Dieser Artikel beschreibt die diagnostischen Methoden der angeborenen Herzfehler (KHK) der Maus unter Verwendung der fetalen Echokardiographie, der Nekropsie und der episkopischen Fluoreszenzbilderfassung (EFIC) unter Verwendung der episkopischen konfokalen Mikroskopie (ECM), gefolgt von einer dreidimensionalen (3D) Rekonstruktion.
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Methodenartikel
Eine Pipeline zur Charakterisierung struktureller Herzfehler in der fetalen Maus
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Angeborene Herzfehler (KHK) sind die Hauptursachen für den Tod von Säuglingen in den Vereinigten Staaten. In den 1980er Jahren und früher starben die meisten Patienten mit mittelschwerer oder schwerer KHK vor dem Erwachsenenalter, wobei die maximale Mortalität in der ersten Lebenswoche lag. Bemerkenswerte Fortschritte bei chirurgischen Techniken, diagnostischen Ansätzen und medizinischem Management haben zu deutlichen Verbesserungen der Ergebnisse geführt. Um den kritischen Forschungsbedarf des Verständnisses von angeborenen Herzfehlern zu decken, haben Mausmodelle eine ideale Forschungsplattform geschaffen, da sie eine sehr ähnliche Herzanatomie wie der Mensch und kurze Schwangerschaftsraten aufweisen. Die Kombination von Gentechnik mit Hochdurchsatz-Phänotypisierungswerkzeugen hat die Replikation und Diagnose von strukturellen Herzfehlern ermöglicht, um die molekularen Signalwege hinter KHK weiter aufzuklären. Der Einsatz der nicht-invasiven fetalen Echokardiographie zum Screening der kardialen Phänotypen in Mausmodellen in Verbindung mit der hohen Genauigkeit der episkopischen Fluoreszenzbilderfassung (EFIC) mittels episkopischer konfokaler Mikroskopie (ECM) Histopathologie mit dreidimensionalen (3D) Rekonstruktionen ermöglicht einen detaillierten Einblick in die Anatomie verschiedener angeborener Herzfehler. Dieses Protokoll beschreibt einen vollständigen Arbeitsablauf dieser Methoden, um eine genaue Diagnose von angeborenen Herzfehlern der Maus zu erhalten. Die Anwendung dieses Phänotypisierungsprotokolls auf Modellorganismen ermöglicht eine genaue KHK-Diagnose und liefert Einblicke in die Mechanismen der KHK. Die Identifizierung der zugrunde liegenden Mechanismen der KHK bietet Möglichkeiten für mögliche Therapien und Interventionen.
Einleitung
Angeborene Herzfehler (KHK) sind die häufigsten neonatalen Geburtsfehler 1,2, von denen etwa 0,8 % bis 1,7 % der Neugeborenen betroffen sind und die zu einer signifikanten Mortalität und Morbidität bei Neugeborenen führen3. Eine genetische Ätiologie ist bei KHK 4,5 stark indiziert. Genetisch veränderte Mausmodelle wurden in großem Umfang verwendet, um die Komplexität von KHK und die Mechanismen zu verstehen, die sie verursachen, da die Mäuse Vierkammerherzen und vergleichbare kardiale Entwicklungs-DNA-Sequenzen bei Maus- und men....
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Protokoll
Die Verwendung von Mäusen für diese Studien ist notwendig, da Mäuse vierkammerige Herzen haben, die menschliche KHK nachahmen können. Mäuse wurden tierärztlich versorgt und in der von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditierten Tierpflegeeinrichtung der Institution untergebracht. Strenge Protokolle wurden befolgt, um die Beschwerden, den Stress, die Schmerzen und die Verletzungen der Mäuse zu minimieren. Mäuse wurden mit CO2 -Gas eingeschläfert, was für kleine Nagetiere nach den Richtlinien der American Veterinary Medical Association zur Sterbehilfe akzeptabel ist. Die Studien an Mäusen in diesem Manusk....
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Ergebnisse
Die Mausembryonen mit signifikanten hämodynamischen Defekten erwiesen sich als embryonal tödlich. Eine Vielzahl von KHK kann durch das nichtinvasive fetale Echokardiogramm mit hoher Leistung unter Verwendung verschiedener Ansichten identifiziert werden (Abbildung 1).
Septumdefekte: Die häufigsten KHK sind Septumdefekte wie ein Ventrikelseptumdefekt (VSD), ein atrioventrikulärer Septumdefekt (AVSD) und ein Vorhofseptumdefekt (ASD).......
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Diskussion
Genetisch veränderte Mäuse wurden verwendet, um die Pathomechanismen von angeborenen Herzfehlern zu verstehen. Die Protokolle, die wir in dieser Studie zur Verfügung stellen, versuchen, den Prozess der Beurteilung von fetalen Herzfehlern der Maus zu rationalisieren und zu standardisieren. Es gibt jedoch kritische Schritte, die während des Protokolls zu beachten sind. Mausembryonen wachsen an jedem Tag der Schwangerschaft signifikant, und der richtige Zeitpunkt für die Ernte einer Maus kann durch ein fetales Echokardiogra.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass in diesem Manuskript keine Interessenkonflikte bestehen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1,5 mL Eppendorf Röhrchen (oder bevorzugtes Fläschchen für die Gewebeaufbewahrung) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% gepufferte Formalinphosphatlösung | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% Paraformaldehyd (PFA) Fixiermittel | ThermoScientific | 28908 | 4 % Arbeitskonzentration frisch zubereitet in 1x PBS bei 4 & Grad; C |
| 50 mL Röhrchen | Falcon | 352070 | |
| 6– 12-Well-Platte oder 20-ml-Fläschchen zur Lagerung von Embryonen | Falcon | 353046 | |
| Präpariermikroskop | Leica | MDG36 | |
| Präpariernadeln (Klasse A1 oder A2) | F.S.T | 26002-15 | |
| Präparierplatte | F.S.T | FB0875713 | Petrischale mit Paraffinbasis |
| Einbettformen | Sakura | 4133 | |
| Extra schmale Schere (10,5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1– 2 Paar |
| Fidschi Anwendung/Bild J | NIH | Fiji.sc | |
| Feine Spitze (0,05 mm x 0,01 mm) Präparierzange (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Paar |
| Heißzange | F.S.T | 11252-00 | Zur Orientierung von Embryonen Industrieller |
| Marker für Wachsblöcke | Sharpie | 2003898 | Formatiert für den Laborgebrauch |
| Jenoptik ProgRes C14plus Mikroskopkamera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro Erfassungssoftware | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Großglasbecher | Fisher Scientific | S111053 | Zum Schmelzen von Paraffin |
| Leica M165 FC Binokularmikroskop (16,5:1 Zoomoptik) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast Einbettung Paraffinwachs | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Kleiner Glasbecher | Fisher Scientific | S111045 | |
| Kleiner, perforierter Löffel (14,5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Gerade Vannas Schere (4– 8 mm) | F.S.T | 15018-10 | Ein Paar |
| Vevo2100 Ultrahochfrequenz-Ultraschall-Biomikroskop | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylol | Fischer Chemikalie | UN1307 |
Referenzen
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593(2020).
- vander Linde, D., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
