zu gewährleisten.
    5. Zentrifugieren Sie die sortierten Zellen bei 350 x g bei RT für 5 min und suspendieren Sie die Zellen in HSPC-Retentionsmedium in einer Konzentration von 2,5 x 105 Zellen/ml zur weiteren Expansion in Kultur oder verwenden Sie die Zellen direkt für funktionelle Assays.

4. Bestätigung der erfolgreichen Gen-Editierung

  1. Genomische DNA-Extraktion
    1. Stellen Sie die Heizblöcke vor dem Start auf 65 °C und 98 °C ein. Ernten Sie 2 x 10 5 genomeditierte und sortierte gereinigte Zellen und zentrifugieren Sie bei 350 x g für5 min.
    2. Extrahieren Sie die gDNA wie zuvor beschrieben. Die DNA-Lösung wird entweder direkt für die PCR verwendet oder bei −20 °C gelagert.
  2. In-Out-PCR
    1. Entwerfen Sie zwei Primer, um die 5'-Insertionsstelle zu amplifizieren (Abbildung 4A): Primer forward 1 zielt auf den genomischen Locus außerhalb des linken Homologiearms; Primer Reverse 2 zielt auf die integrierte Sequenz ab.
    2. Für die In-out-PCR ist die folgende PCR-Mischung pro Reaktion herzustellen:
      10 μL PCR Master Mix (2x; siehe Materialtabelle)
      1 μL Primer forward 1 (10 μM Stamm)
      1 μL Primer Reverse 2 (10 μM Vorrat)
      0,5-1,0 μL extrahierte DNA
      NukleasefreiesH2Obis zu einem Endvolumen von 20 μL
      HINWEIS: Für mehr als eine Reaktion ist es ratsam, eine Mastermischung vorzubereiten, die eine zusätzliche Reaktion enthält, um Pipettierfehler zu berücksichtigen. Es ist wichtig, ein Nicht-Vorlagensteuerelement und eine Vorlagen-DNA aus einer simulierten behandelten Probe einzuschließen.
    3. Führen Sie die PCR-Reaktionen mit dem entsprechenden Temperaturwechselprogramm durch (siehe Herstelleranleitung).
      HINWEIS: Es ist ratsam, zunächst das Primerpaar auf die optimale Glühtemperatur zu testen. Dies kann durch die Berechnung des Tm und dann durch Ausführen der PCR mit einem Thermocycler erfolgen, der eine Gradiententemperatur durchführen kann.
    4. Lassen Sie die PCR-Produkte mit einer DNA-Leiter auf einem 1,5%igen Agarose-Gel bei 100 V für 45-60 min laufen (Abbildung 4B). Legen Sie das Gel auf ein blaues Licht oder einen UV-Transilluminator. Schneiden Sie die Banden aus dem Gel aus.
    5. Extrahieren Sie die DNA aus den Banden mit einem DNA-Gel-Extraktionskit. Senden Sie die extrahierten PCR-Proben mit geeigneten Primern für die Sanger-Sequenzierung, um die korrekte und nahtlose Integration der gewünschten cDNA am endogenen Genort zu bestätigen.

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Abbildung 4: Validierung der genomischen Integration mittels in-out PCR. (A) Schematische Darstellung der in-out PCR-Strategie. In der dargestellten Strategie wurden zwei Primer entworfen. Der Primer Forward 1 zielt auf den genomischen Locus außerhalb des LHA ab, und der Primer Reverse 2 zielt auf die Codon-optimierte Sequenz ab. (B) Schematische Darstellung einer Agarose-Gelelektrophorese. Nur erfolgreich editierte Zellen (RNP + AAV) erzeugen während der In-Out-PCR ein PCR-Produkt, während die uneditierten Proben (nur AAV) kein PCR-Produkt erzeugen. Abkürzung: NTC = non-template control. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durch die Anwendung des oben beschriebenen Protokolls wurden heterozygote Typ 1 CALR-Mutationen reproduzierbar in Nabelschnurblut-HSPCs eingeführt. Diese Mutation besteht aus einer 52 bp-Deletion im Exon 9 (dem letzten Exon von CALR), was zu einer +1-Frameverschiebung führt, die zur Translation einer neuen positiv geladenen C-terminalen Domäne26,33 führt. Um die CALR-Mutation am endogenen Genort einzuführen, wurde eine intronische Targeting-Strategie vor Exon 9 gewählt, da dies unerwünschte Veränderungen in der kodierenden Sequenz in Fällen umgehen würde, in denen das Cas9-induzierte DSB nicht über den HDR-Mechanismus repariert wurde. In diesem speziellen Fall wurde eine sgRNA für Intron 7 aufgrund der Verfügbarkeit von High-On-Target- und Low-Off-Target-Sequenzen in Kombination mit günstigen Homologiearmen (Mangel an Sequenzwiederholungen; Abbildung 5A).

Anschließend wurden zwei Spendervorlagen entworfen und in AAV6-Vektoren verpackt. Um ein korrektes Spleißen von den endogenen Exons zur integrierten cDNA zu ermöglichen, enthalten die Donor-Templates (i) eine SA-Sequenz einschließlich der 3'-Spleißstelle, des Zweigpunkts und des Polypyrimidintrakts, (ii) die Codon-optimierte cDNA-Sequenz der Exons 8-9, die entweder die WT (CALR WT) oder die mutierte Sequenz (CALRDEL) enthält. ) einschließlich eines Stopcodons, (iii) eines Affenvirus 40 (SV40)-PolyA-Signals, (iv) einer Sequenz, die für ein fluoreszierendes Protein unter der Kontrolle des separaten internen Promotors, des Milz-Fokus-bildenden Virus (SFFV)-Promotors, kodiert, gefolgt von (v) einem bovinen Wachstumshormon (bGH) polyA-Signal. Die Spenderschablone mit der CALR WT cDNA wurde entwickelt, um eine GFP-Kassette zu enthalten, während die Spenderschablone mit der CALRDEL cDNA-Sequenz eine BFP-Kassette enthalten sollte. Das gesamte Konstrukt wurde von einer linken und rechten HA flankiert (Abbildung 5A).

Zwei Tage nach der Transfektion mit dem RNP-Komplex und der Transduktion mit den rAAV6-Viren wurden die Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Vier Hauptpopulationen konnten nachgewiesen werden: (i) Zellen, die weder das GFP noch das BFP exprimieren, die Zellen ohne HDR-basierte Genombearbeitung repräsentieren, (ii) Zellen, die nur für GFP positiv sind, die diejenigen repräsentieren, die nur das WT-Konstrukt integriert hatten, (iii) Zellen, die nur für BFP positiv waren, die diejenigen repräsentieren, die nur das mutierte Konstrukt integriert hatten, und (iv) GFP und BFP doppelpositive Zellen, die Zellen darstellen, die sowohl die WT- als auch die mutierten Sequenzen integriert hatten (Abbildung 5B). Um reine Populationen von HSPCs mit der heterozygoten Typ 1 CALR-Mutation zu erhalten, wurden die doppelpositiven Zellen mittels Durchflusszytometrie sortiert. HSPCs, in denen zwei WT-Sequenzen eingeklopft wurden, wurden als Kontrollzellen verwendet (GFP+ mCherry+; Abbildung 5B). Eine gültige Alternative zur Verwendung als Kontrollzellen wären HSPCs mit einer biallelischen Integration der fluoreszierenden Proteine in einem Safe-Harbor-Locus (d.h. AAVS1; nicht gezeigt). Die Zellzählung durch Trypanblau-Ausschluss an den sortierten HSPCs zeigte, dass mehr als 90% der Zellen lebensfähig waren.

Die nahtlose On-Target-Integration der Konstrukte wurde durch die Anwendung der In-Out-PCR-Strategie bestätigt (Abbildung 6A). In diesem speziellen Fall führten wir zwei separate In-Out-PCRs durch, eine für die Knocked-in-CALR-WT-Sequenz (Spur 1 der Gelelektrophorese in Abbildung 6A) und eine für die Knocked-in-CALR-DEL-Sequenz (Spur 2 der Gelelektrophorese von Abbildung 6A). Die Sanger-Sequenzierung, die an der aus den Gelbanden extrahierten DNA durchgeführt wurde, bestätigte die korrekte Insertion der WT- und mutierten Sequenzen in die CALRDEL/WT HSPCs (Abbildung 6B).

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Abbildung 5: Erzeugung von HSPCs mit heterozygoter CALR-Mutation. (A) Repräsentatives Schema, das die Editierstrategie für die Insertion der heterozygoten CALR-Mutation darstellt. Der RNP-Komplex zielt auf das Intron zwischen Exon 7 und Exon 8 des CALR-Gens ab. Zwei AAVs, eines mit den mutierten Exons 8-9 und einem BFP und das andere mit den WT-Exons 8-9 und einem GFP, dienen als Spenderreparaturschablonen und fördern die Integration der mutierten Sequenz in ein Allel und die Integration der WT-Sequenz in das verbleibende Allel. (B) Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme, die die Expression von GFP und BFP oder GFP und mCherry 48 h nach der Transfektion und Transduktion von HSPCs darstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Validierung der erfolgreichen heterozygoten CALR-Mutation in HSPCs. (A) Gelelektrophorese aus den Produkten der In-Out-PCR, durchgeführt an genomischer DNA, die aus AAV-Kontrollen, CALR WT/WT und CALRDEL/WT extrahiert wurde. Es wurde eine 100 bp DNA-Leiter verwendet. Abkürzung: NTC = non-template control. (B) Sanger-Sequenzierungsergebnisse aus den In-Out-PCRs, die an CALRDEL/WT durchgeführt wurden, bestätigen die erfolgreiche Integration der WT und der mutierten Sequenzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die effiziente und präzise genetische Manipulation von humanen primären HSPCs stellt eine große Chance dar, die Prozesse zu erforschen und zu verstehen, die die normale Hämatopoese und vor allem die leukämische Transformation hämatopoetischer Zellen beeinflussen.

In diesem Protokoll wurde eine effiziente Strategie beschrieben, um menschliche HSPCs so zu manipulieren, dass sie rezidivierende heterozygote GOF-Mutationen exprimieren. Dieses Verfahren nutzte die CRISPR/Cas9-Technologie und rAAV6-Vektoren als Spender für DNA-Vorlagen, um WT- und mutierte DNA-Sequenzen präzise in ihre endogenen Genorte einzufügen. Die Kopplung der manipulierten cDNAs (WT und Mutanten) mit getrennten fluoreszierenden Reporterproteinen ermöglicht die Anreicherung und Verfolgung von Zellen mit einem definitiven heterozygoten Zustand.

Diese Strategie bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu den häufig verwendeten lentiviralen (LV)-basierten Methoden. Ein Hauptvorteil ist, dass das CRISPR/Cas9-basierte System eine präzise Editierung in den endogenen Loci ermöglicht, was zur Erhaltung der endogenen Promotoren und regulatorischen Elemente führt. Dies führt zu einer Homogenität in der Expression des editierten Gens in den Zellen, ein Ziel, das mit einer LV-basierten Methode kaum erreichbar ist. Der Gentransfer mit LV-Vektoren führt zu einer semi-zufälligen Integration des Gens mit Präferenz für transkriptionell aktive Stellen34. Dies kann zu einer Überexpression des übertragenen Gens und einer Heterogenität zwischen den editierten Zellen führen, was schließlich zu Schwierigkeiten führt, die Rolle von Mutationen und Geninteraktionen zu untersuchen und zu analysieren. Ein zweiter Vorteil besteht darin, dass das beschriebene System als ortsspezifisches Editiersystem die Risiken der insertionalen Mutageneseeliminiert 35.

Die duale Fluoreszenz-Reporter-Strategie ermöglicht die präzise Anreicherung und Verfolgung von Zellen, die erfolgreich auf beiden Allelen editiert wurden, wobei ein Allel die WT-cDNA und das andere Allel die mutierten cDNA-Sequenzen integriert. Zellen, die nur einen einzigen Reporter exprimieren, repräsentieren entweder nur die monoallelische Integration oder die biallelische Integration von HDR-Vorlagen mit demselben fluoreszierenden Reporter. Beide Szenarien können nur dann genau unterschieden werden, wenn Einzelzell-Klone hergestellt und einzeln analysiert werden. HSPCs haben jedoch in vitro nur eine begrenzte proliferative Kapazität, und wenn sie über einen längeren Zeitraum in Kultur gehalten werden, beginnen sich HSPCs in reifere Nachkommen zu differenzieren und verlieren ihre Selbsterneuerungs- und Transplantationsfähigkeit. Dies macht die Selektion und Erweiterung von Einzelzellklonen, die die gewünschte heterozygote Mutation beherbergen, unmöglich. Die Anwendung der dual-fluoreszierenden Proteinstrategie und die Anreicherung durch Durchflusszytometrie für Zellen, die die heterozygote Mutation tragen, ermöglicht es, die Probleme zu umgehen, die durch eine verlängerte In-vitro-Kultur hervorgerufen werden.

In diesem speziellen Beispiel wurde erfolgreich gezeigt, dass HSPCs effizient konstruiert und sortiert werden können, um reine Populationen von HSPCs zu erhalten, die die heterozygote CALRDEL / WT-Mutation tragen.

Dieses System ist jedoch nicht auf die Entwicklung heterozygoter Frameshift-Mutationen beschränkt, sondern kann auch leicht übernommen werden, um andere Mutationstypen zu erzeugen, einschließlich Missense- und Nonsense-Mutationen. Durch die Anwendung verschiedener Kombinationen von AAVs, die WT oder mutierte Sequenzen mit verschiedenen fluoreszierenden Reporterproteinen enthalten, kann dieses System auch für die Einführung homozygoter Mutationen (gleichzeitige Transduktion mit zwei rAAVs, die beide mutierte cDNA tragen, aber unterschiedliche fluoreszierende Reporter) oder sogar die Korrektur von Mutationen (gleichzeitige Transduktion mit zwei AAVs, die beide WT-cDNA tragen, aber unterschiedliche fluoreszierende Reporter) verwendet werden. Darüber hinaus ist es wichtig zu erwähnen, dass diese Strategie nicht auf die Einführung onkogener GOF-Mutationen beschränkt ist. Tatsächlich kann das beschriebene Protokoll für mehrere alternative Strategien verwendet werden, einschließlich Gen-Knock-out, Genersatz 36,37, gezieltes Knock-In von Transgenen (d.h. chimären Antigenrezeptoren)38 und sogar für die Korrektur krankheitsverursachender Mutationen 11,39.

Die Strategie, CRISPR / Cas9 und AAV6 mit mehreren fluoreszierenden Reportern zu kombinieren, hat sich auch in vielen anderen Zelltypen als anwendbar erwiesen, einschließlich T-Zellen, plasmazytoiden dendritischen Zellen, induzierten pluripotenten Stammzellen, neuronalen Stammzellen und Atemwegsstammzellen 24,38,40,41,42,43,44 . Diese Strategie kann für die Produktion von T-Zellen mit überlegenen chimären Antigenrezeptoren (CAR) implementiert werden. Zum Beispiel wurde kürzlich veröffentlicht, dass CRISPR/Cas9-vermittelter Knock-out des TGFBR2-Gens in CAR-T-Zellen deren Funktion in der suppressiven TGF-β-reichen Tumormikroumgebungstark erhöht 45. Ein solcher Ansatz könnte ein einstufiges Protokoll liefern, um sowohl die T-Zellen so zu konstruieren, dass sie die CAR exprimieren, als auch das TGFBR2-Gen auszuschalten, indem das CAR spezifisch in beide Allele des TGFBR2-Gens eingefügt wird. Darüber hinaus könnte dieser Ansatz auch nützlich sein, um universelle CAR-T-Zellen zu erzeugen, indem die CAR in das T-Zell-Rezeptor-Alpha-Konstanten-Gen (TRAC)46,47 integriert wird.

Um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen und eine effiziente Bearbeitung der Zellen zu gewährleisten, müssen einige wichtige Überlegungen beachtet werden. Die wichtigsten kritischen Punkte für eine erfolgreiche Bearbeitung der Zellen liegen in (i) der Auswahl der sgRNA, (ii) dem Design des HDR-Templates und (iii) der rAAV6-Produktion.

Die Auswahl einer leistungsfähigen sgRNA ist entscheidend, da sie die maximale Anzahl von Allelen bestimmt, in die das HDR-Template integriert werden kann. Durch zahlreiche Software, die nun verfügbar ist, wurde die Suche nach Kandidaten-sgRNAs vereinfacht. Durch die Auswahl der interessierenden Region kann die Software eine Reihe von sgRNAs mit einem On-Target-Score und einem Off-Target-Score vorschlagen, die die Chancen für die Bearbeitung am gewünschten Locus bzw. an unerwünschten Loci anzeigen. Diese Werte werden auf der Grundlage der zuvor veröffentlichten Scoring-Modelle48,49 berechnet. Obwohl dies ein guter Ausgangspunkt für die Auswahl einer leistungsfähigen sgRNA ist, muss die Leistung der sgRNA bestätigt werden, da ihre vorhergesagte Leistung in silico nicht immer einer effizienten sgRNA in vitro entspricht. Daher wird dringend empfohlen, mindestens drei sgRNAs zu entwerfen und zu testen, um die Chancen zu erhöhen, die beste sgRNA zu finden. Sobald eine wirklich leistungsfähige sgRNA identifiziert wurde, wird empfohlen, mit dem Design der HDR-Vorlage fortzufahren.

Bei der Gestaltung der HDR-Vorlage sollten Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden. Der linke und der rechte Homologiearm (LHA bzw. RHA) sollten sich jeweils über 400 bp stromaufwärts bzw. stromabwärts der sgRNA-Schnittstelle erstrecken, da kürzere HAs zu reduzierten HDR-Frequenzen führen können. Die Größe der cDNA, die über HDR eingeführt werden kann, hängt von den Verpackungsfähigkeiten von AAVs ab, die etwa 4,7 kb beträgt. Aufgrund der zahlreichen Elemente, die innerhalb des HDR-Templates obligatorisch sind (LHA, RHA, SA, PolyA, Promotor und Fluoreszenz-Reporter-Sequenz), ist der verbleibende Platz für die mutierte oder WT-cDNA begrenzt. Dies ist unproblematisch, wenn sich die gewünschte Mutation in der Nähe des 3'-Endes eines Gens oder in Genen mit einem insgesamt kurzen CDS befindet. In Fällen, in denen sich die Mutation jedoch in der Nähe der transkriptionellen Startseite (TSS) der Gene mit einem langen CDS befindet (das den verbleibenden Packraum des AAV überschreitet), ist dieser beschriebene Ansatz möglicherweise nicht durchführbar. Um dieses Problem zu umgehen, wurde kürzlich von Bak und Kollegen eine Strategie entwickelt, die auf der Aufteilung der HDR-Vorlage in zwei AAVs beruht. Diese Strategie beruht auf zwei separaten HDR-vermittelten Integrationen, um die endgültige nahtlose Integration eines großen Gens50 zu erhalten.

Die Qualität des Virus und sein Titer sind weitere Faktoren, die über das erfolgreiche Genom-Engineering der Zellen entscheiden können. Für einen optimalen Ertrag ist es wichtig, den HEK293T nicht vollständig konfluieren zu lassen, während er in Kultur gehalten wird. Idealerweise sollten die HEK293T-Zellen gespalten werden, wenn 70%-80% Konfluenz erreicht ist. Darüber hinaus sollte das HEK293T nicht über einen längeren Zeitraum kultiviert werden, da dies seine Fähigkeit, Viren zu produzieren, verringern kann. Neue HEK293T-Zellen müssen nach 20 Durchgängen aufgetaut werden. Die Gewinnung hoher Virustiter ist wichtig, um die Effizienz und Reproduzierbarkeit der Experimente zu erhöhen. Niedrige virale Titer führen zu großen Mengen an rAAV-Lösung, die für die Transduktion der HSPCs erforderlich sind. In der Regel sollte die rAAV-Lösung, die den nukleofekten Zellen zugesetzt wird, 20 % des Gesamtvolumens des HSPC-Retentionsmediums nicht überschreiten. Höhere Volumina der AAV-Lösung können zu einem erhöhten Zelltod, einer geringeren Proliferation und einer beeinträchtigten Transduktionseffizienz führen. Bei niedrigen Virustitern empfiehlt es sich daher, das Virus weiter zu konzentrieren.

Zusammenfassend bietet dieses Protokoll einen reproduzierbaren Ansatz zur präzisen und effizienten Manipulation humaner HSPCs durch die gleichzeitige Verwendung von CRIPSR/Cas9- und rAAV6-Spendervorlagen mit zusätzlichen Dual-Fluoreszenzreportern. Dieser Ansatz hat sich als großartiges Werkzeug bei der Untersuchung der normalen hämatopoetischen Stammzellbiologie und der Beiträge von Mutationen zur Leukemogenese erwiesen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wird durch Zuschüsse des Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung (FWF; Nummern P32783 und I5021) an A.R. unterstützt. Zusätzliche Mittel für A.R. werden auch von der Österreichischen Gesellschaft für Innere Medizin (Joseph Skoda Fellowship), der Österreichischen Gesellschaft für Hämatologie und Onkologie (OeGHO; Clinical Research Grant) und MEFOgraz. T.K. ist Special Fellow der Leukemia & Lymphoma Society.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
175 cm2 Zellkulturflasche, Entlüftungskappe, TC-behandeltCorning431080
150 mm x 25 mm SchüsselnCorning430599
293TDSMZACC 635https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635
4D Nucleofector Core UnitLonza-Fürdie Nukleofektion von humanen HSPCs verwenden Sie das DZ-100 Programm.
4D Nucleofector X UnitLonza-500
ml ZentrifugenröhrchenCorning431123
7-AADBD Biosciences559925
AAVpro AufreinigungskitTakara6666
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3Integrated DNA Technologies (IDT)1081058
Avanti JXN-30 UltrazentrifugeBeckman Coulter-Benchling
sgRNA-Design-ToolOnline-Tool für das sgRNA-Design: http://www.benchling.com/crispr
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad-Chemisch
modifizierte synthetische sgRNASynthegoWebsite: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequenz für die sgRNA, die auf Intron 7 von CALR abzielt: 5'-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3'                 Ein SpCas9-Gerüst mit 80 Nukleotiden wird der 20-Nukleotid-RNA-Sequenz hinzugefügt, um die sgRNA zu vervollständigen. Chemische Modifikationen von 2'-O-Methyl werden zu den ersten und letzten 3 Basen hinzugefügt, und 3' Phosphorthioatbindungen werden zu den ersten 3 und letzten 2 Basen hinzugefügt.       *Alternativ können chemisch modifizierte synthetische sgRNAs aus dem IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) und Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)
CHOPCHOP sgRNA-DesigntoolOnline-Tool für das sgRNA-Design: http://chopchop.cbu.uib.no
Costar 24-Well-Clear-TC-behandelte Mehrfach-Well-PlattenCorning3526
CRISPick sgRNA-DesigntoolOnline-Tool für das sgRNA-Design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
CRISPOR sgRNA-Design-ToolOnline-Tool für das sgRNA-Design: http://crispor.tefor.net
ddPCR 96-Well-PlattenBio-Rad12001925
ddPCR Supermix für Sonden (kein dUTP)Bio-Rad1863024
DG8 Kartuschen für QX200/QX100 Tröpfchengenerator Bio-Rad1864008
DG8 Dichtungen für QX200/QX100 Tröpfchengenerator Bio-Rad1863009
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)Thermo ScientificK1081
Tröpfchen-Erzeugungsöl für SondenBio-Rad1863005
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohemGlukosegehalt Sigma-AldrichD6429-6X500ML
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
FACSAria FusionBD Biosciences-Falcon
5 mL Corning352054
Fötales Rinderserum (FBS) Good Forte (hitzeinaktiviert), 500 mlPan BiotechP40-47500
FlowJo 10.8.0BD Biosciences -
GenAgarose L.E.Inno-trainGX04090
GeneRuler 100 bp Plus DNA LadderThermo ScientificSM0321
Gibson Assembly Master MixNew England Biolabs Inc. (NEB)E2611L
HEK293T HEPES-Lösung
Sigma-AldrichH0887-100ML
ICESynthegohttps://ice.synthego.com
IDT-Codon-OptimierungstoolIDThttps://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool
IDT sgRNA-Design-ToolOnline-Tool für das sgRNA-Design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM
LB-Bouillon (Lennox) EZMix-Pulver mikrobielles WachstumsmediumSigma-AldrichL7658-1KG
LB-Bouillon mit Agar (Lennox) EZMix-Pulver mikrobielles WachstumsmediumSigma-AldrichL7533-1KG
Midori Green AdvanceNippon GeneticsMG04
Monarch Plasmid Miniprep KitNEBT1010L
Monarch DNA Gel Extraction KitNEBT1020L
NEB 5-alpha Kompetente E. coli (hohe Effizienz)NEBC2987U
Nukleasefreies Wasser, 5X100 mlAmbionAM9939
NucleoBond Xtra MidiMacherey-Nagel740410
Opti-MEM, reduziertes Serummedium, 500 mlGibco31985070
P3 Primärzelle 4D-Nukleofetor  X Kit LLonzaV4XP-3024Die Lonza Primary P3 Lösung wird als 2,25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution und 0,5 mL Supplement 1 geliefert. Zur Rekonstitution das Supplement 1 zur P3 Primary Cell Nucleofector Solution geben und mischen.
pAAV-MCS2Addgene46954
PCR-Platten-Heißsiegelfolie, durchstechbarBio-Rad1814040
pDGM6Addgene110660
Penicillin-Streptomycin (P/S)Gibco15140122
Polyethylenimin (PEI)Polywissenschaften23966Geben Sie 50 ml PBS 4,5 pH (hergestellt mit HCl) zu 50 mg PEI in einem Röhrchen. Lösen Sie auf, indem Sie das Rohr in ein 70°; C Wasserbad und Vortexen alle 10 Minuten, bis sich die Lösung aufgelöst hat. Nachdem die Lösung RT erreicht hat, filtrieren Sie durch einen 0,22 μm; M Filter, Fabrikat 1120 μ L aliquotiert und bei -80°C lagern.
Polystyrol-Reagenzglas, mit Schnappkappen-Primern
 Eurofins-Primerwurden bei Eurofins (eurofinsgenomics.eu) als unmodifizierte salzfreie kundenspezifische Oligos bestellt. Die Primer wurden mit PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) konstruiert                                                                                                        Grundierung 1 Vorderrad:      AAGTGATCCGTTCGCCATGAC;                               Primer 2 Rev CALR WT spezifisch: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC;                                         Primer 2 Rev CALR DEL spezifisch: CCAACCCTGGAGACACGCTTC
PrimeTime qPCR Primer AssayIDT-PrimeTimeqPCR Probe Assays (1 Sonde/2 Primer)   die bei IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry) bestellt werden können. Skala: Std - qPCR Assay 500 Reaktionen; Grundierung 1 Stürmer (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Grundierung 2 Rückwärts (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Sonde (5'-3'): CACTCCCTCTGCGCGCGCTCG; 5' Färbe/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Verhältnis von Primer zu Sonde: 3,6
PX1 PCR-PlattenversiegelungBio-Rad1814000
QuantaSoft SoftwareBio-Rad
Quick Extract DNA-ExtraktionslösungLucigenQE0905T
QX200 Tröpfchengenerator Bio-Rad1864002
QX200 Droplet ReaderBio-Rad
Rekombinanter humaner Flt3-LigandPeprotech300-19
Rekombinanter humaner IL-6Peprotech200-06
Rekombinanter humaner SCFPeprotech300-07
rekombinanter humaner TPOPeprotech300-18
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758-6X500ML
SnapGeneDotmaticsMolekulare Klonierungssoftware https://www.snapgene.com *Alternativ können auch Benchling (https://www.benchling.com) und Geneious (https://www.geneious.com) verwendet werden.
Soc-AuswuchsmediumNEBB9020S
NatriumbutyratSigma-AldrichB5887-1G
Stamm Regenin 1 (SR1)Biogems1224999
StemSpan SFEM IISTEMCELL Technologies9655
TAE Puffer (Tris-Acetat-EDTA) 50XThermo ScientificB49
TIDEhttp://shinyapps.datacurators.nl/tide/
Trypanblau 0,4%Sigma-AldrichT8154-100ML
TrypLE (mit Phenolrot), 500 mlThermo Scientific16605-028
UltraPure 0,5: EDTA, pH 8,0, 100 mlThermo Scientific15575-038
UM171STEMCELL Technologies72914
Vector Builder Codon-OptimierungstoolVector Builderhttps://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html
erworben werden

References

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